本发明涉及微生物混合培养物，使用所述微生物混合培养物来生产有机化合物的方法，和所述微生物混合培养物的用途。特别地，所述微生物混合培养物至少包含产乙酸微生物和非产乙酸微生物。
发明背景
使用二氧化碳作为碳源以用于通过使用微生物学过程来合成有机化合物是本领域中众所周知的。通常，所述方法包括两个互补的代谢途径，其中一个牵涉乙酸或其盐和/或乙醇的产生，和另一个将该乙酸或其盐和/或乙醇转化为有机化合物。本领域中已知的方法试图在重组细胞中组合这两个来自不同生物的互补的代谢途径以用于生产有机物质。
这提出了几个问题，因为在该方法中所使用的每种生物是特化的并且需要特殊的条件来发挥作用和实施独个的代谢反应。因此，组合这些生物来生产有机化合物是一项困难的任务，因为所述生物当它们将不能够在最佳条件下工作时不是那么有效。
因此，目前可得的用于综合碳源以生产有机化合物的方法使用两步工艺过程，其中允许每种生物在其最佳条件下执行其功能。这些两步工艺过程通常使用两个室，其中每个室具有在其最佳条件下的生物以用于实施特定的代谢反应，并且第一室的产物以没有残留的第一生物的方式被转移至第二室。该工艺过程是麻烦的并且通常是成本更高的，因为很大部分的来自第一室的所得产物可能在转移至第二室的过程中丢失。该两步工艺过程通常也是低效的，因为需要花时间来允许一条代谢途径完成并将第一所得产物转移至第二室以便进行第二代谢途径。WO2013167663和WO2013036147两者都描述了用于通过使用两步工艺过程来生产特定烃类的方法。
存在已知的和使用了的备选方法，其中通过发酵参数的特殊选择，CO2被已知能够固定CO2的微生物用作碳源，从而合成所希望的简单有机物质，例如乙醇、正丁醇或2,3-丁二醇。例如，WO200068407描述了使用产乙酸细菌来生产乙醇，和WO2012024522使用产乙酸细菌用于生产丁二醇。
但是，大多数所描述的工艺过程具有产率低和方法低效的缺点。
本发明的目标是提供一种可以克服现有技术中的至少一个缺点的工艺过程。
发明描述
本发明提供了在权利要求书中所定义的混合细胞培养物，所述培养物的方法和用途。
本发明的一个优点可以是，可以使用有利得多的作为原材料的CO2/CO混合物。这些各种各样的来源包括天然气、沼气、煤、石油、植物残留物等。
所述方法的另一个优点可以是高的碳产率。这通过所形成的CO2的回复而成为可能。即可以使CO2在第一阶段反应回到乙酸。
另一个优点可以在于关于所使用的发酵条件的更大的灵活性，因为可以相组合地使用任何产乙酸微生物和非产乙酸微生物用于不饱和或饱和的有机化合物的实际生产。
本发明的另一个优点可以是，由于产乙酸微生物可以在氧存在下发挥作用，和/或产生乙酸或其盐和/或乙醇，因此产乙酸微生物和非产乙酸微生物两者可以存在于均质混合物中以用于从碳源生产经取代和/或未取代的有机化合物。产乙酸微生物的该特征使得从碳源生产经取代和/或未取代的有机化合物成为一步工艺过程，其使得该工艺过程更有效和产率更大。令人惊讶地，由于产乙酸微生物的该优点，用于制备有机化合物的该一步程序可以在单个发酵罐中进行，而无需中间的分开步骤。通过使用该一步程序，还可以存在增加的最终产物浓度。
根据本发明的第一个方面，提供了在水性培养基中的第一和第二微生物的混合培养物，其中
-所述第一微生物可以是能够将包含CO和/或CO2的碳源转化为乙酸或其盐和/或乙醇的产乙酸微生物和/或自养地生长的细胞；
-所述第二微生物可以是能够代谢乙酸或其盐和/或乙醇的非产乙酸微生物；和
-所述第一和第二微生物可以处于均质混合物中，
并且其中所述水性培养基包含氧。
在本文中所使用的术语“均质混合物”是指在培养基中均一地分布的微生物的混合物。特别地，所述混合物可以包含至少两种在培养基中均匀地分布的微生物：产乙酸微生物和非产乙酸微生物。在一个实例中，在所述混合物中可以存在大约相等数目的产乙酸微生物和非产乙酸微生物。在另一个实例中，在所述混合物中可以存在相比于非产乙酸微生物而言更多的产乙酸微生物。在另外一个实例中，在所述混合物中可以存在相比于产乙酸微生物而言更多的非产乙酸微生物。在所有可能的实例中，所述微生物处于单一的均质混合物中，其中它们在整个该混合物中均一地分布。
在本文中所使用的术语“乙酸或其盐”是指乙酸及其盐两者，所述盐是不可避免地产生的，这是因为正如本领域中已知的，由于所述微生物在水性环境中工作，因而在所存在的盐和酸之间总是存在平衡。
术语“第二微生物”是指与根据本发明的任一方面的“第一微生物”不同的微生物。因此，根据本发明的任一方面，所述第一和第二微生物是不同的。
根据本发明的第二个方面，提供了生产至少一种有机化合物的方法，所述方法包括使在水性培养基中的以均质混合物形式的第一和第二微生物的混合培养物与碳源和氧相接触，其中
-所述第一微生物为能够将碳源转化为乙酸或其盐和/或乙醇的产乙酸微生物；和
-所述第二微生物为能够将乙酸或其盐和/或乙醇代谢为所述有机化合物的非产乙酸微生物。
根据本发明的任一方面的水性培养基可以包含氧。可以通过本领域中已知的任何手段来将氧溶解在培养基中。特别地，氧可以以0.1-3mg/l的范围存在。特别地，氧可以以0.1-2.5mg/l、0.1-2mg/l、0.1-1.5mg/l或0.5-2.0mg/l的范围存在。
特别地，可以以连续气流向所述水性培养基提供氧。在所述气流中的氧浓度可以以小于在所述气流中总气体量的21重量％存在。特别地，氧可以以0.01-10重量％的浓度范围，以0.05-10重量％、0.1-10重量％、0.1-9重量％、0.05-8重量％的范围，特别地以0.05-6重量％的范围存在。特别地，当在气相中O2的比例在0.05％和6％之间时，所述产乙酸微生物是特别合适的。更加特别地，当通过具有小于总气体的21重量％的氧浓度(在0.05-6重量％的范围内)的气流来供给氧时，根据本发明的任一方面的第一和第二微生物能够在所述水性培养基中最佳地工作。
在本文中所使用的术语“产乙酸微生物”是指这样的微生物，其能够实施Wood-Ljungdahl途径并因此能够将CO、CO2和/或氢转化为乙酸或其盐。这些微生物包括以其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径但由于基因工程改造而获得了该性状的微生物。所述产乙酸微生物可以是可以自养地进行培养的任何微生物。实例包括但不限于：潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum)(DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum)(DSM 4132)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)第446号物种(Morinaga等人,1990,J.Biotechnol.,第14卷,第187-194页)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)(DSM 1030)、巴克斯碱棒菌(Alkalibaculum bacchi)(DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(DSM 4304)、产生布劳特氏菌(Blautia producta)(DSM 2950，以前称为产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)，以前称为产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus))、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)(DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)(DSM 1496)、自养产乙烷梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、食羧梭菌(Clostridium carboxidivorans)(DSM 15243)、考斯凯特梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC编号PTA-10522)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)(DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(DSM 1288)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(DSM 13528)、扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)(DSM 6539)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)(DSM 12182)、拉格斯代尔梭菌(Clostridium