一种β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的筛选方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种β-羟基羧酸酯氧化酶的高通量筛选方法。利用β-羟基羧酸酯的氧化产物（β-羰基羧酸酯类化合物）与金属离子的显色液反应，能够快速方便大量的筛选出能够生产β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的方法，该方法具有操作方便、快速、准确和通量高等特点。

背景技术：
光学纯β-羟基羧酸酯是一类重要的化合物，被广泛的应用于手性助剂和制药领域。单一构型的β-羟基羧酸酯除了可以通过酶法或者化学法直接合成得到外，化学合成β-羟基羧酸酯需要还原剂、金属催化剂、有机溶剂，而且副产物多，对环境的污染严重。而生物法合成β-羟基羧酸酯具有反应条件温和、选择性高、副反应少、产物比较单一、收率高、光化学纯度、无环境污染等特点。因为其具有独特的优越性，成为了近年来国内外研究的热点，其中利用氧化酶拆分外消旋手性醇从而获得单一光学纯手性醇也是近年来的研究热点。为了扩大外消旋β-羟基羧酸酯羟基氧化酶菌株，许多筛选方法应用于其高通量的筛选，TLC法简单快捷，但其通量较低。高效气相和高压液相检测方法，灵敏度高，但是设备费用昂贵，操作繁琐。综上所述，建立一种快速、准确、低成本和易操作的β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的筛选方法是很有必要的。本研究小组发现在室温下(25~35℃)条件下4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯等β-羰基羧酸酯可与金属离子显色剂发生显色反应，并在24孔板中建立了β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的高通量筛选方法。该方法具有快速、准确、易操作和通量高等特点。

技术实现要素：
本发明提供了一种β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的高通量筛选方法。其特征在于，利用外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的氧化产物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯与及其结构类似物β-羰基羧酸酯与金属离子溶液发生显色反应，于510nm条件下分析。该方法可以在24孔板中进行操作，可建立β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的高通量筛选方法。在24孔板中筛选显色方法操作步骤如下：（1）称取红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1(中国专利，申请号2011101713322，授权公告号CN102250802B)静息细胞（湿重）悬浮于磷酸缓冲溶液体系（pH7.0，100mmol/L），细胞终浓度为10%（质量浓度）；加入终浓度为100mmol/L的底物外消旋β-羟基羧酸酯混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化转化反应。（2）反应结束，利用等体积乙酸乙酯萃取萃取反应液。显色是在24孔板中进行的。萃取上清液：显色剂A（0.04~0.08mol/L）：显色剂B（0.1~0.3mol/L）的体积比为20:800:800(μL:μL:μL)，在20~35℃下显色反应15~30min后取200μL反应液至另一24孔板中，加入9倍体积的无水乙醇混合均匀，用紫外-可见分光光度计测其在510nm波长下进行分析。其中步骤（1）所述方法，显色剂A为FeCl3、FeCl2、Fe2(SO4)3、FeSO4、Fe(ClO4)3、CoCl2和ZnCl2中的一种；显色剂B为HCl、H2SO4和HClO4中的一种。本发明的有益效果：本发明的一种β-羟基羧酸酯羟基氧化酶的高通量筛选方法，具有操作方便、快速、准确和通量高等特点。附图说明图1红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1静息细胞氧化拆分外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯[图注：图中1-6为红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1静息细胞氧化拆分外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯0、1、2、4、6、8h的反应液的显色结果；图中1，-6，为灭活催化剂与外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯作用0、1、2、4、6、8h的显色结果（空白对照）]图2红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1生长细胞氧化拆分外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯[图注：图中1-6为红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1生长细胞氧化拆分外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯0、6、12、24、36、48h的测定结果；图中1’-6’为发酵液的显色结果（空白对照）]具体实施方式本发明所涉及的菌株Rhodococcussp.CCZU10-1，已申请专利，申请号2011101713322，授权公告号CN102250802B。菌株理化特征如专利(中国专利，申请号2011101713322)所描述。实施例1：FeCl3显色液分析称取红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1静息细胞（湿重）悬浮于2mL磷酸缓冲溶液体系（pH7.0，100mmol/L）形成10%（质量浓度）的细胞悬液，加入终浓度为100mmol/L的底物4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化转化反应6h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（FeCl3溶液；0.04mol/L）：显色剂B（HCl；0.1mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在20℃下振荡反应30min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值（标准曲线Y底物(mmol/L)=49.25×OD510；R2=0.9915）。