植物抗病蛋白BjMYB9及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物抗病蛋白BjMYB9及其编码基因和应用。

背景技术：

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)作为最重要的植物真菌病原体，能够侵染200多种植物，包括几乎所有蔬菜和水果作物，每年导致全世界100亿乃至1000亿美元的损失，给农业生产造成巨大的经济损失(Dean et al.,2012；Lu et al.,2013；Weiberg et al.,2013)。

为了防御病原体侵染，植物进化出复杂的防御机制来应对病原体的攻击(Jones and Dangl,2006；Lu et al.,2013)。在防御过程中，一些植物基因被激活或诱导，其中许多转录因子(Transcription Factors,TFs)扮演重要的角色(Liu et al.,2013；Windram et al.,2012)。WRKY和AP2/ERF基因家族是主要的植物防御葡萄灰霉病菌侵染的转录因子(Hu et al.,2012；Lai et al.,2008；Lu et al.,2013)。此外NAC家族转录因子也能够调节植物对葡萄灰霉病菌的抵抗作用(Wang et al.,2009)。最近研究表明：一些MYB转录因子在植物应对葡萄灰霉病菌侵染过程中也发挥着重要的调节作用(Mengiste et al.,2003；Peng et al.,2011；Raffaele and Rivas,2013)。

MYB蛋白组成植物中最大的转录因子家族，在植物发育、次生代谢、激素信号转导、抗病和非生物胁迫方面发挥着重要的作用(Katiyar et al.,2012)。根据蛋白中MYB结构域重复次数的多少，MYB转录因子家族分为4个亚家族(R1-MYB、R2R3-MYB，3R-MYB和4R-MYB)(Dubos et al.,2010)。R2R3-MYB亚家族包含两个MYB结构域，主要调节植物特定的生理功能如对病原微生物的免疫作用(Dubos et al.,2010；Stracke et al.,2001)。例如来自橡胶(Hevea brasiliensis)的R2R3-MYB基因HbMyb1在烟草中超表达能够增强对葡萄灰霉病菌的抵抗作用(Peng et al.,2011)；小麦(Triticum aestivum L.)R2R3-MYB基因TaPIMP1在烟草中过表达能够增强烟草对活体营养细菌病原体(Ralstonia solanacearum)的抵抗作用，也能够增强小麦对半活体营养真菌病原体(Bipolaris sorokiniana)的抗性(Liu et al.,2011；Zhang et al.,2012)；水稻(Oryza sativa spp.japonica)R2R3-MYB基因OsJaMyb能够对稻瘟病(Magnaportheoryzae)的侵染做出应答(Lee et al.,2001)。此外AtMYB30作为拟南芥研究较为深入的R2R3-MYB基因，参与对病原微生物的免疫调节(Raffaele and Rivas, 2013)。其它一些来自拟南芥的R2R3-MYB基因如AtMYB108(Mengiste et al.,2003)，AtMYB72(Segarra et al.,2009)，AtMYB60和AtMYB96(Seo and Park,2010；Seo et al.,2009)也参与植物对病原体的抗性调节。

尽管R2R3-MYB转录因子在植物对病原体防御方面的突出作用，但这些蛋白质与靶基因之间的互作细节仍然不甚清楚(Prouse and Campbell,2013)。在分子水平上研究R2R3-MYB蛋白功能的研究报告正在出现，一些R2R3-MYB蛋白能够结合到AC元件(ACC(A/T)ACC(A/C/T)上，进而激活目标基因的转录(Prouse and Campbell,2012)。例如松树(Pinus taeda)MYB1和MYB4(Patzlaff et al.,2003a,2003b)以及桉树(Eucalyptus grandis)MYB2能够结合到木质素生物合成基因启动子的AC元件上(Goicoechea et al.,2005)。