ragsdalei)(DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)(DSM 757)、梭菌属(Clostridium)物种ATCC 29797(Schmidt等人,1986,Chem.Eng.Commun.,第45卷,第61-73页)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(DSM 6115)、热苯甲酸脱硫肠状菌热互养共栖亚种(Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.thermosyntrophicum)(DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)(DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A(DSM 2834)、穆尔氏菌属(Moorella)物种HUC22-1(Sakai等人,2004,Biotechnol.Let.,第29卷,第1607-1612页)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)(DSM 521，以前称为热醋梭菌(Clostridium thermoaceticum))、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)(DSM 1974)、普氏醋菌(Oxobacter pfennigii)(DSM 322)、食空气鼠孢菌(Sporomusa aerivorans)(DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)(DSM 2662)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)(DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)(DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)(DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030，以前称为凯伍产醋菌(Acetogenium kivui))。在相同的背景下，术语“非产乙酸微生物”是指任何不能够实施Wood-Ljungdahl途径的微生物。
特别地，术语“非产乙酸微生物”可以是指本领域中已知的任何非产乙酸微生物。更特别地，在本文中所使用的该术语是指可以落在耐氧微生物、兼性厌氧生物、需氧微生物等类别之内的微生物。所述非产乙酸细菌可以选自由下列各项组成的组：阿尔法菌属物种(Alpha sp.)、透明浆果菌属物种(Perlucidibaca sp.)、发硫菌属物种(Thiothrix sp.)、紫色杆菌属物种(Janthinobacterium sp.)、海绵杆菌属物种(Spongiibacter sp.)、聚杆菌属物种(Congregibacter sp.)、缓慢嗜盐菌属物种(Salipiger sp.)、双岐嗜热菌属物种(Thermobifida sp.)、无氧杆菌属物种(Anoxybacillus sp.)、食琼脂菌属物种(Agarivorans sp.)、链带孢菌属物种(Desmospora sp.)、普罗威登斯菌属物种(Providencia sp.)、劳特洛普氏菌属物种(Lautropia sp.)、异常球菌属物种(Deinococcus sp.)、罗尔斯通氏菌属物种(Ralstonia sp.)、变形菌属物种(Proteus sp.)、亮发菌属物种(Leucothrix sp.)、硫单胞菌属物种(Thiomonas sp.)、奈瑟氏球菌属物种(Neisseria sp.)、鞘氨醇盒菌属物种(Sphingopyxis sp.)、芽孢八叠球菌属物种(Sporosarcina sp.)、圆杆菌属物种(Cyclobacterium sp.)、独岛菌属物种(Dokdonia sp.)、芽单胞菌属物种(Blastomonas sp.)、泥棒菌属物种(Lutibaculum sp.)、中根瘤菌属物种(Mesorhizobium sp.)、贝塔变形菌纲物种(Betaproteobacteria sp.)、盐红螺菌属物种(Halorhodospira sp.)、新鞘氨醇菌属物种(Novosphingobium sp.)、橙色杆状菌属物种(Sandarakinorhabdus sp.)、鞘氨醇菌属物种(Sphingobium sp.)、伽玛变形菌纲物种(Gammaproteobacteria sp.)、海单胞菌属物种(Marinomonas sp.)、阿菲波菌属物种(Afipia sp.)、红育菌属物种(Rhodoferax sp.)、脱氯单胞菌属物种(Dechloromonas sp.)、极单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、铁单胞菌属物种(Ferrimonas sp.)、厌氧粘杆菌属物种(Anaeromyxobacter sp.)、多核杆菌属物种(Polynucleobacter sp.)、嗜冷单胞菌属物种(Psychromonas sp.)、食酸菌属物种(Acidovorax sp.)、致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)、硝化杆菌属物种(Nitrobacter sp.)、海洋柄菌属物种(Oceanicaulis sp.)、红色杆菌属物种(Rubrobacter sp.)、土杆菌属物种(Solibacter sp.)、红假单胞菌属物种(Rhodopseudomonas sp.)、色盐杆菌属物种(Chromohalobacter sp.)、食螯合物菌属物种(Chelativorans sp.)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia sp.)、寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.)、海柄菌属物种(Maricaulis sp.)、栖碱湖菌属物种(Alkalilimnicola sp.)、蚯蚓肾杆菌属物种(Verminephrobacter sp.)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)、红螺菌属物种(Rhodospirillum sp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.)、红微菌属物种(Rhodomicrobium sp.)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、嗜酸菌属物种(Acidiphilium sp.)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)、棒杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、伊丽莎白金菌属物种(Elizabethkingia sp.)、螺旋体属物种(Spirochaeta sp.)、土壤杆菌属物种(Agrobacterium sp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)、博德特氏菌属物种(Bordetella sp.)、盐单胞菌属物种(Halomonas sp.)、光杆状菌属物种(Photorhabdus sp.)、洛克塔氏菌属物种(Loktanella sp.)、亮杆菌属物种(Leucobacter sp.)、贪铜菌属物种(Cupriavidus sp.)、申式菌属物种(Shinella sp.)、微红微菌属物种(Rubellimicrobium sp.)、发光杆菌属物种(Photobacterium sp.)、弧菌属物种(Vibrio sp.)、希瓦氏菌属物种(Shewanella sp.)、柄杆菌属物种(Caulobacter sp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)、游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)、待定的物种(Candidatus sp.)、微杆菌属物种(Microbacterium sp.)、栖苏打菌属物种(Nitrincola sp.)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)、卡斯泰拉尼氏菌属物种(Castellaniella sp.)、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium sp.)、假交替单胞菌属物种(Pseudoalteromonas sp.)、交替单胞菌属物种(Alteromonas sp.)