新型噬菌体以及包含其的组合物的制作方法

本发明涉及对产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)具有特异性杀死能力的新型噬菌体、包含其的组合物、以及使用所述新型噬菌体或所述组合物预防或治疗动物的传染病的方法。
背景技术：
：：大肠杆菌(escherichiacoli，下文中称为e.coli)是肠杆菌科埃希氏菌属的革兰氏阴性短杆菌，并且是存在于各种动物(包括哺乳动物)的肠道中的正常菌群之一。已知大肠杆菌的大多数菌株是非致病性的，并且可以引起机会性感染，但一些高致病性菌株在包括人的动物体内引起各种肠道疾病和败血症等。大肠杆菌可以被分为产肠毒素性大肠杆菌(etec)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenice.coli,epec)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagice.coli,ehec)、肠集聚性大肠杆菌(enteroaggregativee.coli,eaec)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasivee.coli,eiec)、产坏死性毒素大肠杆菌(necrotoxigenice.coli，ntec)等，并且具体来说，已知产肠毒素性大肠杆菌在猪中引起大肠杆菌传染病。目前，随着在养猪业中大规模群养的趋势，猪大肠杆菌病已经成为养猪场中最常见且困扰的疾病。最近，在韩国猪大肠杆菌病的发生也一直增长，由于腹泻而造成小猪的生长迟缓和死亡，这给养猪场造成巨大的经济损失。尽管在过去已经给猪施加多种抗生素用于预防和治疗这种猪大肠杆菌病，但抗生素的滥用或使用不当会在猪中引发抗生素耐受性或者会引起抗生素残留在猪体内，因此目前在世界范围内对抗生素的施用具有很多限制。此外，噬菌体是指感染特定细菌并抑制和阻碍所感染的细菌的生长的细菌特异性病毒。由于噬菌体具有比抗生素更强的宿主特异性而且最近出现对抗生素有抗性的细菌的问题日益严重，噬菌体的应用已经引起高度重视。在许多国家已经积极进行了对噬菌体的研究，并且除了噬菌体的专利申请外，欲从美国食品药品监督管理局(foodanddrugadministration，fda)获得对使用噬菌体的组合物的批准的举动也呈增加的趋势。然而，用于预防和/或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病(该传染病在包括养猪业在内的畜产业中正成为非常重要的问题)的噬菌体相关技术仍然不足，因而需要开发这样的噬菌体及其相关技术。技术实现要素：技术问题作为旨在解决对抗生素有抗性的细菌的出现和肉类中抗生素残留等问题以及有效地预防和治疗由大肠杆菌引起的传染病而进行反复研究的结果，本发明人从自然界分离出一种对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀死能力的新型噬菌体φcj28(kccm11466p)。此外，本发明人鉴定了该新型噬菌体的形态特征、生物化学性质和遗传性质，证实了该噬菌体具有优异的耐酸性、耐热性，从而开发了使用该噬菌体的抗生素、消毒剂、饲料添加剂以及其他组合物，并进一步开发了用于预防或治疗由大肠杆菌引起的传染病的组合物以及使用其来预防或治疗疾病的方法。本发明的一个目的是提供对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀死能力的新型噬菌体φcj28(kccm11466p)。本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物，该组合物包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分。本发明的又一个目的是提供包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或洗涤剂。本发明的又一个目的是提供使用噬菌体φcj28(kccm11466p)或包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的组合物来预防和/或治疗非人类动物的由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的方法。技术方案本发明的一个方面提供对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀死能力的新型噬菌体φcj28(kccm11466p)。本发明的另一个方面提供用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物，该组合物包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分。本发明的另一个方面提供包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或洗涤剂。