一种从钝顶螺旋藻制备高纯度叶绿三酸的方法与流程

本发明涉及光动力学疗法天然光敏剂技术领域，尤其涉及一种第二代光敏剂叶绿三酸Chlorine6的高效高纯度制备方法。

背景技术：
叶绿三酸Chlorine6及其衍生物属于光动力学疗法的第二代光敏剂。Chlorine6是源自叶绿素的天然分子，具有光激发三线态寿命长，在可见光的红区具有较高的摩尔吸光系数，与其他卟啉类光敏剂相比价格低廉，其研究应用处于临床试验阶段。Chlorine6一般通过叶绿素a碱性水解转化获得，商品化的Chlorine6的制备方法中涉及叶绿素的柱层析法分离提纯，叶绿素a的得率较低，获得的Chlorine6纯度一般93％～98％。本发明不需要采用柱层析法分离提纯叶绿素或叶绿三酸，无柱层析损失，叶绿素a利用效率高，最终获得的叶绿三酸Chlorine6产率高。钝顶螺旋藻是蓝藻的一种，本发明以钝顶螺旋藻为原料，制备的Chlorine6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，HPLC纯度大于99.5％。

技术实现要素：
本发明针对商品化叶绿三酸Chlorine6产率和纯度较低的问题，提出了一种高效高纯度Chlorine6的制备方法。本发明采取的技术方案是：本发明高纯度叶绿三酸Chlorine6制备方法的具体步骤如下：⑴以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集藻体。⑵藻体用乙醇萃取数次，萃取液合并。⑶萃取液中加入适量石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入萃取液1/5～1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取数次，含色素的石油醚相用水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤数次。⑷石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液，搅拌反应0.5～6h。⑸往上述混合液中加入去离子水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚洗涤数次，至洗涤液无色。⑹滴加5mol/L盐酸中和，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤数次。⑺沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。⑻在上述步骤⑹中，5mol/L盐酸中和后，加入二氯甲烷溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。⑼采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorine6固体。本发明制备的Chlorine6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，HPLC纯度大于99.5％。附图说明图1为实施例4所得叶绿三酸Chlorine6的结构图。图2为实施例4碱催化反应后石油醚相类胡萝卜素溶液的吸收光谱。图3为实施例4碱催化反应后水-乙醇相含镁叶绿三酸钠盐的吸收光谱。图4为实施例4所得产品叶绿三酸钠盐乙醇溶液的吸收光谱。图5为实施例4所得产品叶绿三酸乙醇溶液的吸收光谱图。图6为实施例4所得产品的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图。基质中的三氟乙酸使得叶绿三酸带正电，分子离子峰([M+H]+)的质荷比m/z为597.541，与叶氯三酸的理论分子量596.67一致。具体实施方式下面的实施例是对本发明的进一步描述。实施例1本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤如下：取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，搅拌反应0.5h。往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚洗涤两次。滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤两次。沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。实施例2本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤如下：取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(体积比1:1)15mL快速洗涤两次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，搅拌反应2h。往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚洗涤两次。滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用去离子水洗涤两次。沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥，获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。实施例3本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤如下：取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用50mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，搅拌反应3h。往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚洗涤两次。滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烷溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorine6固体。实施例4本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤如下：取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用40mL乙醇萃取三次，萃取液合并。萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(体积比1:1)15mL快速洗涤两次。石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL，搅拌反应6h。往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚洗涤两次。滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烷溶剂萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸Chlorine6固体。尽管已经示出了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据上述说明对这些实施例进行改进或变换，而这些改进或变换都应属于本发明所述权利要求的保护范围。