、海洋弯曲菌属物种(Thalassolituus sp.)、薄膜杆菌属物种(Hymenobacter sp.)、副球菌属物种(Paracoccus sp.)、氢噬胞菌属物种(Hydrogenophaga sp.)、甲基养菌属物种(Methylibium sp.)、粒杆菌属物种(Granulibacter sp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas sp.)、库茨涅尔氏菌属物种(Kutzneria sp.)、诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)、小陌生菌属物种(Advenella sp.)、鞘氨醇单胞菌属物种、油螺菌属物种(Oleispira sp.)、根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella sp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、食烷菌属物种(Alcanivorax sp.)、梭菌属物种(Clostridium sp.)、贪噬菌属物种(Variovorax sp.)、嗜冷杆菌属物种(Psychrobacter sp.)、沙雷氏菌属物种(Serratia sp.)、清水氏菌属物种(Simiduia sp.)、极杆菌属物种(Polaribacter sp.)、罗尔斯通氏菌属物种、地芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)、硫碱弧菌属物种(Thioalkalivibrio sp.)、爱德华氏菌属物种(Edwardsiella sp.)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)、拟诺卡氏菌属物种(Nocardiopsis sp.)、戈登氏菌属物种(Gordonia sp.)、海洋单胞菌属物种(Oceanimonas sp.)、Rucella sp.、山丘单胞菌属物种(Collimonas sp.)、寡养菌属物种(Oligotropha sp.)、无色杆菌属物种(Achromobacter sp.)、标桩菌属物种(Stigmatella sp.)、泛菌属物种(Pantoea sp.)、草螺菌属物种(Herbaspirillum sp.)、华诊体属物种(Waddlia sp.)、莫拉氏菌属物种(Moraxella sp.)、红细菌属物种(Rhodobacter sp.)、黄杆菌科物种(Flavobacteriaceae sp.)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属物种(Lysinibacillus sp.)、紫色杆菌属物种、生丝单胞菌属物种(Hyphomonas sp.)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)、粘球菌属物种(Myxococcus sp.)、哈氏菌属物种(Hahella sp.)、科尔韦尔氏菌属物种(Colwellia sp.)、栖热菌属物种(Thermus sp.)、色杆菌属物种(Chromobacterium sp.)、迪基氏菌属物种(Dickey sp.)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、金黄杆菌属物种(Chryseobacterium sp.)、玫瑰单胞菌属物种(Roseomonas sp.)、致病杆菌属物种、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter sp.)、糖多孢菌属物种(Saccharopolyspora sp.)、埃米尼单胞菌属物种(Herminiimonas sp.)、弗兰克氏菌属物种(Frankia sp.)、芳香油菌属物种(Aromatoleum sp.)、解环菌属物种(Cycloclasticus sp.)、海鸥杆菌属物种(Laribacter sp.)、短芽孢杆菌属物种(Brevibacillus sp.)、赤细菌属物种(Erythrobacter sp.)、红嗜热菌属物种(Rhodothermus sp.)、罗讷河杆菌属物种(Rhodanobacter sp.)、囊硫菌属物种(Thiocystis sp.)、硫化杆菌属物种(Sulfobacillus sp.)、利夫森氏菌属物种(Leifsonia sp.)、海洋螺菌目物种(Oceanospirillales sp.)、马赛菌属物种(Massilia sp.)、莱茵海默氏菌属物种(Rheinheimera sp.)、莫里塔氏菌属物种(Moritella sp.)、安菲特里特菌属物种(Amphritea sp.)、船蛆杆菌属物种(Teredinibacter sp.)、草酸杆菌科物种(Oxalobacteraceae sp.)、茶山菌属物种(Dasani sp.)、盐田单胞菌属物种(Salinimonas sp.)、海洋细菌属物种(Marinobacterium sp.)、阿伦斯氏菌属物种(Ahrensia sp.)、巨大丝状菌属物种(Meganema sp.)、寡源杆菌属物种(Oligella sp.)、红长命菌属物种(Rubrivivax sp.)、栖冰菌属物种(Glaciecola sp.)、湖供养菌属物种(Lacinutrix sp.)、小月菌属物种(Microlunatus sp.)、栖等翅类菌属物种(Isoptericola sp.)、代尔夫特菌属物种(Delftia sp.)、嗜脂环化合物菌属物种(Alicycliphilus sp.)、海洋嗜热菌属物种(Marinithermus sp.)、热气杆菌属物种(Thermaerobacter sp.)、海洋小杆菌属物种(Marivirga sp.)、克洛诺斯杆菌属物种(Cronobacter sp.)、潘多拉菌属物种(Pandoraea sp.)、微携球菌属物种(Microbulbifer sp.)、韩国海洋研发所单胞菌属物种(Kordiimonas sp.)、产卟啉杆菌属物种(Porphyrobacter sp.)、肠杆菌属物种、适中杆菌属物种(Modestobacter sp.)、盐芽孢杆菌属物种(Halobacillus sp.)、固氮螺菌属物种(Azospirillum sp.)、别弧菌属物种(Aliivibrio sp.)、库克菌属物种(Kocuria sp.)、固氮弧菌属物种(Azoarcus sp.)、果胶杆菌属物种(Pectobacterium sp.)、洋芽孢杆菌属物种(Oceanobacillus sp.)、皮肤球菌属物种(Dermacoccus sp.)、短杆菌属物种(Brevibacterium sp.)、普罗威登斯菌属物种、科工研究理事会杆菌属物种(Cesiribacter sp.)、巴尔加瓦氏菌属物种(Bhargavaea sp.)、酸胞菌属物种(Acidocella sp.)、细胞和分子生物学中心菌属物种(Cecembia sp.)、金氏菌属物种(Kingella sp.)、慢生根瘤菌科物种(Bradyrhizobiaceae sp.)、布伦纳氏菌属物种(Brenneria sp.)、慢生根瘤菌科物种、栖热菌属物种、短波单胞菌属物种(Brevundimonas sp.)、不粘柄菌属物种(Asticcacaulis sp.)、小浴氏菌属物种(Kosakonia sp.)、韩国海洋研发所菌属物种(Kordia sp.)、别希瓦氏菌属物种(Alishewanella sp.)、列伊涅克岛菌属物种(Reinekea sp.)、洋杆菌属物种(Oceanobacter sp.)、海洋螺菌属物种(Oceanospirillum sp.)、硝化球菌属物种(Nitrococcus sp.)、甲基嗜酸菌属物种(Methylacidiphilum sp.)、固氮菌属物种(Azotobacter sp.)、副衣原体属物种(Parachlamydia sp.)、硫红螺菌属物种(Thiorhodospira sp.)、硫红球菌属物种(Thiorhodococcus sp.)、荚硫菌属物种(Thiocapsa sp.)、堆囊菌属物种(Sorangium sp.)、欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)、格里蒙氏菌属物种(Grimontia sp.)、弧菌目物种(Vibrionales sp.)、微颤蓝细菌属物种(Microscilla sp.)、交替单胞菌目物种(Alteromonadales sp.)、贝尔曼氏菌属物种(Bermanella sp.)和海神尼普顿杆菌属物种(Neptuniibacter sp.)。