本发明的另一个方面提供预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的方法，其包括如下步骤：向非人类动物给药上述噬菌体φcj28(kccm11466p)或包含该噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的组合物。有益效果根据本发明的噬菌体φcj28(kccm11466p)具有特异性杀死产肠毒素性大肠杆菌的效果。而且，根据本发明的噬菌体φcj28(kccm11466p)具有优异的耐酸性和耐热性，并因此不仅能够被用作在各种范围的温度和ph下预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的物质，而且能够以包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂、洗涤剂等使用。而且，本发明提供噬菌体φcj28(kccm11466p)或包含噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的抗生素，并且具有如下效果：与现有的抗生素相比，对产肠毒素性大肠杆菌的特异性非常高，从而能够仅杀死特定致病细菌而不杀死有益细菌；并且不引发耐药性，这使得与现有的抗生素相比产品市场寿命延长。而且，本发明具有通过向非人类动物给药该噬菌体φcj28(kccm11466p)或包含该噬菌体φcj28(kccm11466p)作为有效成分的组合物来预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的效果。附图说明图1是新型噬菌体φcj28(kccm11466p)(在下文中被称为“φcj28”)的电子显微镜图。图2示出了新型噬菌体φcj28的脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis，pfge)结果。图3示出了新型噬菌体φcj28的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)结果。图4是示出新型噬菌体φcj28的耐酸性实验结果的图。图5是示出新型噬菌体φcj28在60℃下的耐热性实验结果的图。具体实施方式在下文中，更详细地描述本发明。在本文中将省略对本领域普通技术人员来说显而易见的细节描述。本发明的一个实施方式提供对产肠毒素性大肠杆菌(etec)具有特异性杀死能力的新型噬菌体φcj28(kccm11466p)(在下文中被称为“φcj28”)。产肠毒素性大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌并且是分解乳糖和果糖以产生酸和气体的需氧或兼性厌氧细菌。产肠毒素性大肠杆菌在普通培养基上也生长良好，并且能够在约7℃至48℃的温度下生长，其中最佳生长温度可以为约35℃至37℃。而且，产肠毒素性大肠杆菌可以在4.5至9.0的ph范围下生长。由于产肠毒素性大肠杆菌产生与由霍乱弧菌(vibriocholera)产生的毒素相似的毒素，因此若感染产肠毒素性大肠杆菌，则表现出与感染霍乱弧菌的情况相似的症状。所产生的毒素能够大致分类为热不稳定肠毒素(heat-labileenterotoxin,lt)和热稳定肠毒素(heat-stableenterotoxin,st)。热不稳定肠毒素在约60℃下加热约10分钟时失去其活性，而热稳定肠毒素在约100℃下加热约30分钟时也不失去其活性。产肠毒素性大肠杆菌在小肠的上部增殖，并且当产肠毒素性大肠杆菌的浓度达到每单位体积(1ml)肠液内存在约107菌落形成单位(cfu)至约108cfu时，产肠毒素性大肠杆菌可引起包括大肠杆菌病在内的大肠杆菌传染病。噬菌体是感染特定细菌并抑制和阻碍该细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)作为遗传物质的病毒。具体而言，根据本发明的实施方式的噬菌体φcj28具有选择性地感染产肠毒素性致病大肠杆菌的种属特异性，并且是具有带有正二十面体头部(icosahedralcapsid)且观察到可收缩性尾部的结构的、在形态学上属于肌病毒科(myoviridae)的噬菌体(参见图1)。对噬菌体φcj28的核苷酸序列与其他噬菌体的解码的核苷酸序列之间的同源性进行比较，并且结果示于表1中。噬菌体φcj28示出在ph3.0至ph5.0下稳定的耐酸性，而不会失去活性(图4)，并且在耐热性方面，当暴露于60℃下30分钟时，噬菌体φcj28显示出约1个对数(1log)或更少的活性下降，并且当在相同温度下暴露60分钟或更长的情况下，噬菌体φcj28显示出约3个对数(3log)或更多的活性下降(图5)。噬菌体φcj28的dna碱基序列展示于序列表的序列号1中。所述噬菌体φcj28是由本发明人分离出的一种新型噬菌体，并且在2013年10月25日保藏于韩国微生物保藏中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)(首尔市西大门区弘济1洞361-221)，保藏号为kccm11466p。