发明领域
本发明涉及通式(v)的化合物，其任选是药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型物、共用药物(codrug)、共晶(cocrystal)、前药、互变异构体、外消旋物、对映体或非对映体或其混合物的形式，
其可用于治疗、改善或预防病毒疾病。此外，本发明还公开了特定的组合治疗。
发明背景
最近一些年，流感病毒感染对全球的公共健康所造成的严重威胁已经凸显在以下方面：首先，高致病性鸟甲型流感病毒h5n1病毒株向人类的持续性低传播(在被感染的人中死亡率为63％，http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en/)，第二，在2009年出乎预料地出现了新的大流行流感病毒株a/h1n1，其已经迅速扩散到全世界(http://www.who.int/csr/disease/swineflu/en/)。尽管该新病毒株具有高度接触传染性、但目前通常仅产生轻度疾患，然而这种病毒将来的演变是不可预期的。在一种严重得多的、但是高度合理的情形中，h5n1和相关的高致病性鸟流感病毒可能获得了使其在人之间更容易传播的突变或者新的a/h1n1可能变得毒力更强且仅单点突变将足以产生对奥塞米韦的抗性(neumann等,nature,2009(18；459(7249)931-939))；如许多季节性h1n1病毒株最近已经显示的那样(dharan等,thejournaloftheamericanmedicalassociation,2009年3月11日；301(10),1034-1041；moscona等,thenewenglandjournalofmedicine,2009(3月5日；360(10)pp953-956))。在这种情况下，生产和使用疫苗的延迟(在a/h1n1的较有利的情况下为～6个月，对于h5n1而言仍然是没有解决的问题)在人类生活和社会瓦解方面可能已经是灾难性的代价。
广泛公认的是，为了跨越可获得新疫苗并治疗严重情况以及克服病毒抗药性问题之前的这段时间，需要更宽泛的抗流感药选择。因此，在获得神经氨酸酶抑制剂后大制药公司已经大半放弃了开发新的抗流感药，但开发新的抗流感药已经再次变得具有高度优先性。
开发抗病毒药的一个良好起点是重要病毒蛋白质的结构信息。因此，例如流感病毒表面抗原神经氨酸酶的晶体结构测定(vonitzstein,m.等,(1993),nature,363,pp.418-423)直接导致了开发具有抗病毒活性的神经氨酸酶抑制剂，其阻止病毒从细胞中被释放，但是不阻止病毒产生本身。随后这些神经氨酸酶抑制剂以及它们的衍生物已经被开发成抗流感药扎那米韦(glaxo)和奥塞米韦(roche)，它们目前被许多国家作为对抗可能的大流行病的一线防御措施进行储备。然而，这些药物仅缩短临床疾病的持续时间。或者，其它种类的被批准的抗流感化合物(例如金刚烷胺和金刚乙胺)靶向于病毒m2离子通道蛋白，其位于病毒膜中，干扰细胞内病毒颗粒的脱壳。然而，由于其副作用和迅速发生抗药性病毒突变体，它们已经不被广泛使用(magden,j.等,(2005),appl.microbiol.biotechnol.,66,pp.612-621)。另外，已经证明另一些非特异性病毒药物例如利巴韦林对治疗流感和其它病毒感染有效(eriksson,b.等,(1977),antimicrob.agentschemother.,11,pp.946-951)。然而，可能是由于其严重的副作用，利巴韦林仅在少数几个国家获得批准(furuta等,antimicrobialagentsandchemotherapy,2005,p.981–986)。显然，需要新的抗病毒化合物，优选对抗不同靶标的新的抗病毒化合物。
流感病毒以及托高土病毒(thogotovirus)和传染性鲑鱼贫血病毒属病毒(isavirus)属于正粘病毒科家族，正粘病毒科家族以及本雅病毒科(bunyaviridae)家族(包括汉滩病毒属、内罗毕羊病病毒属、正本雅病毒属(orthobunyavirus)和白蛉热病毒属)尤其是负链rna病毒。它们的基因组被分段并以核糖核蛋白颗粒的形式出现，所述核糖核蛋白颗粒包括rna依赖性rna聚合酶，其进行(i)单链负义病毒rna(vrna)向病毒mrna中的初始拷贝(即，转录)和(ii)vrna复制。该酶是由亚单位pa、pb1和pb2构成的三聚体复合物，对病毒的生命周期而言至关重要，因为它负责病毒rna的复制和转录。在以前的工作中，已经鉴定所述聚合酶的两个关键结构域的原子结构—pb2亚单位中的mrna帽结合结构域(guilligay等,naturestructural&molecularbiology2008；5月；15(5):500-506)和位于pa亚单位中的内切核酸酶活性部位(dias等,nature2009,458,914-918)，并且已经表征了它们的分子结构。这两个部位对于流感病毒和某些该种类的其它病毒家族用于产生病毒mrna的独特的“抢帽(cap-snatching)”模式、从而启动mrna转录而言很重要。5'帽是已经被加入信使rna的5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。所述5'帽(也称为rna帽或rnam7g帽)通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的末端7-甲基鸟苷残基组成。病毒聚合酶与细胞mrna分子的5’rna帽结合并将rna帽连同10-15个核苷酸的一段序列一起断裂。然后加帽的rna片段用作合成病毒mrna的引物(plotch,s.j.等,(1981),cell,23,pp.847-858；kukkonen,s.k.等(2005),arch.virol.,150,pp.533-556；leahy,m.b.等,(2005),j.virol.,71,pp.8347-8351；noah,d.l.等,(2005),adv.virusres.,65,pp.121-145)。
聚合酶复合物似乎是适宜的抗病毒药靶标，因为它对于病毒mrna的合成和病毒复制而言非常重要，并且含有可能与宿主细胞蛋白中发现的功能活性部位显著不同的多种功能活性部位(magden,j.等,(2005),appl.microbiol.biotechnol.,66,pp.612-621)。因此，例如，已经尝试了用类似于pb1内的pa-结合结构域的25-氨基酸肽来干扰聚合物亚单位的装配(ghanem,a.等,(2007),j.virol.,81,pp.7801-7804)。此外，还已经靶向于所述聚合酶的内切核酸酶活性，并且作为流感病毒中这一活性的选择性抑制剂已经鉴定了一系列4-取代的2,4-二氧代丁酸化合物(tomassini,j.等,(1994),antimicrob.agentschemother.,38,pp.2827-2837)。另外，已经证明在delitschiaconfertaspora(一个真菌种类)的提取物中鉴定的flutimide(一种取代的2,6-二酮基哌嗪)抑制流感病毒的内切核酸酶(tomassini,j.等,(1996),antimicrob.agentschemother.,40,pp.1189-1193)。而且，已经尝试了用核苷类似物例如2’-脱氧-2’-氟鸟苷干扰病毒转录(tisdale,m.等,(1995),antimicrob.agentschemother.,39,pp.2454-2458)。
wo2006/066414涉及某些羟基二氢吡啶并吡嗪-1,8-二酮，声称其适合用于抑制hiv整合酶。
ep-a-1544199公开了被描述为hiv整合酶抑制剂的特定的含氮稠环化合物。
本发明的一个目的是鉴定有效对抗病毒疾病且具有改善的药理学性质的另外的化合物。
附图简要说明
图1
用于quantigeneta测定法探针组设计的从头合成的病毒mrna的序列：将标记延伸物(labelextender)(le)杂交至5'-端的来源于所提供的合成rna底物的加帽引物序列和从头合成的病毒mrna的前几个碱基(le1)和3'-端的多聚a尾(le2)。俘获延伸物(captureextender)(ce1–9)特异性地杂交至基因特异性区并且同时将俘获的rna固定至板上。封闭探针(bp)杂交至从头合成的病毒mrna的不同段序列。用3'-rlmrace验证了3'-端以斜体字显示的序列(未显示完整序列)。所述探针组由panomics以全部三个的混合物形式提供。
发明概述
因此，在第一个实施方案中，本发明提供了通式(v)的化合物。
应当理解的是，在本申请文件中，除非另有说明，否则术语“通式(v)的化合物”涵盖药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型物、前药、共用药物、共晶、互变异构体、外消旋物、对映体或非对映体或者其混合物。
本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含通式(v)的化合物，并且任选地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
通式(v)的化合物可用于治疗、改善或预防病毒疾病。
已经令人惊奇地发现，本发明的化合物使用帽-结合和内切核酸酶核心的最佳的连接和取代模式通过连接基系统(蝴蝶构象)提供了帽-结合和内切核酸酶片段的组合。在考虑耐受的药物样性质的情况下这种方法提供了化学和代谢稳定性并且将连接基策略翻译至杂交方法，因为两种核心片段被连接，但是替代了选择性配体的相应相关部分。
在目前的化合物中，二环环系形式的双金属结合首基(headgroup)与大的疏水性基团连接，从而提供了额外的相互作用，这对于增加配体效能和对流感聚合酶的选择性、从而获得比目前现有的治疗选择更优的体内有效性的化合物而言是重要的。作为疏水性基团，不同芳族环系的广泛变化形式被耐受，以便优化与另外的官能团的结合亲和性。双金属首基官能团与疏水性取代基之间的起连接作用的连接基确保两种片段的最佳空间排布，并且还影响决定细胞渗透性的分子的总体极性。本发明的化合物的帽-片段确保了最佳的平面核心，从而提供了平的帽-结合袋内的显著的π-叠加相互作用。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限于本文所述的具体的方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应当理解的是，本文所用的术语是仅为了描述具体实施方案，不旨在限制本发明的范围，其将仅由所附的权利要求书来限定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
优选地，本文所用的术语如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(iupacrecommendations)”,leuenberger,h.g.w,nagel,b.和
除非上下文另有要求，否则在本说明书和随后的权利要求书中，词语“包含”及其变体例如“包括”和“含有”均应理解为表示包括所给出的整数或步骤或者整数组或步骤组，但是不排除任何其它整数或步骤或者整数组或步骤组。在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任意另外的一个或多个方面组合，有清楚的相反说明时除外。特别地，所给出的任意优选的或有利的特征可以与任意另外的一个或多个优选的或有利的特征组合。
在本说明书的正文中引用了多个文献。无论是上文引用的，还是下文引用的，将本文所引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明等)通过引用整体合并入本文中。本文中的任何内容均不应理解为承认这类公开内容构成本发明的现有技术。
定义
术语“烷基”指饱和的直链或支链烃链。
术语“芳基”优选指含有6个碳原子的芳族单环、含有10个碳原子的芳族二环环系或含有14个碳原子的芳族三环环系。实例有苯基、萘基或蒽基，优选苯基。
术语“包含10-14个环原子和1-4个氮原子的二环稠合环系”指包括至少2个彼此稠合的环、即共用价键的环系。构成该环系的环可以是饱和的、不饱和的或芳族的。典型的实例是环系，其中具有5、6或7个环原子的两个环稠合在一起。在本发明的化合物中所用的二环稠合环系中，环原子中的1-4个是氮原子。此外，所述二环稠合环系可以被羰基(＝o)或所附的权利要求中所定义的其它取代基取代。
术语“环烷基”表示环形式的“烷基”。术语“环烷基”还包括其二环、三环和多环形式。除非另有规定，否则环烷基可具有3–12个碳原子。
术语“碳环基”涵盖环中不包含杂原子的任意5或6元烃环。术语“碳环基环”涵盖饱和环(包括环烷基环)、不饱和环和芳族环(包括芳基环)。
“hal”或“卤素”表示f、cl、br和i。
术语“杂芳基”优选指5或6元芳族环，其中环中的一个或多个碳原子已经被1、2、3或4个(对于5元环而言)或者1、2、3、4或5个(对于6元环而言)相同或不同的杂原子代替，其中所述杂原子选自o、n和s。杂芳基的实例包括吡咯、吡咯烷、氧杂环戊烷、呋喃、咪唑烷、咪唑、吡唑、
术语“杂环基”涵盖其中环中的至少一个碳原子已经被1、2、3或4个(对于5元环而言)或者1、2、3、4或5个(对于6元环而言)相同或不同的杂原子代替的任意5或6元环，其中所述杂原子选自o、n和s。术语“杂环基环”涵盖饱和的、不饱和的环和芳族环(包括杂芳基环)。实例包括吡咯、吡咯烷、氧杂环戊烷、呋喃、咪唑烷、咪唑、吡唑、
如果一个化合物或基团被称为是“任选被取代的”，则它在每种情况下可以包括一个或多个所给出的取代基，其中所述取代基可以相同或不同。
