CD44的分离的多肽及其应用的制作方法

发明领域和背景

本发明，在其一些实施方案中，涉及cd44的分离的多肽，且更特别地，但不排外地，涉及cd44vra的分离的多肽及其在治疗炎性疾病中的用途。

cd44是一种细胞表面粘附分子，其参与多种细胞功能，包括细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞迁移、程序性细胞死亡(细胞凋亡)，或相反地，细胞存活和增殖。

cd44是对于透明质酸(ha)的主要细胞表面受体，但它也已显示结合蛋白例如胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、粘膜血管地址素和骨桥蛋白。cd44对于将循环淋巴细胞募集到炎症部位是必要的，并且cd44(和有时透明质酸)的显著积聚，在密集细胞迁移和细胞增殖的区域被检测到，如在创伤愈合、组织重塑、炎症、形态发生和癌发生中。

小鼠和人cd44的基因组序列包含在5'末端的5个恒定外显子，和在3'端的5个恒定外显子。小鼠cd44基因包含在分子中间的10个变体外显子，称为v1-v10，导致总共20个外显子。人cd44基因仅包含这10个变体外显子中的9个(v2-v10)，因此包含总共19个外显子。不同的v2-v10选择性剪接产生cd44的许多同种型，其表达变体外显子(称为外显子vx，x=1-10)的各种组合，其被插入近膜结构域中并构成分子的可变区。这些分子被称为cd44变体(cd44v)。到目前为止已知有几十个cd44同种型。

cd44s，其不包含任何变体外显子，是最普遍存在的形式，并被大多数类型的细胞表达[ponta,h.等人natrevmolcellbiol.2003jan;4(1):33-45]。cd44变体蛋白，其中包含10个变体外显子的一个或多个，大多数被报道与癌症，和自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎和多发性硬化有关[见例如naor等adv.cancerres.,71,241-319,1997；和naor等criticalreviewsinclinicallaboratorysciences.39,527-579,2002]。

患有类风湿性关节炎(ra)的患者的关节炎性细胞显示一个称为cd44vra的选择性剪接cd44变体的序列。人cd44vra含有与角化细胞cd44v3-v10同种型的序列相同的序列，其中在变体外显子4和变体外显子5之间的剪接接合处加入额外的丙氨酸，其不干扰阅读框。患有胶原诱导的关节炎(cia)的小鼠在相同的位点含有也包括丙氨酸的类似的序列。cd44vra序列在ra患者和银屑病关节炎(pa)患者的关节炎性滑膜细胞上表达，但既不在健康供体的角化细胞也不在外周血白细胞(pbls)上表达。此外，虽然ra患者的关节炎性细胞表达cd44vra，但得自同一患者的pbls和得自骨关节炎患者的滑膜液细胞几乎不能表达这种变体，表明这种同种型的排他性(nedvetzki等,jclininvest111:1211-1220,2003;golan等,jautoimm28:99-113,2007)。

已有报道抗-cd44抗体、cd44蛋白、肽或衍生物的给予可用来治疗各种自身免疫性疾病(如naor等,adv.cancerres.,71,241-319,1997;naor等,criticalreviewsinclinicallaboratorysciences.39,527-579,2002;turleyea和naord.frontbiosci.17:1775-1794,2012)。此外，抗-cd44vra单克隆抗体和cd44vra-衍生的肽先前已被提出(golan等,jautoimm28:99-113,2007,国际申请公布号：wo2010/058396、wo2005/007700；wo2003/014160、wo2000/075312；美国专利号us7,534,605和us8,193,311；和美国专利申请公布号：us20060019340)。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，在此提供一种由选自seqidnos:1-3的氨基酸序列组成的分离的多肽。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，在此提供包含选自seqidnos:1-3的氨基酸序列的分离的封端修饰的多肽，其中修饰的多肽具有抗炎活性。

根据本发明的一些实施方案，所述封端包含n末端封端。

根据本发明的一些实施方案，所述n末端封端包含乙酰基。

根据本发明的一些实施方案，所述封端包含c末端封端。

根据本发明的一些实施方案，所述c末端封端包含酰胺。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽由选自seqidnos:1-3的氨基酸序列组成。

根据本发明的一些实施方案，所述多肽如在seqidno:1中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述封端修饰的多肽选自seqidnos:4-6。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种包含分离的多肽和连接于分离的多肽的非蛋白质部分的物质组合物，其中分离的融合多肽具有抗炎活性。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种包含具有c和/或n末端连接的氨基酸序列的分离的多肽的分离的融合多肽，其中c末端氨基酸序列是具有分离的融合多肽的非连续的cd44vra氨基酸序列；和其中融合多肽具有抗炎活性。

根据本发明的一些实施方案，所述连接是共价连接。

根据本发明的一些实施方案，抗炎活性不依赖于疫苗接种或粘膜耐受性。

根据本发明的一些实施方案，分离的多肽或物质组合物能够结合选自血清淀粉样蛋白a、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种包含作为活性剂的分离的多肽或物质组合物；和药学上可接受的载体或稀释剂的药用组合物。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的分离的多肽、物质组合物或药用组合物，从而治疗受试者的炎性疾病。