本发明的另一种实施方式提供用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物，其包含噬菌体φcj28作为有效成分。由于噬菌体φcj28展现出能够特异性杀死产肠毒素性大肠杆菌的抗菌活性，噬菌体φcj28能够被用于预防或治疗由感染产肠毒素性大肠杆菌而引起的疾病。待被用噬菌体φcj28预防或治疗的由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的例子包括但不限于大肠杆菌病(colibacillosis)、特别是猪大肠杆菌病(colibacillosisinpigs)。本文中，术语“大肠杆菌病”指的是由于动物体内感染致病性大肠杆菌而发生的疾病，并且其症状包括败血症、腹泻(新生期腹泻和断奶后腹泻)、毒血症(水肿和脑脊髓血管病)等。其中，败血症是具有极高死亡率的急性全身感染，其主要发生在出生后两到三天内的新生期。腹泻是经常在一周至两周龄内的哺乳期间发生以及在断奶后立即发生的肠道感染症状，其是死亡或发育障碍的一个原因。毒血症主要发生在8周至12周龄的仔猪断奶后，并且经常可在出现水肿和神经症状后引起猝死。本文中，术语“预防”指的是通过给动物施用噬菌体φcj28和/或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物抑制相应疾病或者延缓相应疾病发生的所有措施。本文中，术语“治疗”指的是通过给动物施用噬菌体φcj28和/或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物改善或减轻已感染的相应疾病的症状的所有措施。根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物可以包含5×102pfu/ml至5×1012pfu/ml、具体而言1×106pfu/ml至1×1010pfu/ml的噬菌体φcj28。根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且可以与载体一起配制以提供食品、药物、用于饲料的添加剂或用于饮用水的添加剂等。本文中，术语“药学上可接受的载体”指的是不刺激生物体并且不抑制给药化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。适用于该实施方式的载体的类型不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何药学上可接受的载体。载体的例子可以包括但不限于，盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。这些载体可以单独使用或两种以上混合使用。此外，根据需要，可以向根据本发明的组合物中添加其他常见添加剂，例如抗氧化剂、缓冲溶液和/或抑菌剂，并且还可以向根据本发明的组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂，来配制可注射制剂(例如水溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物的给药方法不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何方法。给药方法的非限制性示例可以包括口服给药或肠胃外给药。用于口服给药的剂型的非限制性示例可以为锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、片剂、水溶性悬浮液、油性悬浮液、配制粉末、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆或酏剂等。为了将根据该实施方式的组合物配制成诸如片剂或胶囊的剂型，还可以包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素和明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠和聚乙二醇蜡；等等，并且对于胶囊剂型来说，除了上述物质外，还可以进一步包含液体载体(例如脂肪油)等。肠胃外给药该实施方式的组合物的方法可以使用例如静脉内给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药或局部给药等，此外，可以使用将所述组合物涂覆或喷射到疾病部位的方法，但不限于此。为了配制肠胃外给药剂型，例如可以将该实施方式的组合物配制成用于注射的剂型，例如皮下注射、静脉注射和肌肉注射；栓剂；或者用于喷雾的剂型，例如气雾剂，从而允许通过呼吸器吸入，但不限于此。为了配制用于注射的剂型，可以将该实施方式的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中混合，以制备溶液或悬浮液，该溶液或悬浮液被配制成用于单位施用的剂型，例如安瓿或小瓶。