术语“药学上可接受的盐”指本发明的化合物的盐。适合的药学上可接受的盐包括酸加成盐，其可以例如通过将本发明的化合物的溶液与药学上可接受的酸的溶液混合来形成，所述的药学上可接受的酸例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，在化合物带有酸性基团的情况下，其适合的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；以及与适合的有机配体形成的盐(例如，铵盐、季铵盐和使用抗衡阴离子如卤素离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的胺阳离子)。药学上可接受的盐的举例说明性实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙盐(calciumedetate)、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、樟磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐(clavulanate)、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖庚酸盐(glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐(isothionate)、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、n-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、triethiodide、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见例如s.m.berge等,"pharmaceuticalsalts",j.pharm.sci.,66,pp.1-19(1977))。
当本发明的化合物是结晶形式时，该结构可以含有溶剂分子。所述溶剂典型地是药学上可接受的溶剂，尤其包括水(水合物)或有机溶剂。可能的溶剂合物的实例包括乙醇合物和异丙醇合物。
术语“共用药物”指通过共价化学键键合的两种或更多种治疗化合物。详细的定义可见于例如n.das等,europeanjournalofpharmaceuticalsciences,41,2010,571–588。
术语“共晶”指一种多组分晶体，其中所有组分当是其纯形式时在环境条件下均是固体。这些组分以化学计量比或非化学计量比的靶标分子或离子(即，本发明的化合物)和一种或多种中性分子共晶形成物的形式共存。详细讨论可见于例如ningshan等,drugdiscoverytoday,13(9/10),2008,440-446和d.j.good等,cryst.growthdes.,9(5),2009,2252–2264中。
本发明的化合物也可以是前药、即其在体内代谢成活性代谢物的化合物的形式。适合的前药是例如酯。适合基团的具体实例尤其在us2007/0072831的第[0082]–[0118]段在标题前药和保护基下给出。前药的优选实例包括其中r51选自–c(o)–r、–c(o)–or、–po(ora)(orb)或–oc(o)or的化合物，其中r、ra和rb独立地选自c1–6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基可以任选被取代，例如任选被–oh或o–c1–6烷基取代。r的实例包括c1–6烷基(ch3、叔丁基)、苯基、苯基–oh或苯基–och3。
通式(v)的化合物
本发明提供了通式(v)的化合物。
本发明提供了通式(v)的化合物，其中适用下面的定义。
r51选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)和–c(o)–(任选被取代的c1–6烷基)；优选r51选自–h和–c1–6烷基；更优选r51是–h。
r52选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(ch2)q–(任选被取代的杂环基)、–(ch2)q–(任选被取代的碳环基)、–(ch2)p–or55和–(ch2)p–nr56r57；优选r52选自–h和–c1–6烷基。
r53选自–r54和–x51r54；优选r53是–x51r54。
r54是包含10-14个环原子和1-4个氮原子作为环原子的二环稠合环系，其中该二环稠合环系可以是任选被取代的。优选r54是包含两个稠合环的二环稠合环系，其中所述稠合环独立地选自5元环、6元环和7元环。更优选r54是包含两个稠合环的二环稠合环系，其中所述稠合环独立地选自5元环和6元环，特别地，r54是包含两个稠合环的二环稠合环系，其中所述稠合环是5元环和6元环。该二环稠合环系包含1-4个氮原子，优选2-3个氮原子。
该二环稠合环系可以任选被一个或多个(例如1、2或3个)取代基取代，所述取代基独立地选自(＝o)、卤素、–cn、–cf3、–(ch2)s–x52–r58、–c1–6烷基、–c3–7碳环基、–c1–4烷基–c3–7碳环基、–(具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(具有3-7个环原子的杂环基)。在这方面优选的取代基是(＝o)、卤素、–cn、–cf3和–c3–7碳环基，更优选地，一个或多个取代基选自(＝o)、卤素和–c3–7碳环基，甚至更优选(＝o)和卤素。
在一个优选的实施方案中，r54选自：
其中
其中所述基团可以任选被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、–cn、–cf3、–(ch2)s–x52–r58、–c1–6烷基、–c3–7碳环基、–c1–4烷基–c3–7碳环基、–(具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(具有3-7个环原子的杂环基)，优选地，一个或多个取代基选自卤素、–cn、–cf3和–c3–7碳环基，更优选地，一个或多个取代基选自卤素和–c3–7碳环基，甚至更优选卤素。
r55选自–h、–c1–6烷基和–(ch2ch2o)rh。
r56选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；优选–h和–(任选被取代的c1–6烷基)，更优选–h和–c1–6烷基。
r57选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；优选–h和–(任选被取代的c1–6烷基)；更优选–h和–c1–6烷基。
r58选自–h和–c1–6烷基。
x51选自–l1–(a–(l2)m)n–；优选x51选自–l1–和–l1–a–l2–。
x52选自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、o、c(o)、c(o)o、oc(o)；n(r56)so2、so2n(r56)、s、so和so2；优选x52选自n(r56)c(o)、c(o)nr56、n(r56)so2和so2n(r56)。
l1选自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、o、c(o)、c(o)o、oc(o)；n(r56)so2、so2n(r56)、n(r56)so2n(r56)、s、so、so2和(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)–nr56；优选l1选自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、c(o)o、oc(o)、o和(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)–nr56。一个实例是
l2选自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、o、c(o)、c(o)o、oc(o)；n(r56)so2、so2n(r56)、n(r56)so2n(r56)、s、so、so2和(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)–nr56；优选l2选自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、c(o)o、oc(o)、o和(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)–nr56。一个实例是
a选自(cr*r**)t、任选被取代的c3–7碳环基、任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基，其中所述碳环基或所述杂环基的环原子中至少一个(例如1、2或3个)分别与基团l1和l2或r54在链上键合。两个或更多个基团a的组合也可以存在。例如，两个基团a可以彼此共价键合，得到基团–l1–(a–a–(l2)m)n–。在一种选择中，a可以选自(cr*r**)t、环己基和苯基及其组合。(cr*r**)t的实例包括–(ch2)t–和–(chr*)t–。
r*每次出现时独立地选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；优选r*每次出现时独立地选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；更优选–h、–(c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)。
r**每次出现时独立地选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；优选r**每次出现时独立地选自–h、–(任选被取代的c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)、–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)、–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基)；更优选–h、–(c1–6烷基)、–(任选被取代的c3–7碳环基)和–c1–4烷基–(任选被取代的c3–7碳环基)。
在一个供替代选择的实施方案中，r*和r**与它们所连接的碳原子一起形成任选被取代的c3–7碳环基或任选被取代的具有3-7个环原子的杂环基，优选任选被取代的c3–7碳环基。
r***每次出现时独立地是–h、–c1–6烷基或被一个或多个卤素原子取代的–c1–6烷基。
m是0或1。
n是0或1。
p是1-4。
q是0-4。
r是1-3。
s是0-4。
t是1-6。
所述烷基可以任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–cn、–nr56r57、–oh和–o–c1–6烷基。
所述烃基、杂环基和/或碳环基可以任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、–cn、–cf3、–(ch2)s–x52–r58、–c1–6烷基、–c3–7碳环基、–c1–4烷基–c3–7碳环基、–(具有3-7个环原子的杂环基)和–c1–4烷基–(具有3-7个环原子的杂环基)；优选卤素、–cn、–nr56r57、–oh和–o–c1–6烷基。
上面的定义和优选定义的所有组合也是本发明的发明人的构思。
本发明的发明人已经令人惊奇地发现，具有特定的连接基–(cr***r***)–r53的本发明的化合物与不具有这类连接基的相应化合物相比具有改善的药理学性质。不希望受理论的束缚，认为本申请的化合物不仅提供双金属结合，而且提供促成配体的内在结合性质的疏水性相互作用。将双金属首基与大的疏水性取代基组合的更灵活的连接基提供了更高的构象灵活性，从而提供了正确的载体，其适于特异性相互作用并且以更优的方式通过更高的构象灵活性与结合袋的几个氨基酸相互作用，但不释放熵贡献(一个分子)。
本发明的化合物可以以药物组合物的形式施用于患者，所述药物组合物可任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
本发明的化合物可以通过各种公知的途径施用，包括口服、直肠、胃内(intragastrical)、颅内和肠胃外施用，例如静脉内、肌内、鼻内、真皮内、皮下，以及类似的施用途径。特别优选的是口服、鼻内和肠胃外施用。根据施用途径的不同，需要不同的药物制剂，这些施用途径中的一些可能需要给药物制剂涂敷保护性包衣以防止本发明的化合物在例如消化道内降解。
因此，优选地，本发明的化合物被配制成糖浆、输液或注射液、喷雾剂、片剂、胶囊、胶囊形片剂(caplet)、锭剂、脂质体、栓剂、膏药、绷带(band-aid)、延迟释放胶囊(retardcapsule)、散剂或缓慢释放制剂。优选地，稀释剂是水、缓冲剂、缓冲盐溶液或盐溶液，载体优选选自可可脂和vitebesole。
用于施用本发明的化合物的特别优选的药物形式是适合注射使用的形式，包括无菌的水性溶液或分散体和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况中，最终的溶液或分散体形式必须是无菌的并且是流体。典型地，这类溶液或分散体将包含溶剂或分散介质，其含有例如水-缓冲水溶液例如生物相容性的缓冲剂、乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其适合的混合物，表面活性剂或植物油。本发明的化合物也可以被配制成脂质体，特别是用于肠胃外施用的脂质体。脂质体提供在循环中半衰期增加的优点(如果与游离药物相比)以及所包裹的药物的延长的更均匀的释放。
输液和注射液的灭菌可以通过任意数量的本领域公认的技术来实现，包括但不限于加入防腐剂如抗细菌剂或抗真菌剂，例如尼泊金酯(parabene)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞(thimersal)。此外，还可以在输液和注射液中掺入等张剂，例如糖或盐，特别是氯化钠。
含有一种或多种本发明的化合物的无菌注射液的生产通过以下方法完成：将所需量的各化合物掺入酌情具有上面列出的各种成分的适宜溶剂中，然后灭菌。为了获得无菌粉末，将上述溶液按照需要真空干燥或冷冻干燥。本发明的优选的稀释剂是水、生理学上可接受的缓冲剂、生理学上可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。优选的载体是可可脂和vitebesole。可以与本发明的化合物的各种药物形式一起使用的赋形剂可选自下面的非限制性列表：
a)粘合剂，例如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、磷酸氢盐、磷酸钙盐(calciumphosphates)、糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；