根据本发明的一些实施方案，在此提供分离的多肽、物质组合物或药用组合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

根据本发明的一些实施方案，给药包括口服给药。

根据本发明的一些实施方案，组合物被配制用于口服给药。

根据本发明的一些实施方案，炎性疾病涉及表达cd44vra的细胞。

根据本发明的一些实施方案，炎性疾病选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎、阿尔茨海默氏病、癌症和心血管疾病。

根据本发明的一些实施方案，炎性疾病是类风湿性关节炎。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种包含编码分离的多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，在此提供包含分离的多核苷酸的核酸构建体。

根据本发明的一些实施方案，在此提供一种确定一批分离的多肽、物质组合物或药用组合物的效力的方法，该方法包括：

(a)使一批分离的多肽、物质组合物或药用组合物与从类风湿性关节炎患者的发炎关节获得的成纤维细胞接触；和

(b)在预定的培养时间之后确定成纤维细胞的存活，以确定该批的效力。

根据本发明的一些实施方案，该方法包括在接触前合成具有修饰的分离的多肽、物质组合物或药用组合物。

根据本发明的一些实施方案，在接触后成纤维细胞的存活减少是该批有效力的指示。

根据本发明的一些实施方案，该方法前包括比较所述细胞的存活与所述细胞与标准参照批的分离的多肽、物质组合物或药用组合物接触后的存活，以确定所述批的相对效力。

根据本发明的一些实施方案，该方法在体外或离体实现。

除非另外限定，本文使用的全部技术和/或科学术语，具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。虽然类似或等同于在此描述的那些方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或测试中，下文描述示例性方法和/或材料。在有抵触的情况下，应以本专利申请，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不打算必然是限制性的。

附图简述

本发明的一些实施方案仅仅通过举例，参考附图在此描述。现在详细地具体参考附图，强调的是，所示的细节是通过举例的方式并且是为了本发明的实施方案的说明性论述的目的。在这一点，用附图进行描述使得本领域技术人员可对如何实施本发明的实施方案显而易见。

在附图中：

图1显示出表明5-merra肽(seqidno:1)在指定的温度下贮藏后的%稳定性的液相色谱-质谱(lcms)分析；假定于-20℃贮藏代表100%稳定性。

图2a-c是表明9-merra肽(seqidno:3)减少胶原诱导的关节炎(cia)的dba/1背景小鼠的关节炎症的图。所述图显示在9-mer肽以25µg(图2a)、100µg(图2b)或150µg(图2c)的剂量，在指定的时间点(用箭头标记)注射后的爪肿胀。pbs注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时(时间0)的爪宽度之间的差异(mm)的∆爪肿胀。结果表示为均值±se；各组的小鼠数目(n)在各图的插文中指明；*p<0.05。

图3a-c表明，用5-merra肽(seqidno:1)治疗可恢复cia小鼠(c57bl/6背景)的发炎关节的正常组织学。图3a和3b是得自用pbs对照(图3a)或5-merra肽(图3b)治疗小鼠的h&e染色的后肢关节切片的代表性显微照片。图3c是概括如通过对来自用pbs对照(n=7)或5-merra肽(n=7)治疗小鼠的h&e染色的后肢关节切片的组织学检查评估的平均炎性评分的图，其中0表示无浸润和4表示大量的浸润。p<0.0001。

图4是表明7-和9-mer保护的ra肽(seqidnos:5-6)减少dba/1背景的cia小鼠的关节炎症的图。该图显示所述肽以200µg的剂量，在指定的时间点(用箭头标记)注射后的爪肿胀。pbs注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时(时间0)的爪宽度之间的差异(mm)的∆爪肿胀。结果表示为均值±se；各组的小鼠数目(n)在各图的插文中指明；*p<0.05，**p<0.01。

图5a-b是表明5-mer保护的ra肽(seqidno:4)减少dba/1背景的cia小鼠的关节炎症的图。该图显示所述肽以200µg的剂量，在指定的时间点(用箭头标记)注射后的爪肿胀。pbs(图5a和5b)或地塞米松(dex)(图5a)注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时(时间0)的爪宽度之间的差异(mm)的∆爪肿胀。结果表示为均值±se；各组的小鼠数目(n)在各图的插文中指明；*p<0.05,**p<0.01。

图6是表明5-mer保护的ra肽(seqidno:4)减少c57bl背景的cia小鼠的关节炎症的图。该图显示在发病后所述肽以70µg的剂量注射连续10天之后的爪肿胀。pbs注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时(时间0)的爪宽度之间的差异(mm)的∆爪肿胀。结果表示为均值±se；*p<0.006。

图7a-c是表明7-mer保护的ra肽(其包含核心mtadv序列(seqidno:5))，减少dba/1背景的cia小鼠的关节炎症的图，而非特异性核心混杂的7-mer肽(seqidno:7)对这个模型的关节炎症没有效果。该图显示所述肽以200µg的剂量，在指定的时间点(用箭头标记)注射后的爪肿胀。pbs注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时的爪宽度(时间0，图7b)之间的差异的爪肿胀(mm)(图7a和7c)或∆爪肿胀(图7b)。结果表示为均值±se；各组的小鼠数目(n)在各图的插文中指明；*p<0.05，**p<0.005。