在分子水平上了解植物防御机制将有助于研究人员利用作物抗性机制来改良作物。基于我们之前的研究：BjCHI1启动子BjC-P是多胁迫诱导性启动子(Wu et al.,2009)；W-box-like-4元件(GTAGTGACTCAT)是该启动子响应葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染的核心元件(Gao et al.,2014)，为了进一步分析BjC-P介导植物对真菌抗性的分子机制，我们通过酵母单杂交技术从芥菜(Botrytis cinerea)分离到一个R2R3-MYB转录因子BjMYB9。体外和体内实验均表明BjMYB9能够特异地结合到BjC-P的W-box-like-4元件上。此外过表达BjMYB9的转基因拟南芥增强了对葡萄灰霉病菌的抗性。然而迄今还没有人报道MYB蛋白能够特异的结合到一个W-box元件进而调节植物对病原真菌的防御作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种植物抗病蛋白质及其编码基因核苷酸序列。

本发明所提供的蛋白质源自芥菜(Brassica juncea)，是一种R2R3-MYB核转录因子蛋白，命名为BjMYB9，能够特异结合靶基因启动子中的W-box-like元件(GTAGTGACTCAT)，进而介导植物对葡萄灰霉病原真菌侵染的防御作用。

SEQ ID NO:1所示的是BjMYB9的氨基酸序列，由220个氨基酸残基组成，序列表中第13氨基酸至19位氨基酸，第79氨基酸至84位氨基酸是BjMYB9的2个MYB结构域所在氨基酸残基。

为了使BjMYB9便于纯化或分子检测，可由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接如下表所示的标签。

标签的序列如下：

编码所述蛋白BjMYB9的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA；也可以是RNA，如mRNA等。

SEQ ID NO:2所示BjMYB9的cDNA分子，由663个核苷酸组成，开放阅读框架为整个SEQ ID NO:2所示的序列，编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质(BjMYB9)。

含有所述核酸分子的重组载体、重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体包括用于真核表达BjMYB9的双元载体pCAMBIA1307-BjMYB9和用于原核表达His-BjMYB9融合蛋白的载体pET-28a-BjMYB9。重组菌为含有pCAMBIA1307-BjMYB9质粒的大肠杆菌DH5α以及农杆菌EHA105和含有pET-28a-BjMYB9的大肠杆菌DH5α。在pCAMBIA1307载体的多克隆位点BamH I和Sal I之间插入所述BjMYB9基因，得到BjMYB9植物表达重组质粒pCAMBIA1307-BjMYB9。在pET-28a载体多克隆位点EcoR I和Sal I之间插入所述BjMYB9基因得到BjMYB9的蛋白原核表达重组质粒pET-28a-BjMYB9。

所述BjMYB9蛋白或所述核酸分子在调控植物抗病性中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明中，所述调控植物抗病具体体现为提高植物对葡萄灰霉病菌的抗性。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗病性转基因植物的方法。

所述BjMYB9基因具体可通过所述重组表达载体导入目的植物中，携带有所述BjMYB9基因的重组表达载体可通过农杆菌介导等常规生物学方法转化目的植物，获得抗病性转基因植株。所述目的植物既可以是双子叶植物也可以是单子叶植物。在本发明的实施例中，所述植物具体为双子叶植物哥伦比亚生态型拟南芥Col-0。

所述BjMYB9作为转录因子的应用也属于本发明的保护范围。BjMYB9能与W-box-like顺式作用元件(GTAGTGACTCAT)结合，且具有激活功能。

本发明所提供的BjMYB9可以在葡萄灰霉病菌的诱导性下表达，可以特异结合W-box-like顺式元件(GTAGTGACTCA，核心序列为TGAC)，是通过酵母单杂交技术筛选 到能够和芥菜几丁质酶基因BjCHI1的启动子BjC-P中的真菌诱导核心元件W-box-like-4(GTAGTGACTCA)特异结合的R2R3-MYB型转录因子。进一步凝胶阻滞实验和烟草瞬时表达实验证明BjMYB9能够和W-box-like-4特异结合并激活该启动子活性。BjMYB9基因在芥菜中RNA表达明显受到真菌的诱导表达，该基因在模式植物拟南芥过表达后能够明显增强拟南芥对葡萄灰霉菌的抗性，可以提高植物对葡萄灰霉病菌的抗病能力，为揭示植物抗病机制及培育抗病品种提供了实验基础和基因资源。本发明的BjMYB9将在提高植物病原真菌葡萄灰霉菌的抗性育种中发挥重要的作用。本发明首次证明R2R3-MYB蛋白质可以与W-box-like元件互作，进而介导植物对真菌侵染的防御作用，为W-box元件和互作蛋白之间的作用机制提供了新的诠释，也将为培育能够增强植物对活体营养性病原菌的抗性品种提供新的思路和基因资源。