b)润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰醇富马酸钠，
c)崩解剂，例如淀粉、交联羧甲基纤维素、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、海藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
在一个实施方案中，制剂用于口服施用，并且制剂包含下列成分中的一种或多种或全部：预胶化淀粉、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮k30、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酰醇富马酸钠、明胶、二氧化钛、山梨醇、柠檬酸一钠、黄原胶、二氧化钛、矫味剂、苯甲酸钠和糖精钠。
如果在一个优选的实施方案中本发明的化合物被鼻内施用，其可以以干粉末吸入器或来自使用适合的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷如1,1,1,2-四氟乙烷(hfa134atm)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(hfa227eatm)、二氧化碳、或其它适合的气体的加压容器、泵、喷雾器或雾化器中的喷雾剂的形式被施用。所述的加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有本发明的化合物的溶液或混悬液，例如使用乙醇和抛射剂作为溶剂的溶液或混悬液，其还可以含有润滑剂，例如三油酸山梨坦。
其它适合的赋形剂可见于美国药学协会(americanpharmaceuticalassociation)出版的药物赋形剂手册(handbookofpharmaceuticalexcipients)，通过引用将其合并入本文。
应当理解的是，根据可用本发明的化合物之一治疗的障碍的严重性和具体类型，以及根据待治疗的各个患者例如患者的总体健康状态等，需要不同剂量的各化合物来产生治疗或预防效果。适宜剂量的确定由主治医师酌情确定。认为在本发明的治疗或预防应用中本发明的化合物的剂量应当在约0.1mg至约1g活性成分(即，本发明的化合物)/千克体重范围内。然而，在一个优选的本发明的应用中，将本发明的化合物以1.0-500mg/kg体重、优选1-200mg/kg体重的量施用于需要其的个体。用本发明的化合物治疗的持续时间将根据所治疗的疾病的严重性以及每个单个患者的情况和特质反应而变化。在一个优选的预防或治疗应用的实施方案中，每天给成年人口服施用10mg–200mg化合物，这取决于疾病的严重性和/或暴露于疾病载体的程度。
如本领域中已知的那样，给定化合物的药学有效量还取决于施用途径。一般而言，如果施用是通过胃肠道(例如用栓剂)、直肠或通过胃内探针进行，则所需的量较高，如果施用途径是肠胃外例如静脉内，则所需的量较低。典型地，如果使用直肠或胃内施用，则本发明的化合物将以50mg–1g/kg体重、优选10mg–500mg/kg体重被施用，如果使用肠胃外施用，则本发明的化合物将以1–100mg/kg体重被施用。对于鼻内施用，使用1–100mg/kg体重。
如果已知一个人具有发生可用本发明的化合物治疗的疾病的风险，则可以预防性施用生物学活性血清或本发明的药物组合物。在这些情况下，本发明的各化合物优选以天为基础以上述优选的和特别优选的剂量被施用。优选地，每天一次0.1mg–1g/kg体重，优选10–200mg/kg体重。该施用可以持续至发生各病毒性障碍的风险已经减小。然而，在大部分情况下，在已经诊断出疾病/障碍后施用本发明的化合物。在这些情况中，优选的是每天施用首剂量的本发明的化合物一次、两次、三次或四次。
本发明的化合物特别可用于治疗、改善或预防病毒疾病。对病毒疾病的类型没有特别限制。可能的病毒疾病的实例包括但不限于由以下病毒引起的病毒疾病：痘病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、微小病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、正粘病毒科、本雅病毒科、沙粒病毒科、冠状病毒科、微小核糖核酸病毒科、肝炎病毒科(hepeviridae)、嵌杯样病毒科、星状病毒科(astroviridae)、披膜病毒科、黄热病病毒科、δ病毒属(deltavirus)、博尔纳病毒科(bornaviridae)和朊病毒。优选由疱疹病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、正粘病毒科、本雅病毒科、沙粒病毒科、冠状病毒科、微小核糖核酸病毒科、披膜病毒科、黄热病病毒科引起的病毒疾病，更优选由正粘病毒科引起的病毒疾病。
在下面的表中给出了各种病毒的实例。
优选地，本发明的化合物用于治疗流感。本发明涵盖属于正粘病毒科家族的所有病毒属，特别是甲型、乙型和丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病和托高土病毒。在本发明内，术语“流感”包括由任意流感病毒例如甲型、乙型和丙型流感病毒(包括它们的各种病毒株和分离物(isolate))导致的流感，还涵盖通常被称为鸟流感(birdflu)和猪流感的甲型流感病毒株。对待治疗的个体没有特别限制，其可以是任意脊椎动物，例如鸟和哺乳动物(包括人)。
不希望受理论束缚，认为本发明的化合物能抑制内切核酸酶活性、特别是流感病毒的内切核酸酶活性。更具体地，认为它们直接干扰具有内切核酸酶活性且对于流感病毒复制而言所必需的流感病毒pa蛋白的n-末端部分。流感病毒复制在细胞内发生在细胞核内。因此，被设计用于抑制pa内切核酸酶活性的化合物需要跨过细胞膜和核膜二者，该性质主要取决于设计的所述化合物的物理化学性质。
此外，也不希望受理论束缚，认为本发明的化合物能抑制宿主mrna帽结构与帽结合结构域(cbd)、特别是流感病毒的帽结合结构域结合。更具体地，认为它们直接干扰流感pb2蛋白质的cbd。然而，将化合物递送入细胞可以代表一个问题，其取决于例如化合物的溶解度或其通过细胞膜的能力。
本发明显示要求保护的化合物具有体外内切核酸酶抑制活性以及体外聚合酶抑制活性。
式(v)的化合物的体外内切核酸酶抑制活性的一种可能测定法是本文所公开的基于fret(荧光共振能量转移)的内切核酸酶活性测定法。优选地，在该fret测定法中所述化合物在25μm下表现出至少约50％的％降低。在该语境中，％降低是被测量为与未处理的样品相比化合物处理后被流感病毒内切核酸酶亚单位(pa-nter)裂解的双标记的rna底物的荧光增加的初始反应速度(v0)的％降低。优选地，在该测定法中所述化合物表现出小于约50μm、更优选小于约20μm的ic50。半数最大抑制浓度(ic50)是化合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的量度，是由从最大100μm–至少2nm范围内的给定浓度系列的初始反应速度(v0)计算得到的。
通式(v)的化合物可以与一种或多种其它药剂组合使用。对所述的其它药剂的类型没有特别限制，取决于待治疗的障碍。优选地，所述的其它药剂是可用于治疗、改善或预防病毒疾病的另外的药剂，更优选是可用于治疗、改善或预防由流感病毒感染导致的流感和与该病毒感染相关的病症例如病毒性肺炎或继发性细菌性肺炎的另外的药剂以及治疗诸如受寒、发热、咽喉痛(sorethroat)、肌肉疼痛、严重头痛、咳嗽、虚弱和疲劳等症状的药剂。此外，通式(v)的化合物可以与抗炎药组合使用。
下面的药剂组合被认为是特别适合的：
(i)内切核酸酶和帽结合抑制剂(特别是靶向于流感的)的组合。对所述的内切核酸酶抑制剂没有特别限制，可以是任意内切核酸酶抑制剂，特别是任意病毒内切核酸酶抑制剂。优选的内切核酸酶抑制剂是美国申请us2013/0102600、us2013/0317022、us2013/0317021和us2014/0038990中所定义的那些。通过引用将这些申请的全部公开内容合并入本文。特定地，将这些美国申请的关于化合物通式、各取代基的优选实施方案以及所述化合物的医学效用和优点的所有描述通过引用合并入本文。
另外的优选的内切核酸酶抑制剂是美国序号61/750,023(2013年1月8日提交)中所定义的通式(ii)的化合物和美国序号61/750,023(2013年1月8日提交)中所定义的通式(v)的化合物，通过引用将其全部公开内容合并入本文。特定地，将关于这些化合物的通式、各取代基的优选实施方案以及所述化合物的医学效用和优点的所有描述通过引用合并入本文。这些化合物可以任选地是药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型物、共用药物、共晶、前药、互变异构体、外消旋物、对映体或非对映体或者其混合物的形式。
对所述的帽结合抑制剂也没有特别限制，可以是任意帽结合抑制剂，特别是任意病毒帽结合抑制剂。优选的帽结合抑制剂是美国申请2013/0102601中所定义的通式(ii)的那些和/或wo2011/000566中所公开的化合物，通过引用将其全部公开内容合并入本文。特定地，将关于us2013-0102601或wo2011/000566的化合物的通式、各取代基的优选实施方案以及所述化合物的医学效用和优点的所有描述通过引用合并入本文。
在大流行的和季节性出现的病毒株二者中均出现了对两类获得许可的流感抗病毒药(m2离子通道抑制剂(金刚烷类)和神经氨酸酶抑制剂(例如奥塞米韦))的广泛抗药性，使得这些药物在治疗方式中仅具有最低限度的效用。对于m2离子通道抑制剂而言，病毒抗药性的频率自从2003年以来一直在增加，对于季节性流感a/h3n2而言，金刚烷类现在被认为是无效的。实际上，所有2009h1n1和季节性h3n2病毒株均对金刚烷类(金刚乙胺和金刚烷胺)具有抗药性，对于奥塞米韦(最广泛被开具处方的神经氨酸酶抑制剂(nai))，who报告了在2007/2008流感季节开始的显著出现的流感a/h1n1抗药性；并且在南半球持续了2008年的第二和第三季度。在2008年的第四季度公开了甚至更严重的数字(北半球)，其中所有测试的分离物的95％显示对奥塞米韦不敏感。考虑到现在大多数国家的政府已经作为它们的流感大流行准备计划的一部分储备奥塞米韦的事实，显然对新的有效药物的需求大大增加。为了解决对更有效的疗法的需求，已经用具有不同作用机制的抗病毒药的二联或甚至三联组合进行了初步研究。对金刚烷类和神经氨酸酶抑制剂的组合在体外和体内进行了分析，发现它们高度协同作用。然而，已知的是，非常迅速地出现了对这两类抗病毒药均有抗药性的病毒，这一问题无法通过组合使用这些已有的抗病毒药来解决。
流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录活性的新药。针对病毒聚合酶的帽结合和内切核酸酶活性部位的选择性抑制剂通过停止病毒增殖周期而大幅度地减弱病毒感染。这两个靶标位于聚合酶复合物的不同亚单位内，因此代表独特的药物靶标。由于两个功能都是所谓的“抢帽”机制(其是病毒转录所必需的)所需要的这一事实，预期同时抑制两种功能会高度协同地起作用。这种高度有效的药物组合将导致更低的物质浓度，并且因此导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。
在所有甲型流感病毒株(例如鸟和人)、甚至乙型流感病毒中这两个活性部位都是高度保守的，因此这种高度的序列保守性为这些靶标不可能引发迅速抗药病毒产生的认知提供了依据。另外，与宿主蛋白质的紧密相互作用使得这些病毒蛋白质更不容易突变。因此，无论是何种病毒株，各自和组合使用的内切核酸酶和帽结合抑制剂是对抗季节性和大流行流感这二者的理想药物候选物。
内切核酸酶抑制剂和帽结合抑制剂的组合或靶向于内切核酸酶活性部位和帽结合结构域二者的双重特异性聚合酶抑制剂将有效对抗对金刚烷类和神经氨酸酶抑制剂有抗药性的病毒株，而且合并了对产生抗药性的低敏感性的优点与对抗宽范围的病毒株的活性。
(ii)不同抗病毒靶标的抑制剂(特别是靶向于流感的)的组合集中于作为双或多组合疗法的具有(优选流感病毒)聚合酶抑制剂的组合。流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶转录和复制活性的新药。针对病毒聚合酶的选择性抑制剂通过停止病毒增殖周期而大幅度地减弱了病毒感染。预计特别针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与不同抗病毒靶标的抑制剂的组合高度协同地起作用。这基于以下事实：这些不同类型的抗病毒药表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。
这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于不同抗病毒靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
典型地，将选自第一组聚合酶抑制剂的至少一种化合物(例如，帽结合和内切核酸酶抑制剂)与选自第二组聚合酶抑制剂的至少一种化合物组合。
能用于该类型的组合疗法的所述的第一组聚合酶抑制剂包括但不限于通式(v)的化合物。
能用于该类型的组合疗法的所述的第二组聚合酶抑制剂包括但不限于美国申请us2013/0102600中所定义的通式(v)的化合物、美国申请us2013/0102601中所定义的通式(ii)的化合物、wo2011/000566、wo2010/110231、wo2010/110409、wo2006/030807或us5,475,109中所公开的化合物以及flutimide及其类似物、法匹拉韦(favipiravir)及其类似物、表棓儿茶素棓酸酯(epigallocatechingallate)及其类似物、以及核苷类似物例如利巴韦林。
(iii)聚合酶抑制剂与神经氨酸酶抑制剂的组合
流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录和复制活性的新药。预计特异性地针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与不同的细胞外抗病毒靶标、尤其是(例如病毒)神经氨酸酶的抑制剂的组合高度协同地起作用。这基于以下事实：这些不同类型的抗病毒药表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。
