一株无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1及其应用的制作方法

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一株无毒蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

微生态制剂在医药保健、农业、食品加工、饲料工业和环境保护等多个领域拥有广泛的潜在应用，在蓬勃发展的生物产业中占有重要份额。安全、高效、稳定的菌株是整个微生态制剂的产业化过程的核心内容。

蜡样芽胞杆菌属需氧兼性厌氧的革兰阳性杆菌，芽孢呈椭圆形且能耐高温。可用于治疗腹泻，主要机制是：1) 活菌制剂进入肠道后，形成优势菌群，与有害菌争夺营养物质和附着位点，竞争性的抑制有害菌的生长，从而调节胃肠道微生物区系平衡；2) 通过微生物代谢产生有机酸，降低肠道内的pH值，杀灭不耐酸的有害菌；3) 产生多种功能性代谢物，有利于养分分解、抑制肠内氨等有害物质产生、杀灭潜在的病原菌；4) 直接刺激肠道免疫细胞而增加局部免疫抗体，增强机体抗病力。同时，以蜡样芽孢杆菌作为主要益生菌的微生态制剂在进入人体或动物体内，可以分泌大量蛋白酶、淀粉酶及其他代谢产物，促进肠道内容物的消化、吸收。这不仅有助于治疗人类的消化不良等疾病，还可促进动物的饲料转化率，提高料肉比，降低排泄物中的营养物质含量，缩短饲养周期，增加养殖者的收益。

在作为生物农药使用时，蜡样芽孢杆菌可以产生多种具有杀虫活性的代谢产物，如具有广谱、高效杀虫活性的营养期杀虫蛋白（vegetative insectcidal proteins, VIPs）。该类蛋白质可作用于鳞翅目多种昆虫中肠上皮细胞形成离子通道，杀虫活性达纳克级。此外，很多蜡样芽孢杆菌是多种植物的内生菌，能在其活体内定植形成共生关系，而不对寄主植物产生任何危害，促进植物生长、减少病害虫害，提高植物抵御不良环境的能力并减少化肥使用量。除了抑菌和促进植物生长外，部分蜡样芽孢杆菌还具有抑菌杀虫实现对多种谷类、蔬菜和水果的保护作用。

此外，蜡样芽孢杆菌还可以用于治理水污染形式的“富营养化”，其兼性厌氧特性和高效的氮、磷转化能力，可以迅速降低水体中氧气以及氮、磷含量，减少藻类及其他浮游生物的繁殖，从而达到净化水体和保护环境的目的。

虽然目前蜡样芽胞杆菌具有上述价值，但由于多种原因，面前市场上销售的蜡样芽胞杆菌微生态制剂至少表达一种以上的细菌毒素，对人类健康和公共卫生构成极大的危害。目前4种公认的蜡样芽胞杆菌毒素包括呕吐毒素（cereulide），溶血素BL（haemolysin BL, Hbl）,非溶血性肠毒素（nonhaemolytic enterotoxin, Nhe）和细胞毒素K（cytotoxin K, CytK）。这些毒素可引起食物中毒，产生腹泻、呕吐、休克、严重的甚至致死等症状。因此，筛选出安全有效的蜡样芽胞杆菌至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于为筛选出安全有效的蜡样芽胞杆菌，本发明从基因、蛋白质和细胞水平上筛选出一株候选菌株 pBC-1不表达任何已知的细菌毒素，也不会导致细胞损伤。该菌株繁殖迅速，其他多项评价指标均表现优异，具备作为益生菌的条件。

为实现上述目的，本发明提供了一种无毒蜡样芽孢杆菌株pBC-1，于2014年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号CGMCC No.9535，经鉴定，其序列为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。主要生物学特征为：革兰氏阳性杆菌，需氧或兼性厌氧，菌体两端钝圆，呈链状排列，有鞭毛，能产生芽孢，菌落呈浅灰色、不透明，近似圆形，表面光滑。

本发明还提供了蜡样芽孢杆菌株pBC-1作为益生菌候选菌株应用于医药保健、饲料添加剂或生物兽药，以及清除水体污染和制备工业用酶类等方面的应用。

上述应用通常是以孢子形式制成制剂，但不排除以其他形式的存在制成的制剂。

本发明还提供了一种以孢子形式制成制剂的方法，具体包括以下步骤：

A. 血平板培养：将低温保存的蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1接种于哥伦比亚羊血琼脂板，于32 °C培养24 h之后，挑取单菌落重复在哥伦比亚羊血琼脂板培养一次；

B. 种子液的制备：将步骤A培养的菌种用灭菌的PBS（0.1 mM, pH 7.2）制成1×10⁸ CFU/mL菌悬液，取1 mL菌悬液接种量接种于20 mL含1%葡萄糖的常规CGY液体培养基中，250转/min，32 °C水浴培养6 h，获得种子液；