经计算其产物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯的转化率为34.12%，取上清液利用气相色谱法测定其转化率为34.79%，两种测定方法结果基本一致，误差<5%。实施例2：Fe2(SO4)3显色液分析称取红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1静息细胞（湿重）悬浮于2mL磷酸缓冲溶液体系（pH7.0，100mmol/L）形成10%（质量浓度）的细胞悬液，加入终浓度为100mmol/L的底物4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化转化反应6h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（Fe2(SO4)3溶液；0.08mol/L）：显色剂B（H2SO4；0.3mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在35℃下振荡反应15min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值（标准曲线Y底物（mmol/L）=714.28×OD510；R2=0.9934）。经分析4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的转化率为34.45%，取上清液利用气相色谱法测定其转化率为34.93%，两种测定方法结果基本一致，误差<5%。实施例3：Fe(ClO4)3显色液分析称取0.1g红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1(CGMCCNo.4911)静息细胞（湿重）悬浮于2mL磷酸缓冲溶液体系（pH7.0，100mmol/L），加入终浓度为100mmol/L的底物4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化转化反应6h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（Fe(ClO4)3溶液；0.07mol/L）：显色剂B（HClO4；0.1mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在30℃下振荡反应20min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值（Y底物（mmol/L）=666.67×OD510；R2=0.9923）。经计算其产物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯的转化率为33.87%，取上清液利用气相色谱法测定其转化率为34.32%，两种测定方法结果基本一致，误差<5%。实施例4：比色法与气相色谱法分析产率比较红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1(CGMCCNo.4911)氧化不同的外消旋底物：利用磷酸缓冲溶液（pH7.0，100mmol/L）配制红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1(CGMCCNo.4911)静息细胞悬浮液（0.05g/mL）于24孔板中，分别加入外消旋的3-苯基-3-羟基丙酸乙酯和4-氯-3-羟基丁酸乙酯，使底物浓度为100mmol/L，混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化转化反应6h，反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（Fe(ClO4)3溶液；0.07mol/L）：显色剂B（HClO4；0.1mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在30℃下振荡反应30min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值，与气相色谱法对照。其结果如表1所示。实施例5：利用显色方法监测红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1静息细胞氧化拆分外消旋4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯反应进程利用磷酸缓冲溶液（pH7.0，100mmol/L）配制红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1(CGMCCNo.4911)静息细胞悬浮液（0.05g/mL）于24孔板中，加入终浓度为100mmol/L的底物外消旋4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯，混合均匀后在30℃、160r/min的条件下进行氧化反应。不同反应时间取反应液，并分别用等体积乙酸乙酯萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（Fe(ClO4)3溶液；0.07mol/L）：显色剂B（HClO4；0.3mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在30℃下振荡反应20min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值，其显色结果如图1所示。实施例6：利用显色方法检测红球菌Rhodococcussp.CCZU10-1生长细胞氧化拆分外消旋4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯反应进程在250mL摇瓶中加入50mL培养基（葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl1.5g/L，KH2PO42g/L，无水MgSO40.3g/L，4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯（100mmol/L），pH7.0），在35℃下160rpm摇床培养反应36h，不同反应时间取反应液，并分别用等体积乙酸乙酯萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A（Fe2(SO4)3；0.07mol/L）：显色剂B（H2SO4；0.1mol/L）=20:800:800(μL:μL:μL)，在30℃下振荡反应20min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510nm波长下的紫外吸收值，其显色结果如图2所示。附表表1比色法与气相色谱法分析产率比较