这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于不同抗病毒靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
典型地，将选自上述的第一组聚合酶抑制剂的至少一种化合物与至少一种神经氨酸酶抑制剂组合。
对所述的神经氨酸酶抑制剂(特别是流感神经氨酸酶抑制剂)没有特别限制。实例包括扎那米韦、奥塞米韦、帕拉米韦(peramivir)、kdndana、fana和环戊烷衍生物。
(iv)聚合酶抑制剂与m2通道抑制剂的组合
流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录和复制活性的新药。预计特异性地针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与不同的细胞外和细胞质抗病毒靶标、尤其是病毒m2离子通道的抑制剂的组合高度协同地起作用。这基于以下事实：这些不同类型的抗病毒药表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。
这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于不同抗病毒靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
典型地，将选自上述的第一组聚合酶抑制剂的至少一种化合物与至少一种m2通道抑制剂组合。
对m2通道抑制剂(特别是流感m2通道抑制剂)没有特别限制。实例包括金刚烷胺和金刚乙胺。
(v)聚合酶抑制剂与α葡糖苷酶抑制剂的组合
流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录和复制活性的新药。预计特异性地针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与不同的宿主细胞靶标、尤其是α葡糖苷酶的抑制剂的组合高度协同地起作用。这基于以下事实：这些不同类型的抗病毒药表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于与病毒复制相互作用的细胞靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
典型地，将选自上述的第一组聚合酶抑制剂的至少一种化合物与至少一种α葡糖苷酶抑制剂组合。
对α葡糖苷酶抑制剂没有特别限制。实例包括chang等,antiviralresearch2011,89,26-34中所述的化合物。
(vi)聚合酶抑制剂与其它流感靶标的配体的组合
流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录和复制活性的新药。预计特异性地针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与不同的细胞外、细胞质或细胞核抗病毒靶标的抑制剂的组合高度协同地起作用。这基于以下事实：这些不同类型的抗病毒药表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。
这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于不同抗病毒靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
典型地，将选自上述的第一组聚合酶抑制剂的至少一种化合物与至少一种另外的流感靶标的配体组合。
对另外的流感靶标的配体没有特别限制。实例包括作用于唾液酸酶融合蛋白的化合物(例如，fludase(das181)、sirna和硫代磷酸寡核苷酸)、信号转导抑制剂(例如，erbb酪氨酸激酶、abl激酶家族、map激酶、pkca-介导的erk信号发放的活化)以及干扰素(诱导物)。
(vii)(优选流感)聚合酶抑制剂与用作最小化疾病症状的辅药(adjuvant)的化合物(抗生素、抗炎药如cox抑制剂(例如，cox-1/cox-2抑制剂、选择性cox-2抑制剂)、脂氧化酶抑制剂、ep配体(特别是ep4配体)、缓激肽配体和/或大麻素配体(例如，cb2激动剂)的组合。流感病毒聚合酶抑制剂是靶向于聚合酶的转录和复制活性的新药。特异性地针对病毒细胞内靶标的聚合酶抑制剂与用作最小化疾病症状的辅药的化合物的组合解决了病毒感染的起因性和症状性病理结果。预计该组合协同地其作用，因为这些不同类型的药物表现出完全不同的作用机制，其需要有利地、协同地作用于所述组合的抗病毒功效的不同的药动学性质。
这种高度有效的药物组合会导致更低的物质浓度，并且从而导致改善的剂量-响应关系和更佳的副作用特性。此外，以上针对聚合酶抑制剂所述的优点普遍存在于不同抗病毒靶标的抑制剂与聚合酶抑制剂的组合中。
在不脱离本发明的范围的情况下本发明的各种调整和变型对于本领域技术人员而言是显而易见的。尽管已经使用具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解的是要求保护的发明不应当被不合理地局限于这些具体的实施方案。实际上，对于相关领域的技术人员而言显而易见的所述的实施本发明的方式的各种调整也被本发明所涵盖。
下面的实施例仅用于对本发明进行举例说明，绝不应当理解为是对所附的权利要求所给出的本发明范围的限制。
实施例
fret内切核酸酶活性测定法
如dias等,nature2009；4月16日；458(7240),914-918中所述的那样制备并纯化了具有流感内切核酸酶活性的甲型流感病毒(iav)pa-nter片段(氨基酸1–209)。将该蛋白质溶解在含有20mmtrisph8.0、100mmnacl和10mmβ-巯基乙醇的缓冲液中，将等分试样贮存在–20℃。
将20个碱基的用5′-fam荧光团和3′-bhq1猝灭剂双重标记的rnaoligo作为通过pa-nter的内切核酸酶活性被裂解的底物。rna底物的裂解从猝灭剂中释放出荧光团，从而导致荧光信号增加。
将所有测定组分稀释在含有20mmtris-hclph8.0、100mmnacl、1mmmncl2、10mmmgcl2和10mmβ-巯基乙醇的测定缓冲液中。pa-nter的终浓度是0.5μm和1.6μmrna底物。将测试化合物溶解在dmso中，一般在两个浓度或者浓度系列下测试，从而使得最终的板孔dmso浓度是0.5％。在其中化合物在该浓度下不溶解的那些情况中，将它们在最高可溶的浓度下进行测试。
在一式八份的白色384孔微量滴定板(perkinelmer)的孔中提供5μl每种化合物稀释液。加入pa-nter稀释液后，将板密封并在室温下孵育30min，然后加入1.6μm用测定缓冲液稀释的rna底物。随后，在微量滴定板读数器(synergyht,biotek)中在485nm的激发波长和535nm的发射波长下测量裂解的rna的增加的荧光信号。动力学读数间隔是35秒，敏感度是35。使用20min期间的荧光信号数据计算底物裂解的初始速度(v0)。最终读数是与未处理的样品相比化合物处理的样品的v0的％降低。半数最大抑制浓度(ic50)是化合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的量度，并且由最大100μm–至少2nm范围内的给定浓度系列下的初始反应速度(v0)计算得到。
细胞致病作用(cpe)测定法
甲型流感病毒(iav)获自美国组织培养物保藏中心(americantissueculturecollection)(a/aichi/2/68(h3n2)；vr-547)。通过以下方法制备病毒储备液：在mardin-darby犬肾(mdck；atccccl-34)细胞上繁殖病毒，如reed,l.j.和h.muench.1938,am.j.hyg.27:493-497中所述用50％组织培养物感染剂量(tcid50)分析测定病毒储备液的感染滴度。
用含有10％胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺和1％抗生素(全部来自paa)的dmem/ham’sf-12(1:1)培养基将mdck细胞以2×104个细胞/孔接种在96孔板中。直至感染前，将细胞在37℃、5.0％co2下孵育5小时，从而在孔的底部形成～80％汇合单层。将每种测试化合物溶解在dmso中，一般在25μm和250μm下进行测试。在其中化合物在该浓度下不溶的那些情况中，将它们在最高可溶浓度下进行测试。将化合物稀释在感染培养基(dmem/ham’sf-12(1:1)，含有5μg/ml胰蛋白酶和1％抗生素)中，以便最终板孔dmso浓度为1％。将病毒储备液稀释在感染培养基(dmem/ham’sf-12(1:1)，含有5μg/ml胰蛋白酶、1％dmso和1％抗生素)中，以便理论感染复数(moi)为0.05。
除去培养基并且用pbs进行一个洗涤步骤后，将病毒和化合物一起加入到细胞中。在用于细胞毒性测定的孔中(即，不存在病毒感染)，不加入病毒混悬液。代之以加入感染培养基。每个处理均一式两份地进行。在37℃、5％co2下孵育48小时后，用显微镜观察每个孔的表观细胞毒性、沉淀物形成或其它值得注意的异常。然后，用celltiter-glo发光细胞生存力测定法(promega)测定细胞生存力。小心地取出上清液，向每个孔中加入65μl重构的试剂，在温和振摇下于室温孵育15min。然后，将60μl溶液转移到不透明的板中，用synergyht板读数器(biotek)测量发光(rlu)。
用与未感染的未处理的细胞相比的未感染的处理的细胞的相对细胞生存力值评价化合物的细胞毒性。将在测试浓度下相对生存力低于80％的物质视为是细胞毒性的，在更低浓度下再进行测试。
如下计算经化合物处理的病毒介导的细胞致病作用(cpe)的降低：从感染的处理的样品的响应(rlu)中减去感染的未处理的样品的响应(rlu)，然后用相应的未感染的样品的生存力归一化，得到％cpe降低。半数最大抑制浓度(ic50)是化合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的量度，是由最大100μm–至少100nm范围内的给定浓度系列的rlu响应计算得到的。
biacore测定法
根据制造商的方案，通过胺偶联将鸟h5n1流感病毒的pb2帽结合结构域(cbd)固定在cm7传感器芯片(gehealthcare)表面上。用ph6.5的10mm磷酸盐缓冲液稀释蛋白质。作为用于固定化的运行缓冲液，使用hbs-ep缓冲液(10mmhepes,150mmnacl,3mmedta,0,005％表面活性剂p20)。使用30μg/ml的蛋白质浓度和12min的接触时间，达到了约8000ru(相对响应单位)的固定水平。
为了进行化合物筛选，使用含有10mmtris,3mmedta,150mmnacl,0.005％surfactantp20(gehealthcare/biacore),1mmdtt,0.5％dmso的运行缓冲液。用不含dmso的1.005x样品缓冲液(1.005xtris/edta/nacl/p20/dtt；由10x储备溶液稀释的)将每种化合物的2mmdmso储备溶液稀释至10μm和0.5％dmso终浓度。分别用m7gtp(sigmaaldrich)和sav-7160
作为参比和浓度为4mm和10μm的芯片稳定性对照。制备每种参比化合物的储备溶液并且将等分试样贮存在–20℃。
对于缓冲液，如下计算体效应(bulkeffect)(基质)：从活性流动细胞fc2中减去用参比流动细胞fc1得到的响应，得到相对响应单位(ru)，其反映化合物与配体的结合。缓冲液中的有机溶剂例如dmso导致高的体效应，由于配体固定其在参比流动细胞与活性流动细胞之间有区别。为了解释这些差异，建立了校正曲线。测定缓冲液中在0.1％-1.5％范围内的8个dmso浓度，通过绘制fc2-fc1与fc1的关系图计算线性校正曲线。然后用通过校正曲线上的各个fc1信号和对应的fc2-fc1差所得到的溶剂因子校正每种样品的相对响应。为了解释化合物的不同大小，将缓冲液和溶剂校正的响应单位用分子量标准化。
通过测量200μm-1nm浓度范围内分析物与配体的结合亲和性来测定亲和常数(kd值)。kd值是这样一种浓度，在该浓度下，50％的结合位点是饱和的且使用线性曲线拟合模型计算。
ic50值的测定–转录测定法(ta测定法)
ta测定法原理
为了分析所述抑制剂的活性，使用完整的rnp复合物在不含细胞的环境中进行转录测定法(ta)，但不使用放射性标记的核苷酸。
体外合成的加帽的mrnaoligo用作病毒mrna合成的引物，同时使用
材料和方法
化合物
所有化合物均溶于dmso并且贮存在4℃。所有其它试剂均得自sigma–aldrich，另有说明的除外。
rna底物的制备
所用的底物rna来源于根据制造商的方案(但使用16hr的延长的孵育时间)生产的用t7高收率rna合成试剂盒(newenglandbiolabsinc.)合成的体外转录的rna。使用mirneasy小型试剂盒(qiagen)凝胶纯化rna产物。使用scriptcapm7g加帽系统(cellscript,madisonwi)以酶促方式给rna加帽。得到的加帽的rna寡核苷酸(5’-m7gpppg-gggaauacucaagcuaugcaucgcauuaggcacgucgaagua-3‘；seqidno:1)用作流感病毒聚合酶的引物。
rnp的制备
所有实验均用iav株a/pr/8/34进行，其在含胚鸡蛋中扩增或由charlesriverlaboratories纯化和浓缩获得。将蛋-扩增的病毒用4％w/vpeg8000在含有100mmnacl的2mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液中进行peg-沉淀(4℃,45min)，在4℃以3600g离心45min。将沉淀物混悬在含有100mmnacl和6％w/v蔗糖的10mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液中，然后通过30％w/v蔗糖垫纯化(109,000g,120min,4℃)。