C. 芽孢的制备：将步骤B中种子液的1%稀释液接种于大豆酪蛋白琼脂培养基中， 32 °C培养7 d，得到蜡样芽孢杆菌pBC-1的芽孢粗提物。

D. 微生物制剂的制备：将步骤C中得到的芽孢粗提物与辅料混匀，60 °C真空干燥，得到蜡样芽孢杆菌干菌粉，血平板培养检验活菌数为1.0×10¹² CFU/kg。

所述的辅料为淀粉、明胶等添加剂。

该菌株可用于治疗人体或动物体内细菌感染性腹泻，特别是由耐药菌引起的。蜡样芽胞杆菌pBC-1以孢子形式存在制剂中，在肠道内可生长繁殖，暂时定殖，降低局部氧分子浓度，产生适合肠内正常优势菌群生长的厌氧条件，促进有益菌生长，起到调整肠道菌群失调，恢复肠道微环境，达到治疗或预防的目的。同时，该菌株可以作为益生菌用于动物饲料添加剂。在其进入动物体内，可以分泌大量蛋白酶、淀粉酶及其他代谢产物，促进肠道内容物的消化、吸收。这不仅有助于治疗动物的消化不良等疾病，还可促进动物的饲料转化率，提高料肉比，降低排泄物中的营养物质含量，缩短饲养周期，增加养殖者的收益。此外，该菌株可以作为多种植物的一种内生菌，能在植物活体内定殖形成共生关系，而不对寄主植物产生任何危害，促进植物生长、减少病害虫害，提高植物抵御不良环境的能力并减少化肥使用量。

本发明的有益效果是：蜡样芽孢杆菌pBC-1菌株在基因水平上呕吐毒素，溶血素BL，细胞毒素K的检测均为阴性，非溶血性肠毒素检测为阳性，但在蛋白水平上该菌株均不表达4种毒素蛋白中任何一种。此外，基于HEp-2和Vero细胞的细胞毒性检测均为阴性。

附图说明

图1 血琼脂培养基上蜡样芽孢杆菌pBC-1的菌落形态。

图2 蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素基因水平的检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定，所用试剂若无特别说明，均为市售。

实施例1 蜡样芽孢杆菌株pBC-1的分离和鉴定

在江苏五一农场取土壤5g，溶解在10 mL无菌的磷酸盐缓冲液（pH 7.2, 0.1 mM），取0.5 mL涂布于商品化的蜡样芽胞杆菌选择性培养基（PEMBA, Thermo），32 °C培养18 h。挑选阳性菌落在哥伦比亚羊血琼脂板上继续培养，挑取单菌落经表型分析、生化水平鉴定以及16S rRNA序列比对鉴定为蜡样芽胞杆菌，其菌落形态如图1所示，呈浅灰色、不透明，近似圆形，表面光滑。

实施例2 蜡样芽孢杆菌株pBC-1的培养和毒性检测

（1）细菌培养

a. 酪蛋白水解酵母培养基（CGY）培养基：酪蛋白水解物 20g，酵母提取物 6g，硫酸铵 2g，磷酸氢二钾 14g，磷酸二氢钾 6g，柠檬酸钠 1g，硫酸镁 2g，加水至1 L，高压灭菌备用。

b. 10% 葡萄糖溶液：10 g葡萄糖溶于100 mL蒸馏水，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 °C储存，备用。

c. 含糖的酪蛋白水解酵母培养基（CGY）配置：酪蛋白水解酵母培养基加入适量10%葡萄糖溶液至葡萄糖终浓度为1%，现配现用。

d. 10% 脱脂乳培养基：取10 g脱脂乳，加入100 mL蒸馏水，现配现用。

蜡样芽孢杆菌株pBC-1具体培养方式包括步骤如下：

菌种在哥伦比亚羊血琼脂板32 °C培养24 h之后，重复在哥伦比亚羊血琼脂板培养一次。挑取单菌落接种于20 mL含1% 葡萄糖的酪蛋白水解酵母培养基（CGY）培养基中32 °C培养16 h后，取1 mL备用。另取0.1 mL 接种于20 mL CGY培养基继续培养6 h，加入200 μL 0.1 mM EDTA，3000转/min，4 °C离心20 min，取上清以备毒素蛋白和细胞毒性检测。另外，挑取单菌落接种于20 mL 新鲜配置的10% 脱脂乳培养基，32 °C培养16 h后，121 °C高压灭菌15 min，培养液4 °C保存以备呕吐毒素细胞毒性检测。