当组合物被配制成用于喷雾的剂型(诸如气雾剂)时，组合物可以与推进剂等一起与添加剂配制，以使分散于水中的浓缩物或者润湿粉末分散于其中。除了配制组合物的方法、给药方法、给药时间和/或给药途径外，根据不同的因素，例如作为给药对象的动物的年龄、体重和性别、疾病症状的程度、所摄入的食物、排泄速率等，改变根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的组合物的适当的涂覆、喷射或给药量。而且，本领域技术人员能够容易地确定和指定对所预期的治疗有效的给药量。本发明的另一实施方式提供包含噬菌体φcj28作为有效成分的抗生素。本文中，术语“抗生素”指的是以药物形式施用于包括人的动物并具有杀灭细菌的功效的制剂，而且其被用作防腐剂、杀菌剂和抑菌剂的总称。该实施方式的包含噬菌体φcj28作为有效成分的抗生素所具有的效果是：与现有抗生素相比，该抗生素相对于产肠毒素性大肠杆菌的特异性非常高，并因此仅杀死特定的致病细菌，但不杀死有益细菌；并且该抗生素不引发耐药性，这使得与现有抗生素相比产品市场寿命延长。本发明的另一实施方式提供饲料添加剂或饮用水添加剂，其包含噬菌体φcj28作为有效成分。饲料添加剂或饮用水添加剂可以通过如下来使用：使用噬菌体φcj28或包含其的组合物分别制备饲料添加剂或饮用水添加剂，并将饲料或饮用水与添加剂混合，或者在制备饲料或饮用水的过程中直接添加噬菌体φcj28或包含其的组合物。以根据该实施方式的饲料添加剂或饮用水添加剂的形式使用的噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物可以是液体形式或干燥形式，例如干燥粉末形式。例如，基于饲料添加剂的重量，根据本发明的噬菌体φcj28可以以粉末形式、以0.05重量％(wt％)至10wt％、具体地0.1wt％至2wt％的组分比混合。用于干燥根据该实施方式的饲料添加剂或饮用水添加剂以得到干燥粉末的方法不受特别限制，并且可以采用本领域中常用的任何方法。干燥方法的例子可以包括通风干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于此。这些方法可以单独使用或者两种以上组合使用。根据该实施方式的饲料添加剂或饮用水添加剂还可以包含其他非致病性微生物。微生物可以选自由如下组成的组：枯草杆菌，例如能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖基转移酶的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；乳酸菌，例如在厌氧条件(例如牛的胃)下具有生理活性和有机物分解能力的乳杆菌(lactobacillussp.)；丝状菌，例如米曲霉(aspergillusoryzae)，其具有增加家畜的体重、增加牛奶产量以及增加饲料的消化吸收率的效果；以及酵母，例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，但不限于此。这些微生物可以单独使用或两种以上组合使用。根据需要，根据该实施方式的包含噬菌体φcj28作为有效成分的饲料添加剂或饮用水添加剂可以进一步包含其他添加剂。可用的添加剂的非限制性示例可以为为了防止饲料或饮用水质量下降而添加的粘合剂、乳化剂、防腐剂等；为了增加饲料或饮用水的效用所添加的氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白含氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、萃取剂或寡糖等；除此之外还可以包括饲料混合剂等。这些添加剂可以单独使用或两种以上组合使用。基于100重量份的饲料，根据本发明的饲料添加剂可以以0.05重量份至10重量份、具体地0.1重量份至2重量份的量存在。基于100重量份的饮用水，根据本发明的饮用水添加剂可以以0.0001重量份至0.01重量份、具体地0.001重量份至0.005重量份的量存在。在这些范围内，添加剂允许噬菌体φcj28对抗产肠毒素性大肠杆菌的活性被充分显示出。本发明的另一实施方式提供通过向饲料或饮用水添加包含噬菌体φcj28作为有效成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或者向饲料或饮用水中直接添加噬菌体φcj28制备得到的饲料或饮用水。在该实施方式中使用的饲料不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何饲料。饲料的非限制性示例可以为植物性饲料，如谷物、根菜、食品加工副产物、藻类、纤维、医药副产物、油脂、淀粉、粕类或谷物的副产物等；和动物性饲料，如蛋白质、无机物、油脂、矿物质、油脂、单细胞蛋白和动物性浮游生物或食品。这些饲料可以单独或两种以上组合使用。在该实施方式中使用的饮用水不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何饮用水。