非产乙酸微生物的一些实例可以包括但不限于：根霉素伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rhizoxinica)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、世纪红螺菌(Rhodospirillum centenum)、嗜热红螺菌(Rhodospirillum thermophilum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、栖树黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、乌代布尔红微菌(Rhodomicrobium udaipurense)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、波尔查诺假单胞菌(Pseudomonas bauzanensis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、加勒比海群岛伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caribensis)、杆菌属(Bacterium)Ec32(GI:610510261)、嗜甘氨酸棒杆菌(Corynebacterium glycinophilum)、按蚊伊丽莎白金菌(Elizabethkingia anophelis)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、霍氏博德特氏菌(Bordetella holmesii)、发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)、香港洛克塔氏菌(Loktanella hongkongensis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、动胶菌样申式菌(Shinella zoogloeoides)、中温微红微菌(Rubellimicrobium mesophilum)、明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、亚氯酸盐歧化假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)、沙班盐球形菌(Salinisphaera shabanensis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、皮特氏不动杆菌(Acinetobacter pittii)、医院不动杆菌(Acinetobacter nosocomialis)、幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、待定的竞争杆菌属物种(Candidatus Competibacter)、待定的积累杆菌属物种(Candidatus Accumulibacter)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、解单萜卡斯泰拉尼氏菌(Castellaniella defragrans)、草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、解脂假交替单胞菌(Pseudoalteromonas lipolytica)、食油海洋弯曲菌(Thalassolituus oleivorans)、水原薄膜杆菌(Hymenobacter swuensis)、嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)、贝塞斯达粒杆菌(Granulibacter bethesdensis)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、白色库茨涅尔氏菌(Kutzneria albida)、新星诺卡氏菌(Nocardia nova)、明斯特小陌生菌(Advenella mimigardefordensis)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、产三科森胶鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、南极油螺菌(Oleispira antarctica)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)、达当氏迪基氏菌(Dickeya dadantii)、待定的争斗杆菌属物种(Candidatus contendobacter)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、食琼脂清水氏菌(Simiduia agarivorans)、保护假单胞菌(Pseudomonas protegens)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)、利夫兰德分枝杆菌(Mycobacterium liflandii)、硝酸盐还原硫碱弧菌(Thioalkalivibrio nitratireducens)、鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、白色拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、马赛分枝杆菌(Mycobacterium massiliense)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、食聚异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)、Rucella pinnipedialis、食真菌山丘单胞菌(Collimonas fungivorans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、抗性棒杆菌(Corynebacterium resistens)、食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)、漫游泛菌(Pantoea vagans)、塞鲁普蒂卡草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、食油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)、嗜颗粒华诊体(Waddlia chondrophila)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、待定的微粉红螺菌属物种(Candidatus Puniceispirillum)、田鼠布鲁氏菌(Brucella microti)、黄杆菌科细菌、克罗彭施泰特氏棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、沙氏肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)、约什特氏红球菌(Rhodococcus jostii)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、济州岛哈氏菌(Hahella chejuensis)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、冷微红科尔韦尔氏菌(Colwellia 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orientalis)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、解珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、芳香固氮弧菌(Azoarcus aromaticum)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、易北河弧菌(Vibrio albensis)、支气管炎博德特氏菌、海底希瓦氏菌(Shewanella benthica)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)、弧菌目细菌、海洋微颤蓝细菌(Microscilla marina)、交替单胞菌目细菌、成束红球菌(Rhodococcus fascians)、红海贝尔曼氏菌(Bermanella marisrubri)、凯撒里亚海神尼普顿杆菌(Neptuniibacter caesariensis)、被膜假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tunicate)、布兰德列伊涅克岛菌(Reinekea blandensis)、嗜热微红微菌(Rubellimicrobium thermophilum)、玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)等。