附图说明

图1为酵母单杂交诱饵Bait和Bait-m序列示意图以及Bait和Prey载体结构示意图。(A)野生型诱饵片段Bait和其突变体片段Bait-m序列示意图。诱饵片段Bait和Bait-m序列示意图：BjC-P启动子片段-700～-621(白框显示)和-409～-371(灰框显示)融合为诱饵序列，框上面的数字表明BjC-P启动子片段的核苷酸位置，W-box-like-4元件及其突变体序列被显示，核心序列TGAC及其突变序列GCAA用粗体显示；(B)诱饵和Prey载体结构示意图：Bait和Bait-m片段分别插入在pBait-AbAi载体上AbA^r报告基因的上游，芥菜cDNAs插入在pGADT7载体Sfi I位置，GAL4AD基因下游，报告基因LEU2基因上游，构建成芥菜cDNA文库。

图2为BjMYB9的酵母单杂交筛选。酵母单杂交技术筛选和W-box-like-4元件互作的蛋白因子，其中：(A)通过SD/-Ura/AbA缺陷型培养基确定酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的Aureobasidin A(AbA)最适抑制自激活浓度。Aureobasidin A(AbA)是一种环酯肽抗生素，低浓度的AbA能够抑制酵母Y1HGold的生长；但诱饵酵母中含有AbA抗性基因(AUR1-C)，当猎物蛋白与诱饵片段互作时，GAL4AD就会激活AUR1-C基因的表达，诱饵酵母就能够获得AbA的抗性。为了确保猎物蛋白来自cDNA文库，而非酵母内源蛋白，在筛选cDNA文库前要严格测试抑制诱饵酵母菌株Y1HGold[pBait1-AbAi]、Y1HGold[pBait1-m-AbAi]自激活最适AbA浓度，结果显示报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的AbA最适抑制浓度为550ng/ml；(B)酵母单杂交技术Y1H筛选芥菜cDNA文库：pGADT7-BjcDNAs质粒转化酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]，然后在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培养基(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)上筛 选，利用不含AbA的培养基SD/-Leu作为对照，验证酵母转化效率，箭头表示筛选出的阳性克隆；(C)BjMYB9与W-box-like-4元件互作，但与突变的W-box-like-4不互作。从筛选出的阳性克隆(如图2B所示)分离出的质粒pGADT7-BjMYB9重新分别转化酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]，然后分别在SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰培养基上筛选，结果pGADT7-BjMYB9质粒转化酵母报告菌株Y1H gold[pBait-AbAi]后能够在SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰培养基上长出健康的克隆，但是pGADT7-BjMYB9转化突变体酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-m-AbAi]不能长出健康的克隆。空质粒pGADT7作为筛选阳性互作克隆的阴性对照，不含抗生素的SD/-Leu平板筛选用来验证转化效率。

图3为BjMYB9受真菌激发子诱导表达的实时荧光定量(Real-time)PCR图谱。用200μg/ml的真菌激发子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)处理芥菜(Brassica juncea)幼苗叶面，保鲜袋保湿12h，然后分24、48和72h取叶片，速冻于液氮用于提取RNA及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，检测BjMYB9在这几个时间点的RNA表达水平。0h的RNA表达水平作为对照，未真菌激发子处理。选用芥菜持家基因BjActin作为内参(序列见表1)。数据显示为平均值±SD，重复次数为3次(n＝3)。BjMYB9受到真菌激发子的诱导表达，在48hRNA表达水平达到最高，之后又开始下降。

