一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法与流程

技术特征：
1.一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采集皮肤样品：无菌操作取细毛羊耳部皮肤0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样品，将样品用碘酒消毒，浓度为75％酒精消毒2次，再用生理盐水反复清洗，然后用含有青霉素-链霉素的D-Hank’s平衡盐溶液快速冲洗3～5次，迅速将样品放入无血清的DMEM/F12培养液中，于冰盒内带回实验室，在12h内进行分离培养；(2)在玻璃培养皿中，将软骨与皮肤剥离，在体式显微镜下用解剖针固定皮肤，在不损伤毛囊的前提下将毛囊周围组织尽量剔除，将皮肤标品在无菌条件下用眼科剪剪成小条，加入2.4U/mL的I型胶原酶，4℃消化12h后，终止消化，用眼科镊夹住毛囊远端从脂肪端拉出，收集形态完好且处于生长期的毛囊，分别在皮脂腺的下方和竖毛肌的上方横切获得中间毛囊隆突区；(3)分离获得毛囊隆突区后，再置于0.25％胰酶中37℃消化30min，终止反应，1200r/min离心收集细胞后接种于100μg/mL的IV型胶原包被的培养皿中，30min后吸出上层未贴附的角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞；(4)在培养皿中加入3ml完全培养液，37℃，5％CO2浓度的饱和湿度条件下进行原代培养；所述完全培养液为：10ng/mlEGF、10ng/mlIGF-I、0.5μg/ml氢化可的松和10％FBS的DMEM/F12培养液；(5)当毛囊干细胞生长至会合状态后，进行传代培养，首先弃掉旧培养液，D-Hank’s液冲洗细胞一次，加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶浸润细胞数秒，弃去后，再加入3ml浓度为0.25％的胰蛋白酶，常温下消化处理5min，加入工作培养液，1000r/min下离心5min后收集细胞，分瓶后按每瓶5ml量加入维持培养液放回培养箱中继续培养，每3天更换工作培养液1次；待毛囊干细胞稳定生长至3-5代时，更换等量的维持培养液进行培养，以使毛囊干细胞在体外长期传代；所述工作培养液为：10ng/mlEGF、10ng/mlIGF-I、0.5μg/ml氢化可的松的K-SFM培养液；维持培养液为：10ng/LEGF、10ng/mlEGF、10ng/mlIGF-I、0.5μg/ml氢化可的松和2％FBS的DMEM/F12培养液；(6)选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含10％DMSO和30％FBS的DMEM/F12冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h，-20℃1h，-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×105个/ml的细胞密度接种于培养瓶。