如之前所公开的那样(进行一些调整)(klumpp等2001.influenzavirusendoribonuclease,p.451-466,342ed.)进行rnp纯化。将病毒冻干物以2mg/ml的病毒蛋白质终浓度溶解在1x裂解缓冲液(1％w/vtritonx-100,1mg/ml溶血卵磷脂,2.5mmmgcl2,100mmkcl,5mmdtt,2.5％v/v甘油,20mmtris-hcl(ph8.0),20u/mlrnase抑制剂)中，然后在30℃孵育60分钟。将3.3ml得到的裂解物荷载至甘油梯度(2ml70％v/v，1.5ml50％v/v，0.75ml40％v/v和3.6ml33％v/v–在20mmtris-hcl、50mmnacl、5mmdtt、5mm2-巯基乙醇中缓冲)。在4℃、240,000g下用sorvall超速离心机ah641转子将所述梯度旋转6小时。从梯度上部收集级分(0.5ml)。将含有rnp颗粒的级分合并，用10kdvivaspin2柱进一步浓缩，贮存在-20℃。通过uv光谱法测定rnp浓度，使用1.0＝60mg/mlrnp的od260nm作为换算因子(klumpp等2001.influenzavirusendoribonuclease,p.451-466,342ed.)。
rna分析和转录测定法(ta测定法)
通过
对于标准反应，将80pmrnp在30℃下与在反应缓冲液(55mmtris-hcl,20mmkcl,1mmmgcl2,0.2％v/vtritonx-100,0.25u/μlrnaseout,12.5mmnacl,1.25mmdtt,1.25mm2-巯基乙醇,12.5％v/v甘油)中的1％v/v最终dmso浓度的抑制剂稀释液系列一起孵育2小时。然后加入2nm加帽的rna底物，然后在30℃下孵育2小时。通过在95℃下孵育5min终止反应。
为了检测合成的mrna，将
使用graphpadprism分析响应值(相对发光单位)，以便使用4-参数逻辑方程测定ic50值和95％置信区间。包括阳性对照和阴性对照以便定义用于拟合曲线的上限值和下限值。
通过将纯化的rnp与已知序列的加帽的rna底物一起孵育生成了从头合成的病毒mrna。
本发明的化合物的ta测定法结果
使用上述ta测定法，测定了本发明的化合物的ic50值。
合成实施例
在下文中，除非给出具体的合成方法，否则化合物是按照通用方案制备的。
d-1-01
d-01-02的合成
将叔丁基4-氯-1h-吡唑并[4,3-c]吡啶(tert-butyl4-chloro-1h-pyrazolo[4,3-c]pyridine)(30.6mg,0.2mmol)和e-001(68mg,0.2mmol)的混合物在100℃加热过夜。加入meoh(2ml)，通过制备型-tlc(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)纯化所得物，得到d-01-02(50mg,54.5％)，为黄色油状物。
d-1-01的合成：
向d-01-02(50mg，0.1mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入tfa(2ml)。将该溶液在室温搅拌至lcms证实d-01-02消失。然后减压浓缩所得物，通过制备型-hplc纯化残余物，得到产物d-1-01(24.8mg，61％)，为浅黄色固体。
6-((1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-4-基氨基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-1-01，为浅黄色固体。
收率：33％
mp：
ms(esi)：369(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ8.63(s，1h)，7.67-7.68(m，1h)，7.22(d，j＝7.2hz，1h)，6.50(s，1h)，4.87(s，2h)，4.75-4.79(m，1h)，4.29(s，2h)，3.71(s，2h)，1.22(d，j＝6.8hz，6h).
d-2-01：
d-2-01的合成：
将6-溴-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-3(2h)-酮(21.4mg，0.1mmol)和e-001(34mg，0.1mmol)的混合物在100℃加热过夜。加入meoh(2ml)，通过制备型-tlc(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)纯化所得物，得到d-2-01(1.5mg，3.5％)，为白色固体。
6-((6-氨基吡啶-3-基氨基)甲基)-9-(苄基氧基)-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-2-01，为白色固体。
收率：3.5％
mp：
ms(esi)：432(m-h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ7.45-7.47(m，2h)，7.31-7.36(m，6h)，7.25-7.27(m，1h)，6.59(s，1h)，5.18(s，2h)，4.71-4.74(m，1h)，4.24-4.26(m，2h)，3.81(s，2h)，3.76(s，2h)，3.40-3.43(m，2h)，1.21(d，j＝6.8hz，6h)
d-2-02：
d-2-02-1的合成：
向2-(1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-4-基氧基)乙醇(36mg，0.2mmol)在dmf(2ml)中的混合物中加入nah(7.6mg，0.3mmol)和e-002(68mg，0.2mmol)。将该混合物在30℃搅拌3h。通过制备型-tlc(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)纯化所得物，得到d-2-02-1(50mg，50％)，为黄色油状物。
d-2-02的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-2-02(5.8mg，1.3％)，为棕色油状物。
6-((2-(1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-4-基氧基)乙氧基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-2-02，为棕色固体。
收率：0.7％
mp：
ms(esi)：414(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.35(s，1h)，7.98(s，1h)，7.27(br，1h)，6.32(s，1h)，5.95(s，2h)，4.85-4.93(m，1h)，4.60-4.62(m，4h)，3.99(t，j＝4.4hz，2h)，3.81(s，2h)，1.30(d，j＝6.8hz，6h).
d-2-03：
d-2-03-1的合成：
将e-001(68mg，0.2mmol)和5-溴-3-氧代-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-2(3h)-甲酸叔丁酯(62.8mg，0.2mmol)、pd(dppf)cl2(5mg)、cs2co3(130mg，0.4mmol)在1，4-二
d-2-03的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-2-03(6.9mg，29.6％)，为棕色固体。
9-羟基-2-异丙基-6-((3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-5-基氨基)甲基)-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-2-03，为棕色固体。
收率：3.8％
mp：
ms(esi)：385(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.39(s，1h)，8.35(s，1h)，6.93-6.95(m，1h)，6.28-6.31(m，2h)，6.29(d，j＝7.2hz，1h)，4.72-4.75(m，1h)，4.49(s，2h)，4.19(s，2h)，3.64(s，2h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)，
d-2-04：
d-2-04-1的合成：
向n1-(1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-基)乙烷-1,2-二胺(35.4mg,0.2mmol)在dmf(2ml)中的混合物中加入k2co3(40mg,0.3mmol)和e-002(68mg,0.2mmol)。将该混合物在30℃搅拌3h。通过制备型-tlc(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)纯化所得物，得到d-2-04-1(50mg,50％)，为棕色油状物。d-2-04的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-2-04(5.8mg,1.3％)，为棕色固体。
6-((2-(1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-4-基氨基)乙基氨基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3,4-二氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-1,8(2h)-二酮
得到d-2-04，为棕色固体。
收率：0.7％
mp：
ms(esi)：412(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.50(s，1h)，7.62(d，j＝6.8hz，1h)，7.12(d，j＝6.8hz，1h)，6.80(s，1h)，4.52-4.60(m，1h)，4.46(s，2h)，4.29(s，2h)，4.01(s，2h)，3.73(s，2h)，3.52(s，2h)，1.28(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-01-2：
d-3-01的合成：
向3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-6-甲酸(50mg，0.28mmol)在dcm(5ml)中的溶液中依次加入草酰二氯(71mg，0.56mmol)和dmf(1滴)。将反应混合物在室温搅拌3h。减压浓缩，得到粗d-3-01(50mg，91％)，将其直接用于下一步。
d-3-01-3-3的合成：
向3-氨基苯甲酸甲酯(38mg，0.25mmol)、tea(50mg，0.50mmol)在dcm(5ml)中的溶液中滴加d-3-01(50mg，0.25mmol)。将该溶液在室温搅拌过夜，然后浓缩。通过制备型-tlc(meoh/dcm＝1/15)纯化残余物，得到d-3-01-3-3(59mg，76％)，为黄色油状物。
d-3-01-3-2的合成：
将d-3-01-3-3(59mg，0.19mmol)和lioh(9mg，0.38mmol)在meoh(3ml)中的混合物在室温搅拌过夜。真空除去溶剂。加入水，用2nhcl将该溶液的ph调整至5。过滤产物，用水洗涤固体，得到d-3-01-3-2(41mg，77％)，为浅黄色固体。
d-3-01-3-1的合成：
将d-3-01-3-2(41mg，0.15mmol)和hatu(68mg，0.18mmol)在dmf(3ml)中的混合物在室温搅拌0.5h。此后，加入tea(30mg，0.30mmol)和e-001(51mg，0.15mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。通过制备型-tlc纯化产物，得到d-3-01-3-1(29.5mg，36％)，为黄色油状物。
d-3-01-3的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-3-01-1(2.5mg，10％)，为棕色固体。
n-(3-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基甲酰基)苯基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-6-甲酰胺
得到d-3-01-3，为棕色固体。
收率：1.6％
mp：
ms(esi)：532(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.70(s，1h)，10.54(s，1h)，9.10(s，1h)，8.76(s，1h)，8.27(s，1h)，7.97(d，j＝8.0hz，1h)，7.60-7.67(m，2h)，7.50(t，j＝8.0hz，1h)，7.32(d，j＝10.0hz，1h)，6.41(s，1h)，4.70-4.75(m，1h)，4.56(s，2h)，4.29(s，2h)，3.76(s，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-01-4：
按照与d-3-01-3载体的方式合成了d-3-01-4。通过制备型-hplc纯化得到d-3-01-4(2.2mg,8％)，为棕色固体。
(r)-n-(3-(3-氯苯基)-1-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-甲酰胺
得到d-3-01-4，为棕色固体。
收率：1.3％
mp：
ms(esi)：594(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.65(br，1h)，8.93-8.98(m，1h)，8.73-8.75(m，1h)，7.35-7.51(m，2h)，7.23-7.28(m，6h)，5.32(t，j＝4.8hz，1h)，4.66-4.73(m，2h)，4.37-4.46(m，2h)，4.03(br，1h)，3.07-3.12(m，2h)，2.97-3.03(m，2h)，1.17(d，j＝7.2hz，6h).