（2）蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素基因水平上的检测，多重PCR检测，具体步骤为：

a.设计蜡样芽孢杆菌常见毒素，如呕吐毒素（cereulide），溶血素BL（Hbl）,非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒素K（CytK）相应的PCR引物，具体为根据表1中4种毒素不同组分，设计不同引物。

表1蜡样芽孢杆菌4种细菌毒素基因PCR引物

b.将上述1 mL细菌培养物于8000 转/min 离心10 min，去上清，通过DNA试剂盒（Qiagen, Germany）提取菌株DNA。

c.多重PCR验证目的菌株基因组中是否存在相应的细菌毒素基因：针对ces，cytK1，hblC和nheA以及nheA，nheB和nheC的同时检测，反应终体积为50 μL，加入0.2 mM dNTP（4种），2 mM MgCl2，0.5 μM 引物，1.5 单位DNA聚合酶，5 μL 10倍浓度缓冲液以及2 μL DNA提取物。针对hblA，hblC和hblD的检测，反应终体积为50 μL，加入0.2 mM dNTP（4种），2 mM MgCl2，0.3 μM 引物，3.5 单位DNA聚合酶，5 μL 10倍浓度缓冲液以及2 μL DNA提取物。同时，对照样品处理同上。PCR反应程序：94 °C预先变性5 min，94 °C变性1 min，49 °C退火（hblACD退火55 °C），72 °C延伸，各1 min，30循环，最终72 °C 反应10 min。

检测结果如图2所示：蜡样芽孢杆菌pBC-1菌株在基因水平上ces, hb1, cytK三种毒素基因均为阴性，而非溶血性肠毒素基因nhe为弱阳性。

（3）蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素蛋白水平上的检测，酶联免疫法（ELISA）检测：基于多种特性识别细菌毒素的单克隆抗体的酶联免疫检测蜡样芽孢杆菌pBC-1毒素蛋白的表达状况。具体步骤为：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，7种特异性单克隆抗体（mAb）识别蜡样芽胞杆菌常见Hbl，Nhe和呕吐毒素的7个不同组分。首先，将10 μL pBC-1菌株的CGY培养物溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被到96-空板，室温，过夜；3% 酪蛋白-磷酸盐缓冲液（pH 7.2）, 150 μL/孔，室温孵育2 h；其次，加入针对1 μg/mL不同组分的单克隆抗体 1A8（NheA），1E11（NheB），3D6（NheC），8B12（L2），1E9（L1）和1B8 （HblB）pH 7.2磷酸盐缓冲液 100 μL/孔，室温孵育1 h后，150 μL/孔洗涤液洗涤3次；再次，每孔加入2 μg/mL兔抗鼠-辣根过氧化物（HRP）标记物磷酸盐缓冲液，室温孵育1 h后，150 μL/孔洗涤液洗涤3次；随后加入四甲基联苯胺（TMB）显色底物 100 μL/孔，避光室温孵育20 min。最后，每孔加入1 mol/L 硫酸溶液终止反应，于450 nm在ELISA读出以测定结果。

（4）蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素细胞水平上的检测：基于HEp-2和Vero细胞的细胞毒性检测。具体步骤为：

Nhe，Hbl和CytK1的Vero细胞毒性测定：将将单菌落pBC-1菌株接种于1% 葡萄糖的CGY培养基连续培养后，按前述方法收集上清。将上清按1:20倍比稀释。细胞计数，每孔接种10000个Vero细胞，5% CO2培养箱37 °C培养24 h。每孔弃去100 μL培养液，加入水溶性的四唑盐（WST-1）10 μL，37 °C 孵育2 h后，于450 nm测定吸光度，计算pBC-1菌株所产生Nhe，Hbl和CytK1的细胞毒性。