本发明的另一实施方式提供包含噬菌体φcj28作为有效成分的消毒剂或洗涤剂。消毒剂或洗涤剂的剂型不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何剂型。为了去除产肠毒素性大肠杆菌，可以将消毒剂喷洒于动物的活动区域、屠宰场，死亡区域、烹饪场所和烹饪设备等，但不限于此。洗涤剂可以被用于洗涤暴露于或可能暴露于产肠毒素性大肠杆菌的动物的皮肤表面或身体各部位等，但不限于此。本发明的另一实施方式提供使用噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物预防或治疗由产肠毒素性大肠杆菌引起的传染病的方法。具体而言，该实施方式的预防方法或治疗方法包括向感染产肠毒素性大肠杆菌或具有感染产肠毒素性大肠杆菌的危险的非人类对象给药药学有效量的噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物的步骤。每天噬菌体φcj28或包含其的组合物的合适总量可以由医生在适当的医学判断范围内确定，这对于本领域技术人员来说是明显的。噬菌体φcj28或包括噬菌体φcj28作为有效成分的组合物针对特定动物的具体的药学有效量可以通过考虑如下内容来确定：要实现的反应的种类和程度，相应个体的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食，噬菌体φcj28或包括其的组合物的给药时间和给药途径，以及组合物的分泌率，治疗时期等，并且根据包含同时使用或者不同时使用的其他药物组合物的成分的各种因素和在医学领域中公知的相似因素，来改变上述具体的药学有效量。噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物可以以药物制剂的形式喷雾式鼻腔给药至动物或者直接添加到动物的饲料或饮用水并使动物摄食该饲料或饮用水而给药至动物，并且可以以饲料添加剂或饮用水添加剂的形式与饲料或饮用水混合，然后给药至动物。噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物的给药途径和给药方法不受特别限制，并且可以使用任何给药途径和给药方法，只要该给药允许噬菌体φcj28或包含其的组合物到达相应的组织即可。即，噬菌体φcj28或包含噬菌体φcj28作为有效成分的组合物可以通过各种口服途径或非肠道途径来给药，该给药途径的非限制性示例可以为口服给药、直肠给药、局部给药、静脉内给药、腹腔内给药、肌内给药、动脉内给药、经皮给药、鼻内给药和吸入给药。下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于示例性地说明本发明，而不用于限制本发明的范围。[实施例1]–感染产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体的分离<实施例1-1>噬菌体筛选和单噬菌体分离将从忠清道洪城郡广川区的samhwawonjong(三和原种)公司农场区的猪粪和环境样品获得的50ml样品在4000rpm的转速下离心分离10分钟，然后将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤，以制备样品溶液，使用该样品溶液执行顶层琼脂法(softagaroverlaymethod)。顶层琼脂法是指使用在顶层琼脂(使用0.7％琼脂放置在固体培养基上)上生长的宿主细胞观察噬菌体溶菌的方法。具体而言，将150μl的由首尔大学兽医学院的兽医传染病实验室分离的产肠毒素性大肠杆菌(2618)的振荡培养液(od600＝2)和2ml的10×lb培养基(10g/l的色氨酸；5g/l的酵母提取物；10g/l的nacl)与18ml的经过滤的样品溶液混合，然后在30℃下培养18小时，并将所获得的培养液在4000rpm的转速下离心分离10分钟，并且将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤。随后，将3ml的0.7％(w/v)琼脂和150μl的产肠毒素性大肠杆菌(2618)的振荡培养液(od600＝2)的混合液倒在lb平板培养基上并使其固化，向其逐滴添加10μl的样品溶液，然后在30℃下培养18小时，从而确认形成溶菌斑。由于已知每个溶菌斑均存在一种噬菌体，发明人尝试从所形成的溶菌斑分离单一的噬菌体。具体而言，将溶菌斑添加至400μl的sm(悬浮培养基)溶液(5.8g/l的nacl；2g/l的mgso47h2o；50ml的1m三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl，ph7.5))，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。随后，将100μl的噬菌体溶液与5ml的0.7％(w/v)琼脂和150μl的产肠毒素性大肠杆菌(2618)的振荡培养液(od600＝2)混合，并使用直径为150mm的lb平板培养基执行顶层琼脂法，其中进行培养直至完全溶菌。