图8是显示根据表6中描述的实验方法，cia小鼠在7-mer保护的ra肽(seqidno:5)或非特异性混杂的7-mer肽(seqidno:7)注射后，健康后爪的百分比的条形图。pbs注射作为对照。

图9a-b是表明用5-mer保护的ra肽(seqidno:4)，每次注射70µg的剂量是抑制c57bl/6背景的cia小鼠的关节炎症的最适剂量的图。该图显示在发病后，所述肽以70、200和600µg(图9a)或10、25和70µg(图9b)的剂量注射连续10天后的爪肿胀。pbs注射作为对照。y-轴代表指示在每个测量时间点的爪宽度和疾病发生时(时间0)的爪宽度之间的差异的∆爪肿胀。结果表示为均值±se；各组的小鼠数目(n)在各图的插文中指明；*p在各图上指明。

图10显示表明5-merra肽(seqidno:1)对c57bl/6小鼠的迟发型超敏反应(dth)的响应的效果的图。y-轴代表在第7天的右耳和左耳之间的厚度差异。用pbs和抗-tnfα治疗分别用作阳性和阴性对照。结果表示为均值±se。dth方案包括在0天用噁唑酮致敏；在第6天用噁唑酮在耳中诱发(攻击)；并在第7天测量耳厚度。从第-1天至第7天注射pbs或肽。

图11是显示在用5-mer肽(seqidno:1)治疗的小鼠的血清中，缺乏中和抗-肽特异性抗体的图，如通过elisa测定的。elisa板用5-mer肽或用胶原蛋白和小鼠igg(其用作阳性对照)包被。将来自用5-mer肽或用pbs治疗的小鼠的血清加入到板孔中。来自幼稚(naïve)小鼠和用pbs处理的小鼠的血清用作阴性对照。

图12是用来鉴定5-mer肽靶蛋白的程序的示意图。

图13是显示5-merra肽(seqidno:1)在单次注射所述肽后的小鼠的血清中的药代动力学消除的图。

图14是表明5-merra肽(seqidno:1)对从ra患者的发炎关节分离的成纤维细胞的存活的体外作用的图，如通过mtt分析所测定的。

图15是表明血清淀粉样蛋白a(saa)阻止5-merra肽(seqidno:1)对从ra患者的发炎关节分离的成纤维细胞的存活的体外作用的图，如通过mtt分析所测定的。乳白蛋白(la)被用作非特异性对照。5-mer肽以恒定的浓度(25µg/ml)加入；x-轴指明saa和la浓度。

图16是表明与5-mer保护的ra肽(seqidno:4)比较，5-merra肽(seqidno:1)对从ra患者的发炎关节分离的成纤维细胞的存活的体外作用的图，如通过mtt分析所测定的。

本发明的特定实施方案的描述

本发明，在其一些实施方案中，涉及cd44的分离的多肽，且更特别地，但不排外地，涉及cd44vra的分离的多肽及其在治疗炎性疾病中的用途。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解，本发明不必在其应用中限于以下描述中提出的或通过实施例所例举的细节。本发明能够具有其它实施方案，或能够以各种方式实施或执行。

cd44是一种细胞表面粘附分子，其参与多种细胞功能，包括细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞迁移、程序性细胞死亡或相反地，细胞存活和增殖。人cd44的基因组序列包含在5'末端的5个恒定外显子，和在3'端的5个恒定外显子，以及包含在其间的9个变体外显子。到目前为止已知有几十个cd44的剪接变体。cd44s(seqidno:9)，其不包含任何变体外显子，是最普遍存在的形式，并被大多数类型的细胞表达。患有银屑病关节炎(pa)、类风湿性关节炎(ra)的患者的关节炎性细胞存在一种称为cd44vra(seqidno:11)的、既不在健康供体的角化细胞也不在外周血白细胞(pbls)上表达的选择性剪接的cd44变体的序列。

虽然减少了本发明的实践，但本发明人现在已公开，包含mtadv序列(其自cd44vra的变体外显子4和变体外显子5之间的剪接接合处包含丙氨酸而产生)的、短至5、7或9mer的肽能够抑制cia小鼠模型(人ra的小鼠类似物)的关节炎症。不希望受到理论的束缚，相信本发明的一些实施方案的多肽通过与cd44vra的天然配体竞争来引发它们的活性。

如在下文和在跟随的实施例部分中所举例说明的，本发明人已经合成5-、7-和9-mer肽(seqidnos:1-3，在此也称为“ra肽”)以及分别在肽的氨基和羧基末端具有乙酰基和酰胺保护残基的各自的肽(seqidnos:4-6，在此也称为“ra保护的肽”)。所述肽包含疏水性氨基酸，没有蛋白水解位点并且于室温下和4℃经历至少22周是稳定的(实施例1，图1)。合成的ra肽和ra保护的肽能够在cia小鼠模型中体内减少关节炎症(实施例2-4，图2a-b、3a-c；4、5-a-b、6、8和9a-b)。此外，所述肽不引起中和抗-肽特异性抗体的生成，也不影响如通过迟发型超敏反应(dth)响应评价的全身免疫应答(实施例5-6，图10-11)。重要的是，一个混杂的非特异性7-mer保护的肽(seqidno:7)在cia小鼠模型中对关节炎症没有作用(实施例3图7a-b和8)。质谱分析进一步揭示了ra肽的几种潜在的靶蛋白，即血清淀粉样蛋白a、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b(实施例7，图12)。此外，本发明人已经开发一种新的体外测定法，以测试ra肽和ra保护的肽的活性(实施例9，图14-16)。