d-3-01-5：
按照与d-3-01-3相同的方式合成了d-3-01-5。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-01-5(3.3mg，13％)，为棕色固体。
(r)-n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代-1-苯基乙基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-01-5，为棕色固体。
收率：1.3％
mp：
ms(esi)：546(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.38(br，1h)，7.44-7.58(m，2h)，7.21-7.38(m，5h)，7.09(br，1h)，5.42(br，1h)，5.24(t，j＝4.4hz，1h)，4.41(br，2h)，4.00-4.16(m，2h)，3.40-3.53(m，2h)，1.18-1.20(m，6h).
d-3-02-1：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-3-02-1-1。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-1(9.5mg，38％)，为黄色固体。
n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-02-1，为黄色固体。
收率：7％
mp：
ms(esi)：413(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.09(d，j＝6.4hz，2h)7.02(s，1h)，6.85(t，j＝6.8hz，1h)，4.90-4.93(m，1h)，4.81(s，2h)，4.56(s，2h)，3.81(s，2h)，1.30(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-02-3：
d-3-02-3-2的合成：
将d-3-02-2(60mg，0.33mmol)和hatu(153mg，0.40mmol)在dmf(3ml)中的混合物在室温搅拌0.5h。此后，依次加入tea(67mg，0.66mm0l)和1-氨基环己烷甲酸(47mg，0.33mmol)。将反应混合物在室温搅拌3h。过滤产物，浓缩滤液，得到粗d-3-02-3-1。向粗d-3-02-3-1在dmf中的溶液(3ml)中依次加入tea(67mg，0.66mmol)、hatu(153mg，0.40mmol)和e-001(112mg，0.33mm0l)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩。通过制备型-tlc(meoh/dcm＝1/10)纯化残余物，得到d-3-02-3-2(30mg，14％)，为黄色油状物。
d-3-02-3的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-3(8mg，31％)，为浅黄色固体。
n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基甲酰基)环己基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-02-3，为浅黄色固体。
收率：4％
mp：
ms(esi)：512(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.93(s，1h)，8.85(t，j＝4.8hz，1h)，8.81(d，j＝8.4hz，1h)，8.10(d，j＝5.6hz，1h)，7.97(d，j＝6.4hz，1h)，6.78(d，j＝6.8hz，1h)，6.51(s，1h)，4.70-4.73(m，1h)，4.53-4.56(m，1h)，4.43(s，2h)，4.24(s，2h)，3.63(s，2h)，2.15-2.16(m，1h)，1.13-1.18(m，6h)，0.95(d，j＝6.4hz.6h).
d-3-02-4：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-3-02-4。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-4(6.5mg，26％)，为黄色固体。
3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酸(9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基酯
得到d-3-02-4，为黄色固体。
收率：4.8％
mp：
ms(esi)：414(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
612.72(s，1h)，12.68(br，1h)，8.12(d，j＝7.2hz，1h)，8.02(d，j＝6.0hz，1h)，6.70(t，j＝6.8hz，1h)，6.47(s，1h)，5.38(s，2h)，4.73-4.76(m，1h)，4.24-4.27(m，2h)，3.61-3.64(m，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-02-5：
按照与d-3-02-3类似的方式合成了d-3-02-5。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-5(4.1mg，16％)，为浅黄色固体。
n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-1-氧代丁烷-2-基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-02-5，为浅黄色固体。
收率：2.1％
mp：
ms(esi)：498(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ8.85(d，j＝7.2hz，1h)，8.79(s，1h)，8.09(d，j＝6.0hz，1h)，7.96(d，j＝6.0hz，1h)，6.77(t，j＝6.4hz，1h)，6.18(s，1h)，4.71-4.74(m，1h)，4.57-4.59(m，1h)，4.35(s，2h)，4.09(s，2h)，3.58(s，2h)，3.09-3.11(m，2h)，1.16-1.19(m，6h)，0.91(d，j＝7.2hz，3h).
d-3-02-6：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-3-02-6。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-6(3.2mg，13％)，为棕色固体。
(r)-n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代-1-苯基乙基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-02-6，为棕色固体。
收率：1.3％
mp：
ms(esi)：546(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.91-12.94(m，1h)，9.45-9.49(m，1h)，9.08(br，1h)，8.09(d，j＝6.0hz，1h)，7.94(d，j＝6.4hz，1h)，7.37-7.49(m，6h)，6.76-6.78(m，1h)，5.68-5.70(m，1h)，4.69-4.72(m，1h)，4.42-4.48(m，2h)，3.92(br，2h)，3.82(br，2h)，1.12(d，j＝6.8hz，6h).
(r)-n-(3-(3-氯苯基)-1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
按照与d-3-01-3相同的方式得到d-3-02-7，为棕色固体。
收率：4.6％
mp：
ms(esi)：594(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.94(s，1h)，8.84(d，j＝7.2hz，1h)，8.08(d，j＝7.2hz，1h)，7.91(d，j＝6.8hz，1h)，7.28(s，1h)，7.24(s，2h)，7.15(s，1h)，6.75(d，j＝6.8hz，1h)，6.36(s，1h)，4.85-4.88(m，1h)，4.75-4.78(m，1h)，4.35(s，2h)，4.06(s，2h)，3.57(s，2h)，3.02-3.12(m，2h)，1.17(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-03-1：
d-3-03-1的合成：
将4-氯-1h-吡唑并[4，3-c]吡啶(30.6mg，0.2mmol)和3-氨基苯甲酸甲酯(30.2mg，0.2mmol)的混合物在100℃加热过夜。加入meoh(2ml)，通过制备型-tlc(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)纯化所得物，得到d-3-03-1-1(38mg，71％)，为白色固体。
在后面的步骤中，按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-3-03-1。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-03-1(2.8mg，13％)，为棕色固体。
3-(1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-4-基氨基)-n-((9-(苄基氧基)-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯甲酰胺
得到d-3-03-1，为棕色固体。
收率：2％
mp：
ms(esi)：488(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ14.08(br，1h)，11.25(br，1h)，9.23(t，j＝4.8hz，1h)，8.49(s，1h)，8.10(s，1h)，7.94(d，j＝7.6hz，1h)，7.83(d，j＝6.8hz，1h)，7.64-7.71(m，2h)，7.18(d，j＝6.8hz，1h)，6.54(s，1h)，4.74(t，j＝6.8hz，1h)，4.62(d，j＝4.2hz，2h)，4.34(s，2h)，3.51(s，2h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h).
d-5-01：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-5-01。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-01(8.7mg，62％)，为浅黄色油状物。
2-(5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)丁酰胺
得到d-5-01，为浅黄色油状物。
收率：26％
mp：
ms(esi)：568(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.48(s，1h)，8.31(s，1h)，8.26(d，j＝7.6hz，1h)，6.72(s，1h)，5.36(t，j＝4.8hz，1h)，4.59-4.64(m，3h)，4.35-4.39(m，1h)，3.76-3.81(m，1h)，3.40-3.44(m，2h)，3.04-2.09(m，2h)，1.32(d，j＝6.8hz，6h)，1.12(t，j＝7.2hz，3h).
d-5-02：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-5-02。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-02(4.5mg，32％)，为棕色油状物。
6-(5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)己酰胺
得到d-5-02，为棕色油状物。
收率：12％
mp：
ms(esi)：596(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.63(s，1h)，8.39(d，j＝5.2hz，1h)，8.29(d，j＝4.4hz，1h)，6.65(s，1h)，4.80-4.85(m，1h)，4.47(s，2h)，4.35(s，2h)，3.82(t，j＝6.8hz，2h)，3.72(s，2h)，2.38(t，j＝7.2hz，2h)，1.87-1.90(m，2h)，1.77-1.81(m，2h)，1.56-1.59(m，2h)，1.27(d，j＝6.8hz，6h).
d-5-03：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-5-03。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-03(6.2mg，42％)，为浅黄色油状物。
(s)-2-(5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-3-甲基丁酰胺
得到d-5-03，为浅黄色油状物。
收率：17％
mp：
ms(esi)：582(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.52(s，1h)，8.37(d，j＝2.8hz，1h)，8.30(dd，j＝8.0hz，2.4hz，1h)，6.94(s，1h)，4.63-4.71(m，1h)，4.52-4.59(m，3h)，4.44(d，j＝7.2hz，1h)，4.06-4.10(m，1h)，3.47-3.57(m，2h)，2.37-2.42(m，1h)，1.17-1.22(m，12h).
d-2-06：
按照与d-2-04类似的方式合成了d-2-06。通过制备型-hplc纯化，得到d-2-06(3.8mg，1.3％)，为白色固体。
6-((2-(4-氯-1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-6-基氨基)乙基氨基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-2-06，为白色固体。
收率：0.7％
mp：
ms(esi)：446(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.09(s，1h)，6.50(s，1h)，6.28(s，1h)，4.84-4.88(m，1h)，4.35-4.38(m，2h)，3.83(s，2h)，3.49(t，j＝5.2hz，2h)，3.42(t，j＝5.2hz，2h)，2.97(t，j＝6.0hz，2h)，1.20(d，j＝6.8hz，6h).
d-4-01-5：
d-4-01-5-1的合成：
向d-4-01-1(30mg，0.18mmol)在dcm(3ml)中的混合物中加入草酰二氯(2ml)。将反应混合物在室温搅拌3h。浓缩该溶液，将残余物溶于dcm(3ml)。然后加入tea(37mg，0.37mmol)和(r)-2-氨基-3-(3-氯苯基)丙酸(36mg，0.18mmol)，将该溶液在室温搅拌过夜。浓缩产物，得到d-4-01-5-1(20mg，32％)，将其直接用于下一步。
d-4-01-5的合成：
将d-4-01-5-1(20mg，0.06mmol)和hatu(33mg，0.08mmol)在dmf(3ml)中的混合物在室温搅拌0.5h。此后，加入tea(14mg，0.14mmol)和e-001(20mg，0.08mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。通过制备型-hplc纯化所得物，得到d-4-01-5(1.5mg，4％)，为浅白色固体。
(r)-n-(3-(3-氯苯基)-1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-甲酰胺
得到d-4-01-5，为浅白色固体。
收率：1％
mp：
ms(esi)：578(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ14.22(br，1h)，12.56(br，1h)，8.55-8.74(m，2h)，8.42-8.45(m，1h)，7.42(s，1h)，7.17-7.36(m，4h)，6.23(s，1h)，4.70-4.80(m，2h)，4.38-4.43(m，1h)，4.25-4.30(m，1h)，4.04(s，2h)，4.35(s，2h)，3.16(d，j＝6.4hz，2h)，1.14(d，j＝6.4hz，6h).
d-5-06：
按照与d-1-01类似的方式合成了d-5-06。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-06(3.2mg，10％)，为橙色油状物。
6-((5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-5-06，为橙色油状物。
收率：7％
mp：
ms(esi)：483(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.54(s，1h)，8.39(d，j＝3.6hz，1h)，8.29-8.31(m，1h)，7.04(s，1h)，5.08(s，2h)，4.93-4.98(m，1h)，4.71(t，j＝5.2hz，2h)，3.83-3.86(m，2h)，1.32(d，j＝6.8hz，6h).