培养完成后，向lb平板培养基添加5ml的sm溶液，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。回收所述溶液并添加1％(v/v)氯仿，并混合10分钟，然后在4000rpm的转速下离心分离10分钟，从而获得上清液，将该上清液通过0.45μm过滤器过滤，从而获得最终试样。<实施例1-2>噬菌体的大规模培养和纯化使用产肠毒素性大肠杆菌(2618)大规模培养在实施例1-1中获得的噬菌体，然后从中纯化噬菌体。具体而言，振荡培养产肠毒素性大肠杆菌(2618)，并以1.0×1010cfu分株，在4000rpm的转速下离心分离10分钟，然后使其再悬浮于4ml的sm溶液中。在该悬浮液中以1.0×107pfu接种所述噬菌体，滴定所述噬菌体至感染复数(multiplicityofinfection，moi)＝0.001后，在室温下放置20分钟。接着，将其接种在150ml的lb培养基中，并在30℃培养5小时。培养完成后，添加氯仿最终体积的1％的体积(v/v)，接着搅拌20分钟，向其中以1μg/ml的最终浓度分别添加作为限制酶的脱氧核糖核酸酶i(dnasei)和核糖核酸酶a(rnasea)，并在30℃下放置30分钟。随后，分别以1m和10％(w/v)的最终浓度添加氯化钠和聚乙二醇，并在4℃下放置3小时，然后在4℃和12000rpm的转速下离心分离20分钟，从而获得沉淀物。使获得的沉淀物悬浮在5ml的sm溶液中，在室温下放置20分钟，然后向其中添加1ml的氯仿并搅拌，在4℃下以4000rpm的转速离心分离20分钟，从而获得上清液。将该上清液通过0.45μm过滤器过滤，然后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)执行超离心分离(35000rpm，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体。本发明人从猪粪收集样品，并从该样品分离出对产肠毒素性大肠杆菌具有特异性杀死能力的噬菌体，将该噬菌体命名为“噬菌体φcj28”并于2013年10月25日保藏于韩国微生物保藏中心(首尔市西大门区弘济1洞361-221)，保藏号为kccm11466p。<实施例2>φcj28的形态检查将实施例1中所纯化的噬菌体φcj28稀释于0.01％明胶溶液中，然后用2.5％戊二醛溶液固定。将所获得的噬菌体滴加至涂覆有碳的云母板(大约2.5mm×2.5mm)上，驯化10分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤。将碳膜插入铜网中，用2％乙酸铀酰染色60秒，干燥，并在透射电子显微镜(jem-1011，80kv，放大倍数为200000)下检查(图1)。图1示出噬菌体φcj28的透射电子显微镜照片，其中观察到噬菌体φcj28在形态学上具有正二十面体头部和可收缩性尾部，由此可知噬菌体φcj28属于肌病毒科。<实施例3>φcj28的全基因组dna的尺寸分析从实施例1中纯化的噬菌体φcj28中提取基因组dna。具体而言，向经纯化的噬菌体φcj28的培养液中，添加20mm乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)、50μg/ml蛋白酶k和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)，并在50℃下放置一个小时，向其中添加等体积的苯酚(ph8.0)并搅拌，随后在室温和12000rpm的转速下离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与等体积的pc(苯酚:氯仿＝1:1)混合，随后在室温和12000rpm的转速下离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与等体积的氯仿混合，随后在室温和12000rpm的转速下离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与基于总体积的10％(v/v)的3m乙酸钠混合，随后添加2倍体积的95％冷乙醇，混合并在-20℃下放置1小时。在0℃和12000rpm的转速下将所获得的物质离心分离10分钟，从中去除上清液以获得沉淀物，将沉淀物溶解于50μl的te缓冲溶液(tris-edta,ph8.0)中。将提取的dna稀释10倍，然后通过在od260下测量吸光度来确定dna的浓度。接下来，将1μg的dna加载到1％脉冲场凝胶电泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，pfge)琼脂糖凝胶上，并使用伯乐(biorad)公司pfge系统7号程序(尺寸范围从25kb到100kb；转换时间斜度(switchtimeramp)从0.4秒到2.0秒，线性；正向电压，180v；反向电压，120v)在室温下进行电泳20个小时(图2)。