特别地，所述非产乙酸细菌可以选自由下列各项组成的组：谷氨酸棒杆菌、玻利维亚盐单胞菌、大肠杆菌、钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌。
在本文中所使用的术语“需氧微生物”是指需要有氧条件(即在氧存在下)来进行生存和生长的微生物。“有氧条件”是指这样的在培养基中的氧浓度，其对于需氧微生物来说足够用作末端电子受体。此类微生物包括但不限于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、玻利维亚盐单胞菌、恶臭假单胞菌细胞。
在本文中所使用的术语“耐氧微生物”是指耐氧的厌氧细菌，其是以发酵类型的代谢为特征的特化的厌氧细菌。这些细菌仅通过发酵生存，不管在其环境中是否存在氧。特别地，耐氧微生物或厌氧生物不能使用氧来生长，但耐受其存在。示例性的耐氧的厌氧细菌包括但不限于脱硫单胞菌属(Desulfomonas)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、钩虫贪铜菌和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。
在本文中所使用的术语“兼性厌氧生物”是指这样的生物，其在如果氧存在时通过需氧呼吸来制造ATP，但其在如果氧不存在时能够转换为发酵或厌氧呼吸。兼性厌氧细菌的一些实例为葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、大肠杆菌、利斯特氏菌属物种(Listeria sp.)和奥奈达湖希瓦氏菌。某些真核生物也是兼性厌氧生物，包括真菌例如酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和许多水生无脊椎动物例如沙蚕(蠕虫)多毛纲动物。
根据本发明的任一方面的均质混合物可以具有培养物混合物。在一个实例中，所述均质混合物可以包含至少一种产乙酸生物，和至少需氧生物。在另一个实例中，所述混合物可以包含至少一种产乙酸微生物和耐氧生物，或者产乙酸微生物、需氧生物和耐氧生物，等等。技术人员将会能够改变在所述均质混合物中的细胞的类型以获得最好的产率。
所有百分比(％)为质量百分比，除非另有说明。
关于包含二氧化碳和/或一氧化碳的底物来源，技术人员将会理解，存在许多用于提供作为碳源的CO和/或CO2的可能来源。可以看出，实际上，作为本发明的碳源，可以使用任何这样的气体或任何这样的气体混合物，其能够向所述微生物供给足够量的碳，从而可以从CO和/或CO2的来源形成乙酸或其盐和/或乙醇。
通常，对于本发明的混合培养物，所述碳源包含至少50重量％，至少70重量％，特别地至少90重量％的CO2和/或CO，其中以“重量％”表示的百分比涉及对于在所述混合培养物中的第一微生物来说可用的所有碳源。
在根据本发明的任一方面的混合培养物中，可以提供碳材料来源。以气体形式的碳源的实例包括废气，例如合成气、烟道气和石油炼厂气(其由酵母发酵或梭菌发酵产生)。这些废气从含纤维素的材料的气化或煤的气化中形成。
在一个实例中，这些废气可以不必需地作为其他工艺过程的副产物而产生，而是可以特别地产生以用于与本发明的混合培养物一起进行使用。
根据本发明的任一方面，所述碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤的气化的副产物而产生。因此，根据本发明的任一方面的混合培养物的微生物可以能够将作为废产物的物质转化为有价值的资源。
在另一个实例中，合成气可以是广泛可得的、低成本的农业原材料的气化的副产物，其用于与本发明的混合培养物一起进行使用以生产经取代和未取代的有机化合物。
存在众多可以被转化为合成气的原材料的实例，因为几乎所有形式的植物均可以用于该目的。特别地，原材料选自由下列各项组成的组：多年生禾草例如芒属(Miscanthus)植物，玉米残留物，加工废料例如锯末，等等。
通常，合成气可以在干生物质的气化装置中获得，这主要通过热解、部分氧化和蒸汽转化，其中合成气的初产物为CO、H2和CO2。
通常，首先将从气化工艺过程获得的合成气的一部分进行加工以便优化产物产率，并避免焦油的形成。在合成气中的不希望的焦油和CO的裂化可以通过使用石灰和/或白云石来进行。这些工艺过程详细描述在例如Reed,1981中。
可以使用来源混合物作为碳源。
根据本发明的任一方面，可以与碳源一起供给还原剂，例如氢。特别地，当供给和/或使用CO和/或CO2时，可以供给该氢。在一个实例中，氢气是根据本发明的任一方面所存在的合成气的一部分。在另一个实例(其中在合成气中的氢气对于本发明的方法来说是不足的)中，可以供给额外的氢。
技术人员将会理解对于实施本发明的方法来说必需的其他条件。特别地，可以取决于所使用的第一和第二微生物来改变容器(例如发酵罐)中的条件。将条件改变成适合于所述微生物的最佳功能发挥在技术人员的知识范围之内。
在一个实例中，本发明的方法可以在具有5至8，5.5至7的pH的水性培养基中进行。压力可以在1和10巴之间。
特别地，所述水性培养基可以包含：氧，以及包含CO和/或CO2的碳源。更特别地，将氧和包含CO和/或CO2的碳源以连续气流提供给所述水性培养基。更加特别地，所述连续气流包含合成气和氧。在一个实例中，这两种气体均是同一流的组成部分。在另一个实例中，每种气体是提供给所述水性培养基的分开的流。这些气体可以是分割开的，例如通过使用开口进入所述水性培养基中的分开的喷嘴，玻璃料，在将气体供给到所述水性培养基中的管之内的膜，等等。
在根据本发明的任一方面的一个实例中，可以将合成气与氧气在被供给到所述水性培养基中之前相掺混。该掺混步骤可以改善在该反应中的效率和有机化合物的产生。本发明的方法的总效率、醇生产率和/或总碳捕获可以取决于在连续气流中CO2、CO、H2和O2的化学计量。所应用的连续气流可以具有O2、CO2和H2这样的组成。特别地，在连续气流中，O2的浓度范围可以在0.05-6重量％之内，CO2在大约10–50重量％之内，特别地为33重量％，和H2将会在44重量％至84重量％，特别地64-66.04重量％之内。更特别地，在连续气流中的气体浓度可以为4重量％的O2、32重量％的CO2和64重量％的H2。在另一个实例中，所述连续气流还可以包含惰性气体例如N2，以直至50重量％的N2浓度。
技术人员将会理解，可能需要监测在掺混之前所述流的组成和流速。掺混流的组成的控制可以通过改变组分流的比例以达到目标组成或所希望的组成来实现。掺混流的组成和流速可以通过本领域中已知的任何手段来进行监测。在一个实例中，调整该系统以连续监测至少两股流的流速和组成，并且将它们相组合以产生以具有最佳组成的连续气流的单个掺混底物流，和具有用于使经优化的底物流通过进入本发明的混合培养物中的器具。
特别地，可以在任何已知的生物反应器或发酵罐中使用具有下述组分的混合物以实施本发明的任一方面：第一微生物(产乙酸生物)，第二微生物(需氧地代谢乙酸或乙醇的生物)，氧与一氧化碳和/或二氧化碳和氢的混合物的气体混合物。
将CO2和/或CO转化为乙酸或其盐和/或乙醇(特别是乙酸或其盐)的微生物，以及用于实施该代谢反应的合适的程序和工艺过程条件，是本领域中众所周知的。此类工艺过程例如描述在WO9800558，WO2000014052，WO2010115054，Demler等人，Younesia等人，Morinaga等人，Li，Schmidt等人，Sim等人，Vega等人，Cotter等人和Andreesen等人中。
在根据本发明的任一方面的混合培养物中的第一微生物可以是至少一种产乙酸细菌。该组细菌为产乙酸的厌氧原核生物之一，其可以用作CO2的末端电子受体，由此形成乙酸或其盐或者乙醇。目前，本本领域中已知21种不同属的产乙酸细菌(Drake等人.,2006)，并且这些也可以包括一些梭菌(Drake&Kusel,2005)。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源，以氢作为能源(Wood,1991)。进一步地，还可以使用醇、醛、羧酸以及许多己糖作为碳源(Drake等人,2004)。导致乙酸或其盐形成的还原途径被称为乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径。