d-6-03：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-6-03。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-03(2.2mg，9％)，为棕色油状物。
2-环丙基-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-5h-吡咯并[2，3-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-03，为棕色油状物。
收率：15％
mp：
ms(esi)：438(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.41(br，1h)，8.25(s，1h)，6.78(br，1h)，5.44-5.51(m，2h)，5.06-5.10(m，2h)，4.50(br，1h)，3.75(br，2h)，2.29(br，1h)，1.28-1.35(m，6h)，1.04(s，4h).
d-6-04：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-6-04。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-04(4.0mg，10％)，为浅白色固体。
2-环丙基-n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代乙基)-5h-吡咯并[2，3-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-04，为浅白色固体。
收率：4％
mp：
ms(esi)：494(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.78(br，1h)，12.60(s，1h)，8.63-8.68(m，2h)，8.38(s，1h)，8.30(d，j＝2.8hz，1h)，6.48(s，1h)，4.72-4.75(m，1h)，4.46(d，j＝5.2hz，2h)，4.22-4.25(m，2h)，4.13-4.16(m，2h)，3.65(s，2h)，2.32-2.35(m，1h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h)，1.00-1.10(m，4h).
d-2-05：
按照与d-1-01类似的方式合成了d-2-05。通过制备型-hplc纯化，得到d-2-05(13mg，76％)，为黄色油状物。
6-((4-氯-1h-吡唑并[4，3-c]吡啶-6-基氨基)甲基)-9-羟基-2-异丙基-3，4-二氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮
得到d-2-05，为黄色油状物。
收率：55％
mp：
ms(esi)：403(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.81(s，1h)，7.20(s，1h)，6.84(s，1h)，4.92-5.11(m，3h)，4.76(d，j＝1.2hz，2h)，3.86-3.89(m，2h)，1.32(d，j＝6.8hz，6h).
d-3-01-2：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-3-01-2。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-01-2(5mg,25％)，为浅黄色油状物。
n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代乙基)-3-氧代-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-甲酰胺
得到d-3-01-2，为浅黄色油状物。
收率：4％
mp：
ms(esi)：470(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.67(s，1h)，9.09(t，j＝5.2hz，1h)，8.66(d，j＝5.6hz，1h)，8.49-8.52(m，2h)，7.54(t，j＝9.2hz，1h)，7.24-7.29(m，1h)，6.71(s，1h)，4.73(t，j＝6.8hz，1h)，4.41-4.46(m，2h)，4.23-4.32(m，2h)，3.90-3.96(m，2h)，3.52-3.68(m，2h)，1.13-1.24(m，6h).
d-3-02-8：
按照与d-3-02-3类似的方式合成了d-3-02-8。通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-8(8mg，31％)，为浅黄色固体。
n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基甲酰基)环己基)-3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酰胺
得到d-3-02-8，为浅黄色固体。
收率：4％
mp：
ms(esi)：538(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.41(s，1h)，8.33(s，1h)，8.09-8.14(m，1h)，7.94(d，j＝6.8hz，1h)，6.78(t，j＝6.8hz，1h)，4.72(t，j＝6.8hz，1h)，4.21-4.35(m，2h)，4.06(s，1h)，3.51-3.54(m，1h)，3.07(d，j＝6.0hz，4h)，2.06-2.14(m，2h)，1.73-1.79(m，2h)，1.57-1.63(m，2h)，1.45-1.47(m，2h)，1.16(t，j＝7.2hz，6h).
d-3-02-9：
d-3-02-9-1的合成：
将d-3-02-2(60mg，0.33mmol)和hatu(165mg，0.42mmol)在dcm(5ml)中的混合物在室温搅拌0.5h。此后，加入diea(84mg，0.66mmol)和2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯(204mg，0.33mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。通过制备型-tlc(meoh/dcm＝1/5)纯化所得物，得到d-3-02-9-1(60mg，55％)，为黄色固体。
d-3-02-9-2的合成：
向d-3-02-9-1(60mg，0.18mmol)在meoh(3ml)中的混合物中加入6nhcl(6ml)。将该混合物在室温搅拌0.5h，然后浓缩。通过制备型-tlc(meoh/dcm＝1/2)纯化残余物，得到d-3-02-9-2(30mg，73％)，为黄色油状物。
d-3-02-9-3的合成：
将d-3-02-9-2(30mg，0.13mmol)、k2co3(37mg，0.27mmol)和e-002(48mg，0.13mmol)在dmf(3ml)中的混合物在室温搅拌3h。过滤该混合物，减压浓缩。通过制备型-tlc(meoh/dcm＝1/5)纯化残余物，得到d-3-02-9-3(20mg，27％)，为黄色油状物。
d-3-02-9的合成：
按照与d-1-01相同的方式，通过制备型-hplc纯化，得到d-3-02-9(9mg，53％)，为棕色固体。
3-氧代-2，3-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-8-甲酸2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)乙基酯
得到d-3-02-9，为棕色固体。
收率：6％
mp：
ms(esi)：457(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ7.97(d，j＝12.0hz，2h)，6.90(s，1h)，6.76(s，1h)，5.37(s，2h)，4.75-4.80(m，1h)，4.50-4.55(m，2h)，3.70(br，2h)，3.61(br，2h)，3.57(br，2h)，1.17(d，j＝6.4hz，6h).
d-4-01：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-4-01。通过制备型-hplc纯化，得到d-4-01(3mg，18％)，为棕色固体。
n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-甲酰胺
得到d-4-01，为棕色固体。
收率：6％
mp：
ms(esi)：397(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.60-8.63(m，2h)，7.38(d，j＝3.2hz，1h)，7.19(s，1h)，4.85-4.90(m，3h)，4.66(s，2h)，3.85(s，2h)，1.26-1.31(m，6h).
d-4-01-3：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-4-01-3。通过制备型-hplc纯化，得到d-4-01-3(10mg，27％)，为棕色固体。
n-(6-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-6-氧代己基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-甲酰胺
得到d-4-01-3，为棕色固体。
收率：10％
mp：
ms(esi)：510(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.56-8.63(m，2h)，7.31-7.34(m，1h)，6.57(s，1h)，5.03-5.09(m，1h)，4.46(s，2h)，4.31(s，2h)，3.69(d，j＝15.6hz，2h)，3.40-3.46(m，2h)，2.30-2.34(m，2h)，1.66-1.72(m，4h)，1.39-1.46(m，2h)，1.21-1.31(m，6h).
d-4-01-4：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-4-01-4。通过制备型-hplc纯化，得到d-4-01-4(6mg，33％)，为浅白色固体。
n-(3-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基甲酰基)苯基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-甲酰胺
得到d-4-01-4，为浅白色固体。
收率：6％
mp：
ms(esi)：516(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.70(d，j＝6.0hz，2h)，8.43(s，1h)，7.93-8.00(m，1h)，7.70(s，1h)，7.55(s，1h)，7.34-7.40(m，2h)，4.90-5.12(m，3h)，4.74(s，2h)，3.90(s，2h)，1.32(d，j＝6.0hz，6h).
d-5-04：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-5-04。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-04(5mg,71％)，为棕色油状物。
3-环丙基-3-(5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基)丙酰胺
得到d-5-04，为棕色油状物。
收率：29％
mp：
ms(esi)：594(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.56-8.59(m，2h)，8.26(d，j＝4.4hz，1h)，6.64(s，1h)，4.77(s，1h)，4.50(d，j＝4.0hz，1h)，4.36-4.46(m，4h)，3.54-3.63(m，2h)，2.88(d，j＝4.8hz，2h)，1.28(d，j＝6.8hz，1h)，1.19-1.24(m，6h)，0.43-0.79(m，4h).
d-5-05：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-5-05。通过制备型-hplc纯化，得到d-5-05(5mg，19％)，为棕色油状物。
顺式-3-(5-氟-2-(5-氟-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)环己烷甲酰胺
得到d-5-05，为棕色油状物。
收率：15％
mp：
ms(esi)：608(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.63(s，1h)，8.39(d，j＝6.8hz，1h)，8.32(d，j＝4.4hz，1h)，6.77(s，1h)，5.01(d，j＝9.6hz，2h)，4.54(d，j＝3.2hz，2h)，4.41-4.47(m，2h)，3.73(s，2h)，2.83(s，1h)，2.23-2.31(m，2h)，1.81(s，1h)，1.68(s，1h)，1.55-1.58(m，2h)，1.28-1.32(m，2h)，1.20-1.26(m，6h).
d-6-01：
d-6-02的合成：
将c-003(3.60g，10.1mmol)、环丙基硼酸(1.30g，15.2mmol)、cs2co3(6.60g，20.3mmol)和pd(dppf)cl2(0.37g，0.51mmol)在二
d-6-02-1的合成：
向d-6-02(3.00g，9.5mmol)和磷酸二氢钠(3.90g，33.1mmol)在叔丁醇/水(50ml/4ml)中的混合物中加入2-甲基-2-丁烯(3.31g，47.0mmol)。然后滴加亚氯酸钠(2.62g，28.4mmol)在水(4ml)中的混合物。将该混合物在室温搅拌5h。减压除去溶剂，用2mhcl将所得物调整至ph＝6.0。用乙酸乙酯(2x30ml)萃取该混合物。干燥有机相，浓缩，得到d-6-02-1(2.61g，83％)，为浅黄色固体。在后面的步骤中，按照与d-6-05类似的方式合成d-6-01。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-01(5.2mg，24％)，为棕色油状物。
2-环丙基-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-5h-吡咯并[3，2-b]吡嗪-7-甲酰胺(d-6-01)
得到d-6-01，为棕色油状物。
收率：1％
mp：
ms(esi)：437(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.35(s，1h)，8.30(s，1h)，7.17(s，1h)，4.95-5.00(m，3h)，4.67(br，2h)，3.86(br，2h)，2.34(br，1h)，1.31(d，j＝6.4hz，6h)，1.10-1.14(m，4h).
13cnmr(d6-dmso，300hz)：
d-6-05：
按照与d-3-02-3-2类似的方式合成d-6-05-1。向d-6-05-1(20mg,0.03mmol)在dcm(3ml)中的溶液中加入tfa(2ml)。将该溶液在室温搅拌2h，然后浓缩。将残余物再溶于dcm(5ml)，加入4nnaoh(5ml)。将该溶液在室温搅拌过夜。用2nhcl将该溶液的ph调整至7。浓缩所得物，用meoh/dcm＝1/10(8mlx3)洗涤固体。浓缩有机相，通过制备型-hplc纯化残余物，得到产物d-6-05(6mg,43％)，为浅白色固体。
(s)-2-环丙基-n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-5h-吡咯并[3,2-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-05，为浅白色固体。
收率：19％
mp：
ms(esi)：536(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ9.01(d，j＝6.8hz，1h)，8.38(s，1h)，8.23(s，1h)，7.07(s，1h)，4.90(s，1h)，4.68(d，j＝5.2hz，1h)，4.56-4.60(m，1h)，4.50(s，3h)，3.74-3.77(m，2h)，2.33-2.35(m，2h)，1.26-1.29(m，4h)，1.11-1.17(m，12h).
d-6-06：
按照与d-6-05类似的方式合成了d-6-06。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-06(5mg，36％)，为白色固体。
2-环丙基-n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-1-氧代丁烷-2-基)-5h-吡咯并[3，2-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-06，为白色固体。
收率：16％
mp：
ms(esi)：522(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.62(s，1h)，8.82(d，j＝5.6hz，1h)，8.73(d，j＝7.6hz，1h)，8.41(s，1h)，8.29(d，j＝2.8hz，1h)，6.59(s，1h)，4.70-4.74(m，1h)，4.60-4.64(m，1h)，4.45-4.49(m，2h)，4.25-4.33(m，2h)，3.66(s，2h)，2.34(d，j＝8.0hz，1h)，1.77-1.87(m，2h)，1.17(d，j＝4.8hz，6h)，1.06(t，j＝3.2hz，4h)，0.93-1.02(m，3h).