图4为T₃代BjMYB9转基因拟南芥和野生型拟南芥对葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗病表型。(A)野生型拟南芥Col-0(WT)和3个BjMYB9过表达转基因拟南芥株系(#1，#2，#6)在接种葡萄灰病(Botrytis cinerea)3周后的感/抗病表型。；(B)qRT-PCR检测野生型拟南芥Col-0(WT)和3个BjMYB9过表达转基因拟南芥株系(#1，#2，#6)在接种后葡萄灰霉病的生物量；(C)qRT-PCR分析BjMYB9在转基因拟芥接种葡萄灰霉病(Botrytis cinerea)前后的RNA表达。BjMYB9在野生型拟南芥Col-0(WT)中的表达作为参照。结果显示BjMYB9过表达转基因拟南芥增强了对葡萄灰霉病菌的抗性。

图5为His-BjMYB9融合蛋白与W-box-like-4元件的体外特异性结合实验。凝胶阻滞实验(EMSA)检测BjMYB9和W-box-like元件的体外互作：(A)探针W4、W4突变体W4d和W5的核苷酸序列，W4含有W-box-like-4元件，W4d含有突变的W-box-like-4，核心元件序列TGAC缺失，用(----)显示，W5含有W-box-like-5元件，这些元件序列均用粗体和下划线突出显示。其中W5中的W-box-like-5元件与W-box-like-4元件仅1个碱基(C，用大写及斜体显示)的差别；(B)His-BjMYB9融合蛋白与W4和W4d之间的凝胶阻滞实验(EMSA)，每个结合反应均用等量的His-BjMYB9融合蛋白和生物素标记探针，竞争性结合实验中未标记生物素的冷探针分别为热探针(标记生物素)的50和200倍， 结合探针和自由探针的条带如图左边箭头所示；(C)His-BjMYB9融合蛋白与W4和W5之间的凝胶阻滞实验(EMSA)，每个结合反应均用等量探针，His-BjMYB9融合蛋白呈梯度浓度增加。

图6为His-BjMYB9融合蛋白与W-box-like-4元件的体内特异性结合实验。(A)BjC-P，GUS表达质粒P16，P53和BjMYB9过表达质粒结构示意图。浅灰框代表BjC-P和其缺失片段，框上面的数字代表相对于BjCHI1转录起始位点核苷酸的位置。含有纹理小框的的深灰框代表含有内含子(内含子用带有纹理的框显示)的GUS基因。P53中的小白框代表W-box-like-4元件中的TGAC碱基缺失；(B)GUS组织化学染色，圆的虚线框代表注射的区域，注射的质粒如图中所示；(C)P16和P53在烟草叶片瞬时表达后的GUS活性荧光定量分析：烟草叶片共注射P16和pBjMYB9，pBI121-LUCint以及P53和pBjMYB9，pBI121-LUCint，GUS活性通过LUC活性均一化。柱形图代表被pBjMYB9诱导后与诱导前的GUS活性比值，实验重复3次，图为平均值加减标准误差。结果显示BjMYB9通过结合W-box-like-4元件进而激活BjC-P活性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、BjMYB9的分子克隆

一.植物及生长条件

植物拟南芥Arabidopsis thaliana(L.)(生态型Col-0)，本名烟Nicotiana.benthamiana和芥菜Brassica juncea在22℃(光)/19℃(黑暗)及16h光照/8小时黑暗周期条件下生长。拟南芥用于稳定的遗传转化，本名烟Nicotiana.benthamiana用来瞬时表达，芥菜Brassica juncea用来构建cDNA文库和内源性基因表达分析实验。