根据本发明的任一方面，所述第一微生物可以是从由下列各项组成的组中选择的产乙酸微生物：自养产乙烷梭菌DSMZ 19630、拉格斯代尔梭菌ATCC编号BAA-622、自养产乙烷梭菌、穆尔氏菌属物种HUC22-1、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、产生瘤胃球菌、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、普氏醋菌、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、噬乙酸甲烷八叠球菌、氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、库氏脱硫肠状菌、火球菌属(Pyrococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、食甲基丁酸杆菌ATCC 33266、蚁酸醋酸梭菌、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrukii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidoprprionici)、栖树丙酸螺菌(Proprionispera arboris)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobierspirillum succiniproducens)、嗜淀粉拟杆菌(Bacterioides amylophilus)、栖瘤胃拟杆菌(Becterioides ruminicola)、凯伍热厌氧菌、伍氏醋酸杆菌、潮湿厌氧醋菌、醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌、粘液真杆菌、产生消化链球菌、扬氏梭菌、梭菌属ATCC 29797和食羧梭菌(Clostridium carboxidivorans)。特别地，可以使用食羧梭菌的菌株ATCC BAA-624。更特别地，可以使用例如在U.S.2007/0275447和U.S.2008/0057554中所述描述的食羧梭菌的标注为“P7”和“P11”的细菌菌株。
另一种特别合适的细菌可以是扬氏梭菌。特别地，可以选择从由下列各项组成的组中选择的菌株用于用作在本发明的混合培养物中的第一生物：扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌COL和扬氏梭菌O-52。这些菌株例如描述在WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988和ATCC 55989中。
在一个实例中，在所述混合培养物中的第一微生物可以选自由下列各项组成的组：ATCC BAA-1772巴克斯碱棒菌、穆尔氏菌属物种HUC22-1、扬氏梭菌、拉格斯代尔梭菌和自养产乙烷梭菌。使用该微生物来生产乙醇和/或乙酸或其盐的方法公开在例如Saxena等人，Younesi等人，Sakai等人，Abrini等人，等等中。
特别地，所述第一微生物可以是在有氧条件下在第二非产乙酸微生物存在下有功能的。
根据本发明的任一方面，使乙酸或其盐和/或乙醇(尤其是乙酸或其盐)与在所述混合培养物中的第二微生物进行反应以产生至少一种经取代和/或未取代的有机化合物。所述第二微生物可以是其中发生乙醛酸循环以利用乙酸或其盐和/或乙醇(尤其是乙酸或其盐)的微生物。
特别地，所述第二微生物可以是非产乙酸的，并且可以是酵母、微观藻类和/或细菌。更特别地，所述第二微生物可以是经基因工程改造的菌株，其中相比于该生物的野生型而言，在微生物的遗传方面所述经取代和/或未取代的有机化合物的产率是特别地经优化的。在该背景下，所述第二微生物具有相比于其野生型而言增加的至少硫酯酶的活性。短语“具有相比于其野生型而言增加的活性”意指，所述微生物已经进行了基因工程改造从而具有该增加的活性。技术人员将会理解，在所述第二微生物中硫酯酶的过表达或者外源硫酯酶的表达可以是可应用的。特别地，所述硫酯酶可以选自酰基-ACP硫酯酶，EC 3.1.2.14或EC 3.1.2.22，和酰基-CoA硫酯酶，特别是EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22。可以在根据本发明的任一方面的另一个实例中使用的第二微生物的实例描述在WO2010118410、WO2010075483,、WO2008119082和WO2007136762中。这些文献关于这些硫酯酶公开了这些微生物。
技术人员将会理解对于所述第二微生物来说合适的靶分子和用于实施该工艺过程的条件。
更特别地，所述第二微生物可以是酵母，并且所述酵母可以是含油酵母和/或可以选自由下列各项组成的组：假丝酵母属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、拟青霉属(Paecilomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、糖酵母属(Saccharomyces)、丝孢酵母科(Trichosporonaceae)、耶氏酵母属(Yarrowia)和隐球酵母属(Cryptococcus)。特别地，所述酵母可以选自由下列各项组成的组：热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、皮肤丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、圆酵母状红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)、弯曲隐球酵母(Crytococcus curvatus)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
所述第二微生物可以是微观藻类，并且所述微观藻类可以是寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)。
在另一个实例中，所述第二微生物可以是细菌，并且所述细菌可以选自由下列各项组成的组：葡萄球菌属物种、链球菌属物种、埃希氏菌属物种、利斯特氏菌属物种、罗尔斯通氏菌属物种、希瓦氏菌属物种、脱硫单胞菌属物种、丁酸弧菌属物种、真杆菌属物种、乳杆菌属物种、梭菌属物种、瘤胃球菌属物种、棒杆菌属物种、盐单胞菌属物种和丙酸杆菌属物种。特别地，所述细菌可以选自由下列各项组成的组：谷氨酸棒杆菌、玻利维亚盐单胞菌、大肠杆菌、钩虫贪铜菌、富养罗尔斯通氏菌、克氏梭菌和恶臭假单胞菌。
更特别地，所述第二微生物可以选自由下列各项组成的组：谷氨酸棒杆菌、寇氏隐甲藻、宛氏拟青霉、玻利维亚盐单胞菌、弯曲隐球酵母、大肠杆菌、钩虫贪铜菌、克氏梭菌、恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母。
根据本发明的任一方面的方法可以是尤其有利的，因为不存在移出中间产物(乙醇和/或乙酸或其盐)以与用于发酵的第二微生物进行反应的额外步骤。该反应的所有部分在单个容器内发生，从而允许更有效的工艺过程和更少的在移出步骤中中间产物的损耗。
根据本发明的任一方面，乙酸或其盐和/或乙醇(尤其是乙酸或其盐)可以与在所述混合培养物中的至少一种第二微生物进行反应，以产生至少一种经取代和/或未取代的有机化合物。
所述经取代或未取代的有机化合物可以选自由下列各项组成的组：羧酸、二羧酸、羟基羧酸、羧酸酯、羟基羧酸酯、醇、醛、酮、胺、氨基酸等。特别地，这些有机化合物包含4至32个碳原子，6至20个碳原子，或特别地8至12个碳原子。特别地，所述有机化合物可以是3-羟基异丁酸、乙酸或其盐、甲酸或其盐、脂肪酸(C8至C12)、琥珀酸或其盐等。
更特别地，由本发明的混合培养物所产生的有机化合物可以是羧酸、羟基羧酸和/或羧酸酯。通过使用本发明的方法而获得的最终产物浓度可以超过在本发明的方法期间的中间体乙酸或其盐或者乙醇。
根据本发明的方法可以进一步包括分开和/或纯化所述经取代或未取代的有机化合物的步骤。用于分开和/或纯化的方法可以是本领域中已知的任何方法。特别地，分开所述有机化合物的步骤包括通过培养基的沉降、离心或过滤来去除微生物。
根据本发明的进一步方面，提供了根据本发明的混合培养物用于制备经取代或未取代的有机化合物的用途。
实施例
上面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将会理解的，可以经历在设计、构建或操作方面的改变或修饰，而不背离权利要求书的范围。例如，这些改变旨在由权利要求书的范围所涵盖。
实施例1
通过使用混合生产来从合成气生产3-羟基异丁酸(3HIB)
遵循在EP2602329A1中的实施例1的步骤1-3，以产生具有减弱的3-羟基异丁酸脱氢酶活性的解脂耶氏酵母细胞H222-41。将该细胞标识为H22-41Δ3HIBDH(ura)-8。
对于使合成气(0.6％O2、33％CO2、66.4％H2)进行生物转化以形成3HIB，使用扬氏梭菌(DSMZ13528)和解脂耶氏酵母H222-41Δ3HIBDH(ura)-8。分开培养这两个菌株。对于扬氏梭菌，在无氧条件下实施测定法和实验，除非另有说明。