图2是噬菌体φcj28的基因组dna的电泳照片，并且可以看出，噬菌体φcj28的基因组dna尺寸为98kb以上。在图2中，m为作为用于尺寸测量的基准的dna。<实施例4>φcj28的蛋白质图谱分析将15μl的经纯化的噬菌体φcj28溶液(1010pfu/ml效价)与3μl的5×sds样品溶液混合，然后煮沸5分钟，以进行12％sds-page(图3)。图3是示出以噬菌体φcj28为对象进行的sds-page结果的电泳照片，并且可以看出主要蛋白质具有约67.9kda、约50.8kda和约6kda的尺寸。<实施例5>φcj28的遗传特性分析为了确定实施例1中所纯化的噬菌体φcj28的遗传特性，使用flxtitaniumsequencer(roche公司)作为基因分析仪来分析噬菌体φcj28的dna。在macrogen公司使用gs和denovoassemblersoftware(roche公司)重组基因。使用genemark.hmm,glimmerv3.02和fgenesb软件执行开放读码框架(openreadingframe)。使用blastp和interproscan对读码框架的名称进行命名。噬菌体φcj28的核苷酸序列显示出与之前报道的噬菌体(肠杆菌噬菌体bp7)的核苷酸序列相似性，但可以看出没发现其中所有片段100％一致的噬菌体。因此，可以看出，该噬菌体是新分离的噬菌体。下表1示出了噬菌体φcj28的核苷酸序列与现有技术中之前报道的噬菌体的解码的核苷酸序列之间的比较结果。表1使用基因分析仪分析所制备的噬菌体φcj28的dna的全核苷酸序列结果与序列号1相同。<实施例6>φcj28的ph稳定性研究为了鉴定噬菌体φcj28是否能够在低ph(如肠胃内)下保持稳定性，在多种ph(ph2.0、3.0、4.0、5.0)下执行稳定性研究实验。为了该实验，分别以0.2m的浓度制备多种ph溶液(乙酸钠缓冲溶液(ph4.0和ph5.0)和柠檬酸钠缓冲溶液(ph2.0和ph3.0))。将180μl的各ph溶液与20μl的具有2.9×109pfu/ml效价的噬菌体溶液混合，以允许每个ph溶液具有1m的浓度，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。对于对照组，通过相同的方法将20μl的具有2.9×109pfu/ml效价的噬菌体溶液与180μl的sm溶液混合，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。此后，分阶段地稀释这些溶液，并且利用顶层琼脂法分别将10μl各阶段的稀释液在30℃下培养18小时，通过是否溶菌来确定效价(图4)。图4示出了噬菌体φcj28的耐酸性的实验结果。在图4中，可以看出与对照组相比噬菌体φcj28在ph3.0至ph5.0下没有失去其活性且保持稳定。<实施例7>噬菌体φcj28的热稳定性研究如果在噬菌体的众多剂型中，噬菌体被配制成饲料添加剂，在配制过程中可产生热量，因而为了确定噬菌体的热稳定性进行如下实验。具体而言，将200μl的具有2.9×108pfu/ml浓度的噬菌体φcj28溶液在60℃下分别放置0分钟、30分钟、60分钟和120分钟。此后，将获得的实验培养液分阶段地稀释，并且利用顶层琼脂法分别将10μl各阶段的稀释液在30℃下培养18小时，通过是否溶菌来确定效价(图5)。图5示出了噬菌体φcj28的耐热性的实验结果。如在图5中所示，可以看出噬菌体φcj28在60℃下暴露30分钟时示出约1个对数(1log)以下的活性损失，并且当噬菌体φcj28暴露60分钟或更长时，活性损失3个对数或更多。<实施例8>针对野生型分离菌株产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体φcj28的感染范围研究除了本实验中所使用的产肠毒素性大肠杆菌(2618)外，还对99株由首尔大学兽医学院、建国大学兽医学院和韩国动植物检疫局(kapqa)分离的野生型分离菌株(即产肠毒素性大肠杆菌)，确认噬菌体φcj28是否具有溶菌活性。分离的菌株由37株f-血清型f4型、30株f5型、7株f6型、20株f18型和5株其他菌株组成。具体而言，将150μl的每个菌株的振荡培养液(od600＝2)混合，并向其滴加10μl的具有109pfu/ml效价的噬菌体φcj28溶液，且通过在30℃下进行顶层琼脂法18小时来培养，观察是否形成溶菌斑。结果示于表2中。表2如表2中所示，噬菌体φcj28展现出感染f-血清型f4、f5、f6、f18型的能力，这些是在一般的养猪场中引起猪腹泻的主要病原性细菌，因此预期展现出优异的功效。序列目录freetext(自由文本)在所附的序列表中提供。