因此，本发明的教导提议在炎性疾病的治疗中，使用包含ra-和ra-保护的肽的组合物。

因此，根据本发明的第一个方面，提供一种由选自seqidnos:1-3的氨基酸序列组成的分离的多肽。

根据特定的实施方案，所述多肽如在seqidno:1中所示。

根据特定的实施方案，所述多肽如在seqidno:2中所示。

根据特定的实施方案，所述多肽如在seqidno:3中所示。

根据本发明的一个方面，提供包含选自seqidnos:1-3的氨基酸序列的分离的封端修饰的多肽，其中所述修饰的多肽具有抗炎活性。

根据特定的实施方案，封端修饰的多肽的多肽氨基酸序列由选自seqidnos:1-3的氨基酸序列组成。

根据本发明的另一个方面，提供包含分离的多肽和连接于分离的多肽的非蛋白质部分的物质组合物，其中分离的融合多肽具有抗炎活性。

根据本发明的另一个方面，提供分离的融合多肽，其包含具有c和/或n末端连接的氨基酸序列的分离的多肽，其中所述c末端氨基酸序列是具有所述分离的融合多肽的非连续的cd44vra氨基酸序列；和其中所述融合多肽具有抗炎活性。

本文可互换使用的术语"肽"和"多肽"涵盖天然肽(或者降解产物，合成的合成肽或重组肽)和拟肽(通常地，合成的合成肽)，以及为肽类似物的类肽(peptoids)和半类肽(semipeptoids)，其可具有，例如，使肽更稳定同时在体内，更能够渗透进入细胞的修饰，以改善清除率、生物分布和/或药代动力学。这样的修饰包括，但不限于n末端修饰、c末端修饰、肽键修饰、骨架修饰，和残基修饰。制备拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在quantitativedrugdesign，c.a.ramsdengd.,第17.2章,f.choplinpergamonpress(1992)中有详细描述，其通过引用结合到本文中，如同完全在本文中提出一样。在这一方面的进一步的细节在后面提供。

在肽内的肽键(-co-nh-)可例如被n-甲基化酰胺键(-n(ch3)-co-)、酯键(-c(=o)-o-)、酮亚甲基键(-co-ch2-)、亚磺酰亚甲基键(-s(=o)-ch2-)、α-aza键(-nh-n(r)-co-)(其中r是任何烷基(如，甲基))、胺键(-ch2-nh-)、硫键(-ch2-s-)、亚乙基键(-ch2-ch2-)、羟亚乙基键(-ch(oh)-ch2-)、硫代酰胺键(-cs-nh-)、烯属双键(-ch=ch-)、含氟烯属双键(-cf=ch-)、逆酰胺键(retroamidebonds)(-nh-co-)、肽衍生物(-n(r)-ch2-co-)(其中r是"正"侧链，天然存在于碳原子上)置换。

这些修饰可发生在沿着肽链的任何键上并甚至同时发生在几个(如2-3个)键上。

天然芳族氨基酸，trp、tyr和phe，可被非-天然芳族氨基酸例如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(tic)、萘基丙氨酸、phe的环-甲基化衍生物、phe的卤化衍生物或o-甲基-tyr置换。

本发明的一些实施方案的肽也可包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非-氨基酸单体(如脂肪酸、复合碳水化合物等)。

术语"氨基酸"或"多个氨基酸"被理解为包含20个天然存在的氨基酸；在体内经常被翻译后修饰的那些氨基酸，包括，例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括，但不限于，2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。而且，术语"氨基酸"包括d-和l-氨基酸二者(立体异构体)。

下表1和2列出天然存在的氨基酸(表1)，和非-常规的或修饰的氨基酸(如，合成的，表2)，其可用于本发明的一些实施方案中。

表1

表2

本发明的多肽的氨基酸可被保守地或者非-保守地置换。

如本文所用的术语“保守置换”，指用具有类似的空间性质的天然或非-天然存在的氨基或拟肽置换存在于肽的天然序列中的氨基酸。当要置换的天然氨基酸的侧链是极性或者疏水性时，保守置换应该用(除了具有与置换的氨基酸的侧链的相同空间性质外)也是极性或疏水性的天然存在的氨基酸、非-天然存在的氨基酸或拟肽部分进行。

因为天然存在的氨基酸通常根据它们的性质分组，经天然存在的氨基酸的保守置换可容易地根据以下事实而确定，即根据本发明，荷电的氨基酸被空间上类似的非-荷电的氨基酸置换被认为是保守置换。

为了产生由非-天然存在的氨基酸的保守置换，也可能使用本领域熟知的氨基酸类似物(合成的氨基酸)。天然存在的氨基酸的拟肽在熟练的专业人员已知的文献中是有充分的文字记载的。