d-6-07：
按照与d-6-05类似的方式合成了d-6-07。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-07(3mg，21％)，为白色固体。
(r)-2-环丙基-n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代-1-苯基乙基)-5h-吡咯并[3，2-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-07，为白色固体。
收率：9％
mp：
ms(esi)：570(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.62(s，1h)，9.34(d，j＝8.0hz，1h)，9.05(s，1h)，8.43(s，1h)，8.30(d，j＝1.4hz，1h)，7.52(d，j＝7.2hz，2h)，7.41(t，j＝7.2hz，2h)，7.35(d，j＝7.2hz，1h)，6.36(s，1h)，5.73(d，j＝7.6hz，1h)，4.68(d，j＝6.8hz，1h)，4.40-4.44(m，1h)，4.07-4.09(m，2h)，3.47-3.49(m，2h)，3.34-3.38(m，2h)，2.33(d，j＝3.6hz，1h)，1.22-1.23(m，6h)，1.13-1.15(m，4h).
d-6-08：
按照与d-6-05类似的方式合成了d-6-08。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-08(10mg，71％)，为浅白色固体。
2-环丙基-n-(6-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-6-氧代己基)-5h-吡咯并[3，2-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-08，为浅白色固体。
收率：31％
mp：
ms(esi)：550(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.34(s，1h)，8.21(s，1h)，7.11(s，1h)，4.57-4.64(m，4h)，4.11(d，j＝7.2hz，1h)，3.81(s，2h)，3.53(s，2h)，2.33-2.39(m，2h)，2.04(d，j＝9.2hz，1h)，1.72-1.77(m，4h)，1.54(s，2h)，1.24-1.31(m，6h)，1.09-1.15(m，4h).
d-6-09：
按照与d-3-02-3类似的方式合成了d-6-09。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-09(5mg，42％)，为棕色油状物。
(3r)-3-(5-氟-2-(3-氧代-3，8a-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-6-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-4-甲基戊酰胺
得到d-6-09，为棕色油状物。
收率：16％
mp：
ms(esi)：594(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.64(s，1h)，7.94-8.09(m，2h)，7.23(t，j＝9.6hz，1h)，6.56(s，1h)，4.91(s，1h)，4.72-4.80(m，2h)，4.52(s，2h)，4.34-4.37(m，2h)，3.67(s，1h)，2.73-2.80(m，2h)，1.95-2.00(m，1h)，1.20-1.32(m，6h)，1.00-1.12(m，6h).
d-6-10：
按照与d-6-05类似的方式合成了d-6-10。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-10(10mg，71％)，为棕色固体。
2-环丙基-n-(1-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基甲酰基)环己基)-5h-吡咯并[3，2-b]吡嗪-7-甲酰胺
得到d-6-10，为棕色固体。
收率：31％
mp：
ms(esi)：562(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.92(s，1h)，8.39(s，1h)，8.21(s，1h)，7.07(s，1h)，4.94(s，1h)，4.45-4.48(m，4h)，3.75(d，j＝9.2hz，2h)，2.30-2.38(m，4h)，1.91-1.98(m，1h)，1.79-1.82(m，4h)，1.67-1.70(m，2h)，1.29-1.37(m，6h)，1.12-1.18(m，4h).
d-6-11：
按照与d-3-02-3类似的方式合成了d-6-11。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-11(5mg,55％)，为棕色固体。
(2s)-2-(5-氟-2-(3-氧代-3,8a-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基)-3-甲基丁酰胺
得到d-6-11，为棕色固体。
收率：29％
mp：
ms(esi)：580(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.50(s，1h)，8.18(s，1h)，8.01(d，j＝5.6hz，1h)，7.14(d，j＝9.6hz，1h)，6.59(s，1h)，4.85-4.90(m，1h)，4.68-4.71(m，2h)，4.29-4.33(m，2h)，4.17-4.26(m，1h)，3.80(d，j＝5.6hz，1h)，3.45-3.50(m，1h)，2.25-2.28(m，1h)，1.08-1.19(m，12h).
d-6-12：
按照与d-3-02-3类似的方式合成了d-6-12。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-12(3mg，23％)，为黄色固体。
6-(5-氟-2-(3-氧代-3，8a-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡啶-6-基)嘧啶-4-基氨基)-n-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)己酰胺
得到d-6-12，为黄色固体。
收率：19％
mp：
ms(esi)：594(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.73(s，1h)，8.08-8.12(m，2h)，7.24-7.27(m，1h)，6.78(s，1h)，4.52(s，1h)，4.40-4.42(m，2h)，3.75(s，2h)，3.64(t，j＝6.8hz，2h)，2.37(t，j＝6.8hz，2h)，1.77(t，j＝6.8hz，4h)，1.49-1.53(m，2h)，1.30-1.33(m，2h)，1.27(d，j＝6.8hz，6h)
d-6-13：
d-6-13-1的合成：
将e-002(30.00mg，0.1mmol)在乙烷-1，2-二胺(0.5ml)中的混合物在室温搅拌0.5h。通过制备型-hplc纯化所得物，得到d-6-13-1(19.20mg，50％)，为白色固体。
d-6-13-2的合成：
向d-6-02-1(16.65mg，0.05mmol)和d-6-13-1(19.20mg，0.05mmol)在dmf(1ml)中的混合物中加入三乙胺(10.10mg，0.10mmol)和hatu(28.50mg，0.075mmol)。将该混合物在室温搅拌10h。通过制备型-tlc纯化所得物，得到d-6-13-2(15.70mg，45％)，为白色固体。
d-6-13的合成：
在20℃向d-6-13-2(15.70mg，0.022mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入三氟乙酸(0.5ml)。6h后，真空浓缩该混合物。将残余物混悬于thf(1ml)中，加入2.0mnaoh水溶液(1ml)。将混合物在室温搅拌15h，然后真空浓缩。加入水(5ml)，用乙酸乙酯(2x2ml)萃取所得物。干燥有机相，真空浓缩。通过制备型-hplc纯化残余物，得到d-6-13(4.3mg，40％)，为浅白色固体。
2-环丙基-n-(2-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)乙基)-5h-吡咯并[2，3-b]吡嗪-7-甲酰胺(d-6-13)
得到d-6-13，为浅白色固体。
收率：1％
mp：
ms(esi)：480(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.18(d，j＝5.6hz，2h)，6.61(s，1h)，4.75(s，1h)，4.42(s，2h)，4.30-4.31(m，2h)，3.80-3.81(m，2h)，3.64-3.65(m，2h)，3.40-3.41(m，2h)，2.21(s，1h)，1.17(d，j＝6.8hz，6h)，0.94-0.96(m，4h)
13cnmr(d6-dmso，300hz)：
d-6-14：
按照与d-3-01-3类似的方式合成了d-6-14。通过制备型-hplc纯化，得到d-6-14(10.00mg，46％)，为浅黄色固体。
(s)-2-环丙基-n-(3-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-3-氧代-1-苯基丙基)-5h-吡咯并[2，3-b]吡嗪-7-甲酰胺(d-6-14)
得到d-6-14，为浅黄色固体。
收率：1％
mp：
ms(esi)：584(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz)：
δ8.34(s，1h)，8.15(s，1h)，7.45(d，j＝7.2hz，2h)，7.36(t，j＝7.2hz，2h)，7.29(t，j＝7.2hz，1h)，6.87(s，1h)，5.63(t，j＝4.0hz，1h)，4.85-4.90(m，1h)，4.49(s，2h)，4.26(t，j＝5.2hz，2h)，3.59-3.65(m，2h)，2.92-3.00(m，2h)，2.28-2.33(m，1h)，1.30-1.32(m，1h)，1.27(d，j＝6.8hz，7h)，1.09-1.15(m，2h)，0.98-1.02(m，1h).
13cnmr(d6-dmso，300hz)：
向d-6-02-1(33.30mg,0.10mmol)和(s)-2-氨基-2-环丙基乙酸甲酯盐酸盐(16.51mg,0.10mmol)在dmf(1ml)中的混合物中加入三乙胺(20.20mg,0.20mmol)和hatu(57.00mg,0.15mmol)。将该混合物在室温搅拌10h。通过制备型-tlc纯化所得物，得到d-6-15-1(30.00mg,67％)，为白色固体。
d-6-15-2的合成：
将d-6-15-1(30.00mg,0.068mmol)和氢氧化锂水合物(5.40mg,0.14mmol)在乙醇(1ml))中的混合物在室温搅拌4h。真空除去溶剂，将所得物调整至ph＝5。过滤出形成的沉淀，真空干燥，得到d-6-15-2(20.00mg,69％)，为白色固体。
d-6-15-3的合成：
向d-6-15-2(20.00mg,0.047mmol)和e-001(15.86mg,0.047mmol)在dmf(1ml)中的混合物中加入k2co3(12.84mg,0.093mmol)和hatu(26.51mg,0.070mmol)。将该混合物在30℃搅拌5h。通过制备型-tlc纯化所得物，得到d-6-15-3(20.00mg,57％)，为浅黄色固体。
d-6-15的合成：
在20℃向d-6-15-3(20.00mg,0.027mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入三氟乙酸(0.5ml)。6h后，真空浓缩该混合物。将残余物混悬于thf(1ml)中，加入2.0mnaoh水溶液(1ml)。将该混合物在室温搅拌15h，然后真空浓缩。加入水(5ml)，用乙酸乙酯(2x2ml)萃取所得物。干燥有机相，真空浓缩。通过制备型-hplc纯化残余物，得到d-6-15(8.2mg,58％)，为白色固体。
(r)-2-环丙基-n-(1-环丙基-2-((9-羟基-2-异丙基-1,8-二氧代-2,3,4,8-四氢-1h-吡啶并[1,2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-2-氧代乙基)-5h-吡咯并[3,2-b]吡嗪-7-甲酰胺(d-6-15)
得到d-6-15，为浅白色固体。
收率：1％
mp：
ms(esi)：534(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ12.97(br，s，1h)，12.63(d，j＝2.8hz，1h)，8.77-8.85(m，2h)，8.49(s，1h)，8.28(d，j＝2.8hz，1h)，6.69(s，1h)，4.71-4.76(m，1h)，4.48-4.53(m，2h)，4.32-4.38(m，2h)，4.21-4.28(m，1h)，3.68(t，j＝5.2hz，2h)，2.31-2.37(m，1h)，1.17-1.26(m，8h)，1.01-1.13(m，3h)，0.50-0.58(m，3h)，0.41-0.45(m，1h).
13cnmr(d6-dmso，300hz)：
2-环丙基-n-(1-环丙基-3-((9-羟基-2-异丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氢-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基氨基)-3-氧代丙基)-5h-吡咯并[2，3-b]吡嗪-7-甲酰胺(d-6-16)
按照与d-6-15相同的方式得到d-6-16，为浅白色固体。
收率：1％
mp：
ms(esi)：548(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)：
δ13.05(br，s，1h)，12.57(d，j＝2.8hz，1h)，8.71(t，j＝5.6hz，1h)，8.38(s，1h)，8.35(d，j＝8.8hz，1h)，8.19(d，j＝3.2hz，1h)，6.79(s，1h)，4.66-4.73(m，1h)，4.45-4.48(m，2h)，4.28-4.32(m，2h)，3.94(t，j＝8.0hz，1h)，3.62(d，j＝3.2hz，2h)，2.58-2.61(m，2h)，2.29-2.34(m，1h)，0.98-1.18(m，11h)，0.41-0.49(m，2h)，0.30-0.34(m，1h)，0.22-0.27(m，1h)
13cnmr(d6-dmso，300hz)：