使扬氏梭菌适应于在包含氧的环境中生长。将5ml的扬氏梭菌培养物与500ml的ATCC1754培养基(pH 6.0，20g/L MES，1g/L酵母提取物，0.8g/L NaCl，1g/L NH4Cl，0.1g/L KCl，0.1g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L CaCl2·2H2O，20mg/L氨三乙酸，10mg/L MnSO4·H2O，8mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，CoCl2·6H2O，2mg/L ZnSO4·7H2O，0.2mg/L CuCl2·2H2O，0.2mg/L Na2MoO4·2H2O，0.2mg/L NiCl2·6H2O，0.2mg/L Na2SeO4，0.2mg/L Na2WO4·2H2O，20μg/L d-生物素，20μg/L叶酸，100μg/L盐酸吡哆醇，50μg/L盐酸硫胺素·H2O，50μg/L核黄素，50μg/L烟酸，50μg/L泛酸钙，1μg/L维生素B12，50μg/L对氨基苯甲酸盐，50μg/L硫辛酸，大约67.5mg/L NaOH(用于调节pH)，和400mg/L盐酸L-半胱氨酸)相组合。在37℃、100rpm下以1L/小时(66.85％H2、33％CO2和0.15％O2)向所述培养物供气140小时，并将其在用丁基橡胶塞子气密密封的耐压玻璃瓶中进行培养。
随后，将该培养物以0.2的起始OD接种在200mL的ATCC1754培养基中，并且在用1L/小时的气体混合物(66.4％H2、33％CO2和0.6％O2)进行供气的情况下培养2-3天。从该第一培养物中，形成适应O2的扬氏梭菌的新的冷冻培养物。将4ml的所述培养物液与1mL的25％DMSO溶液相混合，并冷冻于-80℃以备未来之用。
然后将5mL的适应O2的扬氏梭菌的冷冻培养物添加至200mL的ATCC1754培养基，并且在37℃和100rpm下在用1L/小时的合成气(66.1％H2、33.3％CO2和0.6％O2)进行供气的情况下培养3-6天。
将解脂耶氏酵母细胞H222-41Δ3HIBDH(ura)-8在YPD(10g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和15g/L琼脂，pH 5.4)平板上在28℃下进行涂布并温育20小时。然后，将摇瓶(1000mL，不具有挡板的)装以100ml的YPD培养基(10g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和3滴的消泡剂Delamex)，并且用满满一个环的YPD平板的细胞材料进行接种。于28℃和以200rpm在有氧情况下进行温育20小时。
对于生产的混合阶段，从所述两种培养物中收获细胞，并用两种生长生产缓冲液(pH:7.0，0.5g/l乙酸钠，400mg/l盐酸L-半胱氨酸)分开地进行洗涤。然后将细胞转移入分开的Falcon管中，并以5100rpm离心10分钟。弃去上清液，并将每只管中的细胞在10ml的生产缓冲液中进行洗涤。在以5100rpm离心10分钟后，将细胞重悬浮在5mL生产缓冲液中。
将所述两个菌株的细胞团块合并在装有200mL的生产缓冲液的密闭的无菌玻璃瓶(容积500mL)中，并且开始混合生产阶段。在用合成气(66.4％H2、33％CO2和0.6％O2)进行1L/小时的熏蒸和于30℃进行温育的情况下发生混合生产。在生产阶段期间，每天取5mL的样品体积以测定光密度、pH和各种分析物(通过NMR)。这显示了乙醇和3HIB的形成。通过使用来自所述混合生产的无菌且经过滤的上清液的半定量1H-NMR光谱学来取得这些测量。将样品按照磷酸盐缓冲液进行稀释(在规定的D2O中)并用水抑制进行测量。作为内部定量标准物，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(TSP)。
实施例2
在O2(0.15％)和合成气存在下培养扬氏梭菌
将野生型菌株扬氏梭菌(DSMZ13528)在复合培养基(1g/l NH4Cl，0.1g/l KCl，0.2g/l MgSO4·7H2O，0.8g/l NaCl，0.1g/l KH2PO4，20mg/l CaCl2·2H2O，20g/l MES，1g/l酵母提取物，0.4g/l盐酸L-半胱氨酸，20mg/l氨三乙酸，10mg/l MnSO4·H2O，8mg/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，2mg/l CoCl2·6H2O，2mg/l ZnSO4·7H2O，0.2mg/l CuCl2·2H2O，0.2mg/l Na2MoO4·2H2O，0.2mg/l NiCl2·6H2O，0.2mg/l Na2SeO4，0.2mg/l Na2WO4·2H2O，20μg/l d-生物素，20μg/l叶酸，100μg/l盐酸吡哆醇，50μg/l盐酸硫胺素·H2O，50μg/l核黄素，50μg/l烟酸，50μg/l泛酸钙，1μg/l维生素B12，50μg/l对氨基苯甲酸盐，50μg/l硫辛酸)中自养地进行培养。
在具有500ml复合培养基的1L的隔膜瓶中进行相同的自养培养，所述隔膜瓶置于敞开的水浴摇床Innova 3100(New Brunswick Scientific)中并以150次/分钟的速度进行摇动。被捕获在培养基中的气体通过安装在反应器中央的孔径为10微米的玻璃料来移除。在37℃下在没有pH控制的情况下进行培养。以1b l/小时(0.033vvm)的通气速率在大气压下用组成为66.75％H2、33％CO2和0.15％O2的预混合的非爆炸性气体混合物对反应器进行清洗。
用5ml的DMSO(5％)对具有全部内容物的反应器进行接种以产生冷冻培养物。将处于冷冻的细菌培养物在具有67％H2、33％CO2的合成气混合物存在下在O2不存在下在上面提及的复合培养基中自养地进行培养。
在取样过程期间，取5ml的每个样品以测定所述样品的OD600、pH和产物谱。产物浓度的测定通过使用定量1H-NMR光谱学来进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)充当内部定量标准物。
令人惊讶地发现，低温保存的产乙酸细菌细胞扬氏梭菌能够在0.15％O2存在下进行生长，并且从合成气形成扬氏梭菌典型的产物(乙酸或其盐、乙醇)。重复该结果的尝试不是成功的，正如在表1中作为实验2-6所显示的。在实验2-6中，细菌细胞未能设法在合成气中存在0.15％O2的情况下从冷冻培养物中生长出来。然后，将来自实验1的细胞材料用于进一步的实验以研究含O2的合成气。
在进一步的实验之一中，将来自实验1的细胞材料用作样品以用于细菌基因组的测序，以便鉴定在O2存在下在扬氏梭菌的基因组中可能的变化。测序结果显示在扬氏梭菌的基因组中没有由于O2的存在而引起的变化。但是，鉴定出细菌培养物被皮肤病菌疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)污染(～70％的基因组DNA，基于测序结果)。通过使用测序和丙酸杆菌特异性基因探针，将来自在实验1中所使用的冷冻培养物的细胞材料与用于实验2-6的那种进行比较。结果显示，在实验2-6中所使用的冷冻培养物之中，不存在疮疱丙酸杆菌(探测极限：0.1％)。在用于实验1的冷冻培养物中，发现了疮疱丙酸杆菌和1-2％的扬氏梭菌。
疮疱丙酸杆菌是可以在代谢期间消耗在其培养物中的O2的耐氧的厌氧生物。因此，无意遇到的扬氏梭菌培养物被疮疱丙酸杆菌的污染导致在液相中O2含量减少并因而导致为严格厌氧生物扬氏梭菌的生长创造了无O2的环境。
表1.实施例2的结果
实施例3
将扬氏梭菌和大肠杆菌进行共发酵以用于生产乙酸或其盐、甲酸或其盐和脂肪酸
对于将合成气生物转化为脂肪酸(C8至C12)，使用下面所描述的扬氏梭菌和携带质粒的大肠杆菌的共生产阶段。
扬氏梭菌这种细菌是一种从H2和CO2的供应气相形成乙酸或其盐和甲酸或其盐的同型产乙酸细菌(即，严格厌氧的)。然后，这些乙酸或其盐和甲酸或其盐产物被大肠杆菌从水相中吸收，并被转化为脂肪酸。
对于这些细胞的培养，使用可以用丁基橡胶塞子气密密封的耐压玻璃瓶。所有其中涉及扬氏梭菌细胞的培养步骤都在无氧条件下进行。所使用的携带质粒的大肠杆菌菌株为大肠杆菌菌株JW5020-1ΔfadE pJ294[Ptac-ChFATB2_optEC]。在此，原始菌株大肠杆菌JW5020-1来源于庆应保藏中心(Keio collection)(Baba等人,2006)。所引入的质粒pJ294[Ptac-ChFATB2_optEC]的构建描述在DE102011110945A1的实施例2中，ΔfadE缺失以及原始大肠杆菌菌株的转化以与DE102011110945A1的实施例4相类似地进行。