二.酵母单杂交实验筛选与W-box-like-4元件互作的转录因子

用200μg/ml的真菌激发子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)(Raventos et al.,1995)叶面喷洒处理芥菜幼苗，分别于处理后12、24、48和72h取叶片速冻于液氮中，将不同时间段所取叶片样品混合并提取总RNA，用来构建芥菜cDNA文库。构建cDNA文库所用载体为pGADT7(Clontech Laboratories,Inc.,a Takara Bio Company)，诱饵载体为pAbAi(Clontech Laboratories,Inc.,a Takara Bio Company)。芥菜cDNA插入在pGADT7载体Sfi I位点，位于 GAL4AD基因下游，报告基因LEU2基因上游，构建成芥菜cDNA文库质粒(参见图1)。野生型诱饵片段Bait为BjC-P含有真菌诱导核心元件序列(GTAGTGACTCAT)的区段(-700～-621)和与其协同作用的区段(-409～-371)相连而成的片段，长度为125bp(参见图1)。突变体诱饵片段为Bait-m，其Bait中真菌诱导核心元件序列(GTAGTGACTCAT)的保守碱基TGAC突变为GCAA，其它序列与野生型Bait序列完全一致(参见图1)。Bait核苷酸序列为5′-CTCTGCTAGAGATAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGTGACTCATGAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCATATATCGTGTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGTCCAGCTATCGTGTAGAAATATT-3′，Bait-m核苷酸序列为5′-CTCTGCTAGAGATAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGGCAATCATGAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCATATATCGTGTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGTCCAGCTATCGTGTAGA AATATT-3′。Bait和Bait-m分别以质粒P16和P54(Gao et al.,2014)为模板进行扩增，扩增用引物见表1。引物对pAbAi-Seq1/pAbAi-Seq2(见表1)用来验证pBait-AbAi载体是否整合入酵母基因组中。引物对PGADT7-F/PGADT7-R(见表1)用来鉴定酵母单杂交(Y1H)筛选出的阳性克隆。

酵母菌株为Y1HGold，酵母单杂交方法严格按照Clontech公司的实验手册操作(Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System User Manual)。结果如图2所示：通过SD/-Ura/AbA缺陷型培养基确定酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的Aureobasidin A(AbA)最适抑制自激活浓度为550ng/ml(参见图2A)。pGADT7-BjcDNAs质粒转化酵母报告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]，然后在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)筛选，利用不含AbA的培养基SD/-Leu作为对照，验证酵母转化效率。如图2B所示，在不含AbA的培养基SD/-Leu，克隆生长正常且克隆数较多，说明转化效率正常。在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培养基上(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)生长有一定数量的克隆，如箭头所示，表示筛选出的阳性克隆。图2C显示通过酵母单杂交技术获得与W-box-like-4元件特异结合的R2R3-MYB型转录因子BjMYB9。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其开放阅读框为序列2整个序列。BjMYB9基因编码序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质(命名为BjMYB9蛋白)，BjMYB9蛋白由220个氨基酸残基组成，具有2个保守的R2R3-MYB结构域。

表1运用在BjMYB9研究中的引物

实施例2、实时荧光定量PCR分析BjMYB9基因受真菌激发子诱导后的RNA表达

一.材料处理

芥菜(Brassica juncea)幼苗叶片用200μg/ml真菌激发子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)喷洒处理，在处理后24、48、72h及对照0h(未处理)取样，于液氮中速冻研碎，采用TIANGEN公司的植物总RNA提取试剂盒提取芥菜总RNA，并用无RNAase污染的DNAase处理，去除RNA中基因组DNA的污染。并用TIANGEN公司RNA反转录试剂盒合成cDNA第一链。反转录产物cDNA第一链用作实时定量PCR分析。

二.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

实时定量PCR运用SYBR Green Premix(天根公司，北京，中国)和ABI 7500快速实时定 量PCR仪(Applied Biosystems,Foster city,CA,USA)进行，具体步骤参见试剂盒的使用说明和实时定量PCR仪的操作说明。芥菜持家基因BjActin(引物序列见表1)作为内参基因，通过其在不同样品间的表达水平对不同样品的PCR产物进行水平校正。对所有样品的实时定量PCR产物都进行溶解曲线分析，以确保反应产物为一种特异的产物。运用2^-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen,2001)对BjMYB9在芥菜接种葡萄灰霉病菌前后的RNA表达进行分析，检测用引物对BjMYB9F3/BjMYB9R2和BjActin-F/BjActin-R序列见表1。BjMYB9受真菌激发子诱导后在芥菜中的RNA表达结果见图3。