当影响保守置换时，置换氨基酸应在侧链中具有与原始氨基酸相同的或类似的官能团。

如本文所用的短语"非-保守置换"指存在于母体序列的氨基酸被具有不同的电化学和/或空间性质的另一个天然或非-天然存在的氨基酸置换。因此，置换氨基酸的侧链可显著地大(或小)于被置换的天然氨基酸的侧链和/或可具有与被置换的氨基酸显著不同的电子性质的官能团。这种类型的非-保守置换的实例包括苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸对丙氨酸，异亮氨酸对甘氨酸，或对天冬氨酸的置换。落入本发明的范围内的那些非-保守置换是仍然构成具有神经保护特性的肽的那些。

本发明的一些实施方案的肽优选地采用线性形式，虽然应意识到，在其中环化不严重干扰肽的特性的情况下，也可使用环化形式的肽。

由于本发明的肽优选地用于需要肽为可溶形式的治疗剂中，本发明的一些实施方案的肽优选地包含一个或多个非-天然或天然的极性氨基酸，包括，但不限于丝氨酸和苏氨酸，其由于它们的含羟基侧链而能够增加肽的溶解性。

如提到的，本发明的肽的n和c末端可由官能团保护。合适的官能团被描述于green和wuts,"有机合成中的保护基团(protectinggroupsinorganicsynthesis)",johnwileyandsons,第5和7章,1991中，其教导通过引用结合到本文中。因此，所述多肽可在其n-(胺)末端和/或c-(羧基)末端进行修饰，以产生封端修饰的肽。

如本文所用的，短语“封端修饰的多肽”和“保护的多肽”，其在本文可互换使用，指已在其n-(胺)末端和/或c-(羧基)末端修饰的多肽。封端修饰指化学部分附接于多肽的末端，以形成帽。这样的化学部分在本文被称为封端部分并且通常也在本文和在本领域被互换称为肽保护部分或基团。羟基保护基团包括，但不限于酯、碳酸酯和氨基甲酸酯保护基团。胺保护基团包括，但不限于烷氧基和芳氧基羰基基团。羧酸保护基团包括，但不限于脂族酯、苄型酯和芳基酯。

如本文所用的短语"封端部分"，指当连接于肽的末端时修饰肽的n和/或c末端的部分。封端修饰通常导致屏蔽肽末端的电荷，和/或改变其化学特征，例如，疏水性、亲水性、反应性、溶解性等。通过选择封端修饰的特性，肽的疏水性/亲水性以及溶解性可被精细地控制。根据特定的实施方案，保护基团促进其连接的肽运输进入细胞。这些部分可在细胞内通过水解或者经酶促在体内裂解。

根据特定的实施方案，封端修饰不会损害多肽的生物学活性(即抗炎活性)。适合于肽封端修饰的部分的实例可例如在green等,"有机化学的保护基团(protectivegroupsinorganicchemistry)",(wiley,2.sup.nded.1991)和harrison等,"合成有机方法大全(compendiumofsyntheticorganicmethods)",vols.1-8(johnwileyandsons,1971-1996)中找到。

根据特定的实施方案，封端包含n末端封端。

n-末端封端部分的代表性实例包括，但不限于，甲酰基、乙酰基(在此也称为“ac”)、三氟乙酰基、苄基、苄氧基羰基(在此也称为"cbz")、叔丁氧基羰基(在此也称为"boc")、三甲基甲硅烷基(也称为"tms")、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(也称为"ses")、三苯甲基和取代的三苯甲基基团、烯丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(在此也称为"fmoc")，和硝基-藜芦基氧基羰基("nvoc")。

根据特定的实施方案，n末端封端包含乙酰基。

根据特定的实施方案，封端包含c末端封端。

c-末端封端部分的代表性实例通常是导致在c-末端的羧基基团酰化的部分并包括，但不限于，苄基和三苯甲基醚以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚、烯丙基醚、一甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。或者，c-末端封端的–cooh基团可被修饰成酰胺基团。

根据特定的实施方案，c末端封端包含酰胺。

肽的其它封端修饰包括胺和/或羧基用不同的部分，例如羟基、硫醇、卤化物、烷基、芳基、烷氧基、芳氧基等置换。

根据特定的实施方案，所述肽仅在其n-末端或c-末端进行修饰。

根据其它特定的实施方案，所述肽在n-末端和c-末端二者上进行修饰。

根据特定的实施方案，所述肽在n-末端用乙酰基和在c末端用酰胺修饰。

根据特定的实施方案，封端修饰的多肽选自seqidnos:4-6。

本发明还提供包含根据本发明的肽、类似物和衍生物的多肽缀合物和融合多肽。

因此，如提到的，根据本发明的一个方面，提供一种分离的融合多肽，其包含具有c和/或n末端连接的氨基酸序列的分离的多肽，其中所述c末端氨基酸序列是具有所述分离的融合多肽的非连续的cd44vra氨基酸序列；和其中所述融合多肽具有抗炎活性。