对于扬氏梭菌的细胞培养，使5ml的冷冻培养物在50ml的培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0；20g/l MES；1g/l酵母提取物；0.8g/l NaCl；1g/l NH4Cl；0.1g/l KCl；0.1g/l KH2PO4；0.2g/l MgSO4·7H2O；0.02g/l CaCl2·2H2O；20mg/l氨三乙酸；10mg/l MnSO4·H2O；8mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；2mg/l CoCl2·6H2O；2mg/l ZnSO4·7H2O；0.2mg/l CuCl2·2H2O；0.2mg/l Na2MoO4·2H2O；0.2mg/l NiCl2·6H2O；0.2mg/l Na2SeO4；0.2mg/l Na2WO4·2H2O；20μg/L d-生物素；20μg/l叶酸；100μg/l盐酸吡哆醇；50μg/l盐酸硫胺素·H2O；50μg/l核黄素；50μg/l烟酸；50μg/l泛酸钙；1μg/l维生素B12；50μg/l对氨基苯甲酸盐；50μg/l硫辛酸；大约67.5mg/l NaOH；400mg/l盐酸L-半胱氨酸)中厌氧地进行生长。在敞开的水浴摇床中，在37℃和150rpm下，在具有组成为67％H2、33％CO2的预混合气体混合物的有着1巴压力的250ml的玻璃瓶中进行培养74小时。然后，将培养物进行离心，并将细胞接种在200ml的完全无氧的ATCC1754培养基中。在敞开的水浴摇床中，在37℃、150rpm和3l/小时的通气下，在具有由67％H2、33％CO2组成的预混合气体混合物的耐压的500ml的玻璃瓶中化能无机自养地进行培养66小时。气体向培养基中的进入通过孔径为10μm且安装在反应器中央于喷射器上的玻璃料来进行。将细胞进行离心，用10ml的洗涤缓冲液(0.7g/l KOH，2小时，具有组成66％H2、33％CO2的预混合气体混合物)进行洗涤，并且通过离心再次进行洗涤。
对于大肠杆菌的细胞培养，用来自琼脂平板的单个菌落接种200ml的培养基(pH 7.0；6.79g/l Na2HPO4；2.6g/l(NH4)2SO4；3g/l KH2PO4；0.5g/l NaCl；2g/l NH4Cl；2ml/l 1M MgSO4·7H2O；39.84ml/l乙酸钠(123g/l，pH 7.0)；0.13ml/l 25％HCl；1.91mg/l MnCl2·7H2O；1.87mg/l ZnSO4·7H2O；0.84mg/l Na-EDTA·2H2O；0.3mg/l H3BO3；0.25mg/l Na2MoO4·2H2O；4.7mg/l CaCl2·2H2O；17.8mg/l FeSO4·7H2O；0.15mg/l CuCl2·2H2O；100mg/l氨苄青霉素)。在敞开的水浴摇床中，在37℃、150rpm和1l/小时的通气下，在具有由90％H2、6％CO2、4％O2组成的预混合气体混合物的密闭的500ml的玻璃瓶中进行培养115小时，并且通过使用孔径为10μm的玻璃料来实施被捕获在培养基中的气体。这些玻璃料安装在反应器中央于喷射器上。在72小时后添加200μl的IPTG溶液(1M)。然后，将细胞进行离心并用10ml洗涤缓冲液(0.5g/l乙酸钠，pH 7.0)进行洗涤，并且再次离心。
对于联合生产阶段，使来自所述两种生长培养物(处于OD600为1.0的大肠杆菌，和处于OD600为0.2的扬氏梭菌)的经洗涤的细胞在200ml的生产缓冲液(pH:7.0，0.5g/l乙酸钠，400mg/l盐酸L-半胱氨酸)中进行生长。在敞开的水浴摇床中，在37℃、150rpm和1l/小时的通气下，在具有由65％H2、33％CO2、2％O2组成的预混合气体混合物的密闭的500ml的玻璃瓶中进行培养18小时。通过安装在反应器中央于喷射器上的孔径为10μm的玻璃料来实施被捕获在培养基中的气体。
对于取样，取5ml的每种样品用于测定OD600、pH和产物谱。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学来进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)充当内部定量标准物。
在培养期之后，结果显示，乙酸或其盐从330mg/l增加至378mg/l，和甲酸或其盐从14g/l增加至36g/l。另外，脂肪酸(C8至C12)的浓度从0mg/l增加至7mg/l。
实施例4
从合成气生产琥珀酸或其盐
对于将合成气生物转化为琥珀酸或其盐，使用扬氏梭菌和携带质粒的大肠杆菌的共生产阶段。同型产乙酸细菌扬氏梭菌转化来自气相的H2和CO2并制造乙酸或其盐和甲酸或其盐，其然后被大肠杆菌从水相中吸收并被转化为琥珀酸或其盐。
对于所述细菌的培养，使用可以用丁基橡胶塞子气密密封的耐压玻璃瓶。所有其中涉及扬氏梭菌细胞的培养步骤都在无氧条件下进行。使用大肠杆菌菌株JW5020-1ΔfadE pJ294[Ptac-ChFATB2_optEC]这一携带质粒的大肠杆菌菌株。原始菌株大肠杆菌JW5020-1来源于庆应保藏中心(Keio collection)(Baba等人,2006)。所引入的质粒pJ294[Ptac-ChFATB2_optEC]的构建描述在DE102011110945A1的实施例2中，ΔfadE缺失以及原始大肠杆菌菌株的转化以与DE102011110945A1的实施例4相类似地进行。
对于扬氏梭菌的细胞培养，使2ml的冷冻培养物在200ml的培养基(ATCC1754培养基：pH 6.0；20g/l MES；1g/l酵母提取物；0.8g/l NaCl；1g/l NH4Cl；0.1g/l KCl；0.1g/l KH2PO4；0.2g/l MgSO4·7H2O；0.02g/l CaCl2·2H2O；20mg/l氨三乙酸；10mg/l MnSO4·H2O；8mg/L(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；2mg/l CoCl2·6H2O；2mg/l ZnSO4·7H2O；0.2mg/l CuCl2·2H2O；0.2mg/l Na2MoO4·2H2O；0.2mg/l NiCl2·6H2O；0.2mg/l Na2SeO4；0.2mg/l Na2WO4·2H2O；20μg/L d-生物素；20μg/l叶酸；100μg/l盐酸吡哆醇；50μg/l盐酸硫胺素·H2O；50μg/l核黄素；50μg/l烟酸；50μg/l泛酸钙；1μg/l维生素B12；50μg/l对氨基苯甲酸盐；50μg/l硫辛酸；大约67.5mg/l NaOH；400mg/l盐酸L-半胱氨酸)中厌氧地进行生长。在敞开的水浴摇床中，在37℃和150rpm下，在具有组成为67％H2、33％CO2的预混合气体混合物的有着1巴压力的500ml的玻璃瓶中进行培养111小时。然后，将培养物进行离心，并用10ml的洗涤缓冲液(pH 6.2，0.1g/l乙酸钠，100mg/l盐酸L-半胱氨酸)进行洗涤。
对于大肠杆菌的细胞培养，用来自琼脂平板的单个菌落接种200ml的培养基(pH 7.0；6.79g/L Na2HPO4；2.6g/l(NH4)2SO4；3g/l KH2PO4；0.5g/l NaCl；2g/l NH4Cl；2ml/l 1M MgSO4·7H2O；39.84ml/l乙酸钠(123g/l，pH 7.0)；0.13ml/l 25％HCl；1.91mg/l MnCl2·7H2O；1.87mg/l ZnSO4·7H2O；0.84mg/l Na-EDTA·2H2O；0.3mg/l H3BO3；0.25mg/l Na2MoO4·2H2O；4.7mg/l CaCl2·2H2O；17.8mg/l FeSO4·7H2O；0.15mg/l CuCl2·2H2O；100mg/l氨苄青霉素)，并覆盖。在敞开的水浴摇床中，在37℃、150rpm和0.7l/小时的通气下，在具有由80％N2、10％H2、6％CO2、4％O2组成的预混合气体混合物的密闭的500ml的玻璃瓶中进行培养160小时，并且通过使用孔径为10μm的玻璃料来实施被捕获在培养基中的气体。这些玻璃料安装在反应器中央于喷射器上。在115小时后添加200μl的IPTG溶液(1M)。然后，将细胞进行离心并用10ml洗涤缓冲液(pH 7.1，0.1g/l乙酸钠，100mg/l盐酸L-半胱氨酸)进行洗涤，并且再次离心。
对于联合生产阶段，使来自所述两种生长培养物(处于OD600为0.6的大肠杆菌，和处于OD600为0.2的扬氏梭菌)的经洗涤的细胞在200ml的生产缓冲液(pH:6.5，0.1g/l乙酸钠，100mg/l盐酸L-半胱氨酸)中进行生长。在敞开的水浴摇床中，在37℃、150rpm下，在具有由65％H2、33％CO2、2％O2组成的预混合气体混合物的密闭的500ml的玻璃瓶中进行培养113小时。每24小时将气相用具有相同组成的新鲜气体进行替换。在14小时后，添加40ppm的盐酸L-半胱氨酸，和在38小时后，添加另外的100ppm的盐酸L-半胱氨酸。
对于取样，取5ml的每种样品用于测定OD600、pH和产物谱。产物浓度的测定通过半定量1H-NMR光谱学来进行。三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)充当内部定量标准物。
在培养期之后，结果显示，乙酸或其盐从77mg/l增加至101mg/l，和甲酸或其盐从0mg/l增加至174g/l。另外，琥珀酸或其盐的浓度从0mg/l增加至40mg/l。
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