图3结果表明：芥菜受真菌激发子诱导后，内源基因BjMYB9的表达明显受到诱导，在诱导48小时表达水平达到最高，之后表达水平开始下降。

实施例3、BjMYB9抗葡萄灰霉病表型检测

一.BjMYB9对拟南芥Col-0的遗传转化

BjMYB9 cDNA运用引物对BjMYB9-F2/BjMYB9-R(序列见表1)扩增，测序正确并克隆进pCAMBIA1307载体BamH I和Sal I位点，获得35S启动子驱动的质粒pCAMBIA1307-BjMYB9。运用花顶端法并通过农杆菌EHA 105介导转化拟南芥(Clough and Bent,1998)。阳性转基因株系运用引物BjMYB9-F2/BjMYB9-R并通过PCR检测。3个独立的T2代阳性转基因株系在含有40μg/ml潮霉素的MS培养基再次筛选，后移栽到土里，约4周大时进行葡萄灰霉病菌接种处理。

二.葡萄灰霉病菌(B.cinerea)的培养及对拟南芥的接种处理

葡萄灰霉病菌(B.cinerea)在土豆培养基(土豆200g/l,葡萄糖20g/l,琼脂15g/l,1.5％右旋糖，pH 6.0)，22℃条件下培养10天。葡萄灰霉病菌的孢子用无菌ddH₂O悬浮，然后用2层无菌纱布过滤，并用无菌ddH₂O稀释至5×10⁵个细胞/毫升，用于接种拟南芥。4周大的拟南芥进行葡萄灰霉病喷雾接种，无菌ddH₂O喷雾接种作为对照。

接种结果见图4A。由图4A知：接种葡萄灰霉病菌后，野生型拟南芥的叶片大多干枯，而BjMYB9转基因拟南芥的叶片大多仍然表现鲜绿，特别是2号株系叶片基本保持全绿。

三.BjMYB9，BcITS在BjMYB9转基因拟南芥株系接种葡萄灰霉病菌前后的RNA表达分析

qRT-PCR方法检测BjMYB9，BcITS在BjMYB9转基因拟南芥株系以及野生型拟南芥接种葡萄灰霉病菌前后RNA表达，检测方法同实施例2中的qRT-PCR方法。拟南芥持家基因Atactin基因(引物序列见表1)作为内参基因，检测用引物对BjMYB9F3/BjMYB9R2和BcITS-F/BcITS-R序列见表1。检测结果见图4B和图4C。

图4B结果表明：野生型拟南芥Col-0和BjMYB9过表达转基因拟南芥株系接种葡萄 灰霉病菌后，BcITS在BjMYB9过表达转基因拟南芥株系中的表达量较野生型明显降低，说明葡萄灰霉病菌在BjMYB9过表达转基因拟南芥株系中生长量明显低于野生型，进一步说明BjMYB9对葡萄灰霉病菌的抵抗作用。图4C结果表明：BjMYB9在其转基因拟南芥中的表达量较野生型明显增强，当接种葡萄灰霉病菌后表达量又进一步增强。

实施例4、His-BjMYB9与W-box-like-4元件的体外结合实验

一.His-BjMYB9在大肠杆菌中表达

BjMYB9通过引物对BjMYB9-F1/BjMYB9-R(见表1)扩增，然后构建入蛋白表达载体pET-28a(+)EcoR I和Sal I位点，获得原核表达载体pET-28a-BjMYB9。将pET-28a-BjMYB9热击转化入大肠杆菌菌株E.coli Rosetta(DE3)进行蛋白诱导表达。在37度条件下含有pET-28a-BjMYB9质粒的DE3菌的浓度摇至OD600为0.8时，转为16度，用0.6mM isopropyl-D-thiogalactoside(IPTG)低温诱导过夜。收获细胞，然后用裂解缓冲液(含有50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠和10mM咪唑，pH 8.0)悬浮并超声破碎细胞，高速离心后，裂解上清用Ni²⁺亲和珠结合(Ni-NTA,QIAGEN)，方法按照产品说明书。纯化的His-BjMYB9融合蛋白用于EMSA实验。

二.凝胶阻滞实验(EMSA)