申请人或代理人档案号p14-5112国际申请号关于微生物或其他生物学物质的保藏的说明(pct细则13之二)pct/ro/134表(1998年7月，2004年1月再版)序列表<110>cj第一制糖株式会社<120>新型噬菌体以及包含其的组合物<130>p14-5112<150>kr10-2014-0042911<151>2014-04-10<160>1<170>patentinversion3.2<210>1<211>171499<212>dna<213>新型噬菌体cj28<400>1aaatacgttgggtccaacccattgaatatgcaaccattatatcactcatttcaataagcg60ttttggctgcttcaaaagtcattacattagaggtttccgctgtttgggtgaatttaccgt120ccatggagtggatataatggtcataatgaatctgggtatcttgctcgtttaaatcaaact180tgacaaagcaacgtttttcctcggacaatccacgaacacggttagtaatagtatcccaat240attcatcgatgtaaataccttcaagagaaaaagcttcatgctcgttaagattagacttga300caatttcaataatatctgaaggcttaagacctgattcaagaagctcttggattttagcca360atttctcagcattgccttgagggtccattttatcaaattttttagcttcttcaaaatgtt420gctcagggcgagcactcacacctttaccaaagtagaaaggttttttgttttcatctacta480aacgatatacctgataaattgtttcttgattgtaagccattttaaatctcctttagttga540taggtctatagtatcatgcctacaggagatgtaaactgattttataaatattaatttaac600aggaggataacatgggcagtattttttaccaaatctggaaattggccgaaaagaaagaca660agaaaatgatgttaggttttcttgcactagatgtattcctttggaatcttctggtagtcc720ctgtagccgctagtcaaggtgtaattttaccagcggttacaatggagcacgtgttaagca780tagttgggttctttagcggaattcctgcctaaatcttggaatattttgaaagtctcattt840ttgccattaaaccttgggctatattagctttcatatatgccagtacatcatttatatcgg900ctttatctttcataaccatatcatttatatctttagaaggccatggggccttgtcccaga960atagaaccctttcgccagcatcaactaatcgttgcatacgcttaattgtgtcaggatggc1020ggggttcattgtccattacccaggcacgagtttctttacatggaactatagccaagtcca1080atgacccaccagtaattgctattgcattcggtacgaataatgaatcgataggaccttcca1140ttacccacaccaactgacgttcgtcaactgtatccattccatatatttttgtagcttggt1200catgagcttttattgtaatatatttttgtggagcgtctttacgtaaggctcgaccctgaa1260aactttcaatttgtttattcttattgaaaattggaataaccaaacgaggctcaggcattt1320ctttagaataggtccctggattgacagagttcaccaatgcaggccattctttagtaaacc1380acagccggttccatttgttttcaggaatgcaacgtaacgtcacatattttataataggat1440ggtccttcggcattctatctaatcgttcacagaaattaagcttttcgatgacaggcatct1500tagctttaattttttcagatatctccaccttaggtgcagcttgtctcccgaacgattgct1560ctttatgtttctcaagaatatattcacgatataaatcaggctcatattcgtatagatact1620tcttaattcctgctgaataatcacagttaaaacagtgcagcataatagagccgtcattgg1680caggataggcccaaaaacgagctttgttctcatctttttgggagtcaccgcatacacgac1740aacggcagtttaatttaaaatcactaccagttacttgtctgaatttaggttggtaattca1800aggcacgtacagcaaattctttatcgacatatgacattatttttccttgggccctaaatt1860aatagagccattatatcattcgttttcggatttttctttacgctttttagatgggatttg1920ttcaggccctttgttgacgaccgcgcctgaggtagttccggaggcaat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