如本文所用的，短语“非连续的cd44vra氨基酸序列”指不包含seqidnos:1、2或3的氨基酸序列的融合多肽，所述氨基酸序列在其c末端直接连接于分别在seqidno:11的配位306、308或308起始的cd44vra的氨基酸序列。

根据特定的实施方案，分离的多肽和连接的氨基酸序列被直接或通过间隔基或接头(其可以是合成的或氨基酸接头)共价连接。

如本文所用的，术语"cd44"指在大量的哺乳动物细胞类型中表达并由cd44基因编码的细胞表面蛋白。根据特定的实施方案，cd44是人cd44基因。包含外显子1-5和16-20的标准同种型，称为cd44，在大多数细胞类型中表达并以genebank登录号nm_000610和np_000601(seqidnos:8和9)列出。

如本文所用的，术语“cd44vra”(seqidno:10和11)指在炎症部位，如在ra患者的滑膜液细胞上，但不在健康个体的pbls上表达的cd44变体。cd44vra变体是天然存在的序列，其推测是由出现在炎性部位(如在ra患者的关节)的细胞中的已知的cd44基因的原始转录物的选择性剪接产生的，并不从已知的cd44基因的截短或突变产生。这种cd44vra变体序列包含cd44基因的恒定部分的外显子1-5、15-17和19以及所述基因的可变区的外显子7-14(v3-v10)。变体编码序列包含3个额外的碱基(cag)，它们从桥接外显子v4至外显子v5的内含子末端转录并在外显子v5的5'端插入。这种额外的cag序列导致对于氨基酸丙氨酸的新密码子在seqidno:11的303位的插入，同时留下完整的阅读框。

术语“cd44”和“cd44vra”，也指显示出所需活性(如细胞迁移和/或细胞-细胞和细胞-基质相互作用)的cd44和cd44vra同系物。这样的同系物可以与seqidnos:9和11的多肽具有，例如，至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性或同源性，或与编码所述多肽的多核苷酸序列具有80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性。

同系物也可指直系同源物(ortholog)，缺失、插入或置换变体，包括氨基酸置换，只要它保留活性。

序列同一性或同源性可使用任何蛋白或核酸序列比对算法例如blast、clustalw，和muscle测定。

根据本发明的其它特定的实施方案，肽连接于非蛋白质部分。

根据特定的实施方案，分离的多肽和连接的非蛋白质部分直接或通过间隔基或接头共价连接。

如本文所用的短语“非蛋白质部分”指不包括连接上述肽的肽键合氨基酸的分子。根据特定的实施方案，非-蛋白质是一种非-毒性部分。可根据本发明的教导使用的示例性非-蛋白质部分包括，但不限于药物、化学物、小分子、多核苷酸、可检测的部分、聚乙二醇(peg)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)(sma)，和二乙烯醚和马来酸酐共聚物(divema)。根据本发明的特定实施方案，非蛋白质部分包含聚乙二醇(peg)。

这样一种分子是高度稳定的(抵抗体内蛋白水解活性，很可能是由于由非蛋白质部分赋予的空间位阻所致)并可使用普通的固相合成方法生产，该方法是低成本、高效率的，如在下文进一步描述的。然而，应意识到还可采用重组技术，由此重组肽产物经受体外修饰(如在下文进一步描述的peg化)。

多肽氨基酸序列与peg的生物缀合(即，peg化)可使用peg衍生物进行，例如peg羧酸的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、单甲氧基peg2-nhs、羧基甲基化peg的琥珀酰亚胺酯(scm-peg)、peg的苯并三唑碳酸酯衍生物、peg的缩水甘油醚、peg对-硝基苯基碳酸酯(peg-npc，例如甲氧基peg-npc)、peg醛、peg-邻二硫吡啶、羰基二咪唑-激活的pegs、peg-硫醇、peg-马来酰亚胺。各种分子量的这样的peg衍生物是可市售获得的[见，例如catalog,polyethyleneglycolandderivatives2000(shearwaterpolymers,inc.,huntsvlle,ala.)]。如果需要，许多以上衍生物可以单官能的一甲氧基peg(mpeg)形式获得。一般来说，加入到本发明的多肽中的peg的分子量(mw)范围应在从数百道尔顿至约100kda(如，在3-30kda之间)。可使用较大的mwpeg，但可能导致peg化多肽的得率的某些损失。较大的peg分子的纯度也应监视，因为要获得与对较低的mwpeg可获得的同样高的纯度的较大mwpeg，可能是困难的。优选使用至少85%纯度，和更优选至少90%纯度、95%纯度，或更高纯度的peg。分子的peg化在例如hermanson,bioconjugatetechniques,academicpresssandiego,calif.(1996),第15章和在zalipsky等,"succinimidylcarbonatesofpolyethyleneglycol"，dunn和ottenbrite编辑,polymericdrugsanddrugdeliverysystems,americanchemicalsociety,washington,d.c.(1991)中进一步讨论。

便利时，peg可通过位点-特异性诱变，连接至多肽的选择的位置，只要保留缀合物的活性即可。peg化的靶标可以是在肽序列的n-末端或c-末端的任何半胱氨酸残基。另外地或备选地，其它半胱氨酸残基可被加入到多肽氨基酸序列(如，在n-末端或c-末端)，从而起着peg化的靶标的作用。可进行计算分析以选择诱变的优选的位置，而不损害所述活性。