凝胶阻滞实验(EMSA)方法基本参见文章描述(Wang et al.,2014)，稍作调整。为了鉴定BjMYB9的结合位点，合成互补的含有W-box-like-4元件和其突变体的5′端标记或非标记生物素的BjC-P寡核苷酸单链，并退火获得双链寡核苷酸片段W4，W4d(W4的突变体)和W5。寡核苷酸序列单链如下：W4F(5′-gcccagctagtgagtagtgactcatgaggtagagagaggg-3′)，W4R(5′-ccctctctctacctcatgagtcactactcactagctgggc-3)，W4RBio(5′-ccctctctctacctcatgagtcactactcactagctgggc-3′,5′-biotin-labeled)，W4d-F(5′-gcccagctagtgagtagtcatgaggtagagagaggg-3′)，W4d-R(5′-ccctctctctacctcatgactactcactagctgggc-3′)，W4dRBio(5′-ccctctctctacctcatgactactcactagctgggc-3′，5′-biotin-labeled)，W5F(5′-agggtggtccctctagtgactcatgagctagagagagggt-3′)，W5R(5′-accctctctctagctcatgagtcactagagggaccaccct-3′)，W5RBio(5′-accctctctctagctcatgagtcactagagggaccaccct-3′，5′-biotin-labeled)。EMSA结合反应体系为10mM Tris盐酸(pH 7.5)，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸钠(pH 7.5)，2mM二硫苏糖醇，30％甘油，1mM氯化镁，0.01％牛血清白蛋白(BSA)，0.1mg/ml鱼精DNA，40fmol生物素标记DNA，0-8pmol非标记DNA，15fmol His融合蛋白。先在室温进行30分钟 的竞争性结合反应，然后再进行30分钟的生物素标记探针的结合反应。之后用8％非变性凝胶电泳，转尼龙膜，用交联仪(CL-1000Ultraviolet Crosslinker)在120mJ/cm²条件下交联1分钟。免疫染色严格按照Light ShiftR Chemiluminescent EMSA Kit试剂盒说明书进行(Pierce,Rockford,IL,USA)。

EMSA结果见图5，图5B结果显示：BjMYB9能够与W4特异结合，而与W4的突变体W4d没有结合作用；图5C结果显示：BjMYB9能够与W4结合，且随着His-BjMYB9蛋白含量的逐渐增多，结合条带浓度也增强，但与W5没有任何结合作用。此结果表明BjMYB9能够在体外与W-box-like-4元件特异结合。

实施例5、His-BjMYB9与W-box-like-4元件的体内特异性结合实验

烟草叶片的瞬时表达实验：

烟草第6叶片完全展开时进行注射。将获得含阳性质粒pBjMYB9的农杆菌菌株EHA105、含真菌诱导核心元件的启动子质粒p16菌株、含真菌诱导核心元件突变体质粒p53菌株及含LUC基因的内标载体p57菌株(Gao et al.,2014)，培养在含卡那霉素(50μg/ml)和利福平(30μg/ml)的LB培养基上，28℃生长2天，用MMA缓冲液(10mM氯化镁，1mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)，pH 5.5，100μM乙酰丁香酮)悬浮，调节菌浓度OD600为1.5，28℃培养箱中孵育3小时。菌液pBjMYB9、内标载体p57菌液及p16菌液或p53菌液按1∶1∶1混合。用1mL去针头的塑料注射器，将菌液注入生长约6周的本氏烟第5和6片叶中，48小时后取一片叶样进行GUS组织化学染色，一旦染色即终止反应，用梯度酒精脱色，结果见图6B。

图6A显示芥菜几丁质酶BjCHI1的启动子BjC-P以及其缺失区段构建的GUS表达质粒P16，P53和BjMYB9表达质粒pBjMYB9结构示意图。其中P16中含有W-box-like-4元件(在-668～-657)，而P53是将W-box-like-4元件中的核心序列TGAC缺失。

图6B结果显示：pBjMYB9质粒与P16混合注射后，能够激活P16质粒中的GUS基因表达，但与P53质粒共注射及P16，P53和pBjMYB9单独注射均没有GUS表达。而P53和P16相比，仅W-box-like-4元件突变，说明BjMYB9能够体内与W-box-like-4特异结合。