呕吐毒素的HEp-2细胞毒性测定：将单菌落pBC-1菌株接种于10% 脱脂乳培养基，32 °C水浴培养16 h，将培养液高压灭菌后，取上清按1:20倍比稀释。细胞计数，每孔接种100000个HEp-2细胞，5% CO2培养箱37 °C培养48 h。每孔弃去100 μL培养液，加入水溶性的四唑盐（WST-1）10 μL，37 °C 孵育20 min后，于450 nm测定吸光度，计算pBC-1菌株所产生呕吐毒素的细胞毒性。

蛋白水平和细胞水平的检测结果如表2所示：在蛋白水平上该菌株均不表达4种毒素蛋白中任何一种成分，且对HEp-2和Vero细胞的细胞毒性检测均为阴性，不具有任何毒性。

表2 蜡样芽孢杆菌pBC-1细菌毒素蛋白水平和细胞水平的检测

实施例3 蜡样芽孢杆菌芽孢饲料添加剂的制备及应用效果

（1）蜡样芽孢杆菌芽孢制剂的制备

A. 血平板培养：将低温保存的蜡样芽孢杆菌菌株pBC-1接种于哥伦比亚羊血琼脂板，于32 °C培养24 h之后，挑取单菌落重复在哥伦比亚羊血琼脂板培养一次；

B. 种子液的制备：将步骤A培养的菌种用灭菌的PBS（0.1 mM, pH 7.2）制成1×10⁸ CFU/mL菌悬液，取1 mL菌悬液接种量接种于20 mL含1%葡萄糖的常规CGY液体培养基中，250转/min，32 °C水浴培养6 h，获得种子液；

C. 芽孢的制备：将步骤B中种子液的1%稀释液接种于大豆酪蛋白琼脂培养基中， 32 °C培养7 d，得到蜡样芽孢杆菌pBC-1的芽孢粗提物。

D. 微生物制剂的制备：将步骤C中得到的芽孢粗提物与淀粉等辅料混匀，60 °C真空干燥，得到蜡样芽孢杆菌干菌粉，血平板培养检验活菌数为1.0×10¹² CFU/kg。

（2）蜡样芽孢杆菌芽孢制剂的应用

将60头健康仔猪按体重相近、雌雄各半的原则随机分成4组，每组5头，3个重复。组1为空白对照组；组2为大肠杆菌攻毒组（Escherichia coli，E. coli, O149: K91: F4ac），每头口服新鲜制备菌液0.8×10¹⁰ 至2.0×10¹⁰ CFU；组3为蜡样芽孢杆菌pBC-1芽孢粉饲喂组，每头口服1.0×10¹⁰ 至2.5×10¹⁰ CFU/d；组4分别蜡样芽孢杆菌pBC-1芽孢粉治疗组，在采用与组2相同的E. coli攻毒前10 d，饲喂与组3相同剂量的蜡样芽孢杆菌pBC-1芽孢粉。

在试验周期内，记录各组仔猪临床表征及症状。第28天收集每头仔猪排出的新鲜粪样（约10 g），无菌封装后，于麦康凯平板上划线，37 °C培养18 h，进行细菌计数。采用PCR检测E. coli O149: K91:F4ac，特异性引物为（5′→3′）：

AAGGTCGACATGAAAAAGACTCTGAATGC；AGCCTCGAGTGTAATAAGTAATTGCTACGTTCAG

在组2中60%（9/15）仔猪表现腹泻症状，E. coli O149: K91: F4ac的分离率为80% （12/15）；组4中未见仔猪腹泻症状，且粪便中致病性E. coli的分离率仅为13.3%（2/15）。其他两组未见仔猪腹泻症状，且未分离到致病性E. coli。

此外，仔猪肠道菌群中具有代表性的乳酸杆菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌以及蜡样芽胞杆菌的微生物群落结构变化明显。组3和组4中乳杆菌数分别高于组2，8.1％和12.4％；粪肠球菌数分别高于对照组2，7.5％和10.2％；大肠杆菌数均降低6.8％和9.4％。组3和组4中，蜡样芽孢杆菌在仔猪粪便里检出率无明显差异，且在停止饲喂蜡样芽孢杆菌pBC-1芽孢粉2d后仔猪肠道不得检出。以上结果表明蜡样芽孢杆菌pBC-1芽孢粉不仅能促进乳酸杆菌等厌氧菌的增殖，而且能抑制肠道内需氧菌如大肠杆菌的繁殖。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。