可使用激活的peg的各种缀合化学物，例如peg-马来酰亚胺、peg-乙烯砜(vs)、peg-丙烯酸酯(ac)、peg-邻二硫吡啶。制备激活的peg分子的方法是本领域已知的。例如，peg-vs可在氩气下，通过使peg-oh的二氯甲烷(dcm)溶液与nah反应，然后与二-乙烯砜(摩尔比：oh1:nah5:二乙烯砜50，以0.2克peg/mldcm)反应制备。peg-ac在氩气下通过使peg-oh的dcm溶液与丙烯酰氯和三乙胺(摩尔比：oh1:丙烯酰氯1.5:三乙胺2，以0.2克peg/mldcm)反应制得。这样的化学基团可连接至线性化的、2-臂、4-臂，或8-臂peg分子。

生成的缀合分子(如，peg化或pvp-缀合的多肽)使用例如高效液相色谱(hplc)以及生物学分析分离、纯化和定性。

根据特定的实施方案，本发明的多肽的cd44vra肽部分(并非如由seqidnos:1-3组成所列出的那些)是5-100、5-50，或5-40，或5-20、5-15、5-10、5-9、5-7个氨基酸的长度。

根据特定的实施方案，本发明的多肽的肽部分不包含并非如由seqidnos:1-3组成所列出的那些的cd44vra氨基酸序列。

本发明的肽和物质组合物可(共价或非-共价)连接至渗透剂。

如本文所用的短语"渗透剂"指促进任何连接的肽或物质组合物越过细胞膜的易位的试剂。

根据一个实施方案，渗透剂是肽并经由肽键(直接或者间接)连接于多肽。

通常地，肽渗透剂具有含有相对高丰度的正电荷氨基酸例如赖氨酸或精氨酸的氨基酸组成，或者具有含有极性/荷电的氨基酸和非-极性、疏水性氨基酸的交替模式的序列。

根据特定的实施方案，所述多肽在适合于细胞渗透的制剂中提供，其促进如在下文进一步描述的多肽的细胞内传递。

通过非-限制性实例，可使用细胞渗透肽(cpp)序列以促进细胞内渗透；然而，本公开内容并不因此受到限制，并且可使用如本领域技术人员已知的任何合适的渗透剂。

细胞-渗透肽(cpps)是短肽(≤40个氨基酸)，具有获得接近几乎任何细胞内部的能力。它们是高度阳离子的并且通常富含精氨酸和赖氨酸氨基酸。它们具有携带各种各样的共价和非共价缀合的货物例如蛋白、寡核苷酸和甚至200nm的脂质体到细胞中的特殊特性。因此，根据另外的示例性实施方案，cpps可被用来转运多肽或物质组合物至细胞内部。

tat(来自hiv-1的转录激活因子)、pantp(也称为穿膜肽(penetratin)，果蝇的触足同源结构域转录因子)和vp22(来自单纯疱疹病毒)是可以非-毒性和有效的方式进入细胞的cpps的实例，并可适用于本发明的一些实施方案。生产cpps-货物缀合物并用这样的缀合物感染细胞的方案可例如在ltheodore等[thejournalofneuroscience,(1995)15(11):7158-7167]，fawells,等[procnatlacadsciusa,(1994)91:664–668]，和jingbian等[circulationresearch(2007)100:1626-1633]中发现。

本发明的一些实施方案的多肽可通过肽合成领域技术人员已知的任何技术，包括固相和重组技术合成。

在此描述的任何蛋白质的多肽可从多核苷酸编码。这些多核苷酸本身可用作治疗剂或用于药剂的重组生产。

因此，根据本发明的一个方面，提供包含编码本发明的多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。

因此，根据本发明的一个方面，提供包含分离的多核苷酸的核酸构建体。

这样一种核酸构建体或系统包括至少一个用于指导核酸序列表达的顺式-作用调控元件。顺式-作用调控序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的那些以及仅在某些情况下指导核苷酸序列的诱导型表达的那些。因此，例如，在细胞内以组成或诱导的方式指导多核苷酸序列转录的启动子序列被包括在核酸构建体中。

本发明的分离的多肽和物质组合物被赋予抗炎活性。

如本文所用的，短语"抗炎活性"指预防和/或减轻急性和/或慢性炎性反应，和/或预防和/或治疗炎性相关疾病。定性抗炎活性的测定法包括，但不限于随后在使用体外和体内两种炎性病症(如ra)模型的实施例部分中描述的那些。非-限制性实例包括cia小鼠模型的体内爪肿胀(见例如nedvetzki,等,(2004)pnas101,18081-18086)，从cia小鼠获得的关节切片的组织学检查和从ra患者的滑膜液获得的成纤维细胞的体外细胞生存能力，如在下文进一步描述的。

根据特定的实施方案，抗炎活性不依赖于疫苗接种或粘膜耐受性。

根据特定的实施方案，物质组合物的分离的多肽一般不影响免疫反应，如可通过迟发型超敏反应分析(dth)评估的，例如在weiss等,(2000)proc.natl.acad.sci.usa.97,285-290；和随后在实施例部分的实施例5中公开的。