对称的另一片叶样用蛋白提取液(CCLR,Promega,Madison,WI,USA)提取总蛋白，离心吸取20μl蛋白提取液加480μl GUS反应液(0.1mol/l pH 7.0的磷酸盐缓冲液，0.5mol/l乙二胺四乙酸钠pH 8.0，0.1％Triton X-100，10mmol L–1β巯基乙醇，0.1％月桂酰基肌氨酸钠，1mmol/l 4-甲基伞形酮-beta-D-葡萄糖醛酸酐)混合，迅速吸取反应混合液100μl加到900μl反应终止液(200mmol/l Na₂CO₃)中，将剩余的反应液放37℃水浴锅中反应，30min 后取出，快速吸取100μl反应液加到900μl反应终止液中混匀，用HITACHI F-4600FLUO-RESCENCE SPECTROPHOTOMETER仪器测0min、30min GUS活性。根据Promega公司Luciferase Assay System的说明书，20μl蛋白提取液加100μl荧光素酶反应(Luciferase Assay Reagent,Promega,Madison,WI,USA)混匀，用TriStar LB 941仪器测LUC活性(Gao et al.,2014)，结果见图6C。

图6C结果显示：P16与BjMYB9共注射后GUS活性与P16单独注射GUS活性的比值明显高于P53，进一步说明BjMYB9能够与W-box-like-4体内特异结合，进而激活BjC-P的启动子活性。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物抗病蛋白BjMYB9及其编码基因和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 220

<212> 氨基酸

<400> 1

MetGlyValLysGlyLeuThrLeuTyrHisLeuLysSerHisLeuGlnLysPheArgLeuGlyArgGlnAlaCysLysGluSerThrGluAsnSerLysAspAlaSerCysValGlyGluSerGlnAspThrGlySerSerSerSerSerSerLeuArgMetAlaAlaGlnGluGlnAsnGluGlyTyrGlnValThrGluAlaLeuArgAlaGlnMETGluValGlnArgArgLeuHisGluGlnLeuGluTyrGlyGlnValGlnArgArgLeuGlnLeuArgIleGluAlaGlnGlyLysTyrLeuGlnSerIleLeuGluLysAlaCysGlnAlaPheAspAspGlnAlaAlaAlaPheValGlyLeuGluAlaAlaArgGluGluLeuSerGluLeuAlaIleLysValSerGlnGlyThrAlaValProPheLeuAspAlaThrLysMetMetMetMetProSerLeuSerGluLeuGluValAlaIleAspThrLysAsnAsnIleThrThrAsnCysSerValGluSerSerLeuThrSerAsnThrAsnGlySerSerValSerAlaAlaSerMetLysLysArgHisArgGlyAspAspValGlyLeuGlyTyrGluAlaGlyTrpIleValProSerSerThrIleGly

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<400> 2

ATGGGAGTGAAAGGCCTCACCCTCTACCACCTCAAATCACATCTCCAGAAATTCCGGCTAGGGAGGCAAGCTTGTAAAGAATCAACTGAGAACTCCAAGGATGCTTCTTGTGTTGGGGAGAGTCAGGACACAGGTTCATCTTCATCGTCATCACTGAGAATGGCAGCGCAGGAGCAGAACGAGGGTTACCAAGTCACTGAAGCTCTACGCGCTCAAATGGAAGTCCAAAGAAGACTACACGAGCAATTGGAGTATGGGCAGGTACAACGGAGACTCCAGCTGAGGATAGAGGCACAAGGAAAGTACTTACAATCGATCCTTGAGAAAGCTTGCCAGGCCTTTGACGACCAAGCTGCTGCTTTTGTTGGGCTCGAGGCAGCTAGGGAAGAGCTATCAGAGCTAGCCATCAAAGTGTCTCAAGGAACAGCAGTCCCGTTCTTAGATGCAACAAAGATGATGATGATGCCATCTTTGTCTGAGCTTGAAGTAGCGATAGACACCAAAAACAACATCACAACCAACTGTTCGGTTGAAAGCTCTCTGACTTCCAACACCAATGGGAGCTCGGTTTCTGCTGCATCGATGAAGAAGCGGCATCGTGGAGACGATGTAGGCCTAGGGTACGAGGCAGGGTGGATTGTGCCTAGTAGTACCATTGGATAA