根据特定的实施方案，分离的多肽或物质组合物能够结合选自血清淀粉样蛋白a、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白。

如本文所用的，术语“血清淀粉样蛋白a”或“saa”指saa1、saa2和saa4基因的多核苷酸和表达产物如，多肽。saal还已知为血清淀粉样蛋白al、mgcl11216、pig4、saa，和肿瘤蛋白p53诱导性蛋白4(tp53i4)。根据特定的实施方案，saa1指人saa1，例如在以下genebank号nm_199161和nm_000331和uniprot号:p0dji8(seqidnos:12-14)中提供的。根据特定的实施方案，saa1指小鼠saa1，例如在以下genebank号nm009117(seqidno:15)中提供的。saa2还已知为血清淀粉样蛋白a2和saa。根据特定的实施方案，saa2指人saa2，例如在以下genebank号nm_001127380和nm_030754和uniprot号p0dji8(seqidnos:16-18)中提供的。根据特定的实施方案，saa2指小鼠saa2，例如在以下genebank号nm_011314(seqidno:19)中提供的。根据特定的实施方案，saa4指人saa4，例如在以下genebank号nm_006512和uniprot号p35542(seqidnos:20-21)中提供的。

根据特定的实施方案，术语“saa”指saa1和saa2基因，其属于血清淀粉样蛋白a急性期家族的蛋白。

如本文所用的，术语"甲状腺素运载蛋白"，指ttr基因的多核苷酸和表达产物如，多肽，其是甲状腺激素甲状腺素和视黄醇的蛋白载体。根据特定的实施方案，甲状腺素运载蛋白指人甲状腺素运载蛋白，例如在以下genebank号np_000362和nm_000371(seqidnos:22-23)中提供的。根据其它的特定实施方案，甲状腺素运载蛋白指小鼠甲状腺素运载蛋白，例如在以下genebank号np_038725和nm_013697(seqidnos:24-25)中提供的。

如本文所用的，术语"载脂蛋白b"指apob基因的多核苷酸和表达产物如，多肽。根据特定的实施方案，载脂蛋白b指人载脂蛋白b，例如在以下genebank号np_000375和nm_000384(seqidnos:26-27)中提供的。根据其它的特定实施方案，载脂蛋白b指小鼠载脂蛋白b，例如在以下genebank号np_033823和nm_009693(seqidnos:28-29)中提供的。

凭借它们的抗炎活性，本发明的多肽和物质组合物可被用来治疗它们的发病或进展依赖于cd44vra(活性或表达)的疾病，例如用于治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎(ra)。

因此，根据本发明的一个方面，提供在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的分离的多肽、物质组合物或药用组合物，从而治疗受试者的炎性疾病。

根据本发明的另一个方面，提供分离的多肽、物质组合物或药用组合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

如本文所用的，术语"治疗"指抑制、预防或阻止病理(疾病、紊乱，或病症如，炎症如ra)的发展和/或造成病理的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法和测定可被用来评价病理的发展，并且类似地，各种方法和测定可被用来评价病理的减轻、缓解或消退。

根据特定的实施方案，术语“治疗”指改善与ra和相关疾病有关的症状，减轻疾病的严重性或治愈疾病，或预防疾病的发生，在它们发生之前预防与疾病相关的症状的表现，减慢疾病的进展或与之有关的症状的恶化，加快缓解期的发生，减慢疾病进展的慢性阶段中导致的不可逆性损害，延缓所述进展阶段的发生，提高生存率或更快的恢复，或以上两项或更多项的组合。

如本文所用的，短语"有需要的受试者"指被诊断患有炎性疾病或处于发生炎性疾病的风险中的哺乳动物雄性或雌性受试者(如，人类)。也考虑了兽医应用。受试者可具有任何年龄，包括新生儿、婴儿、少年、青年、成人和老年人。

确定受试者的炎症的方法是本领域熟知的并包括，但不限于，在得自受试者的血样中确定红细胞沉降率(esr)；血浆粘度；c-反应性蛋白水平(crp)；某些炎性细胞因子例如il6和tnfα的水平；和例如用纤维蛋白原测量测定炎症指数和红细胞压积或血红蛋白。

根据特定的实施方案，炎性疾病涉及表达cd44vra的细胞。可评估细胞上cd44vra的表达的测定法的非-限制性实例包括流式细胞术和免疫细胞化学。

炎性疾病(也在此称为炎症或炎性病症)的实例包括，但不限于，慢性炎性疾病和急性炎性疾病。

炎性疾病的实例包括，但不限于与超敏反应有关的炎性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥疾病、过敏性疾病和癌症疾病。

与超敏反应有关的炎性疾病

超敏反应的实例包括，但不限于，i型超敏反应、ii型超敏反应、iii型超敏反应、iv型超敏反应、直接超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、t淋巴细胞介导的超敏反应和dth。

i型或直接超敏反应，例如哮喘。

ii型超敏反应包括，但不限于，类风湿性疾病、类风湿性自身免疫性疾病、类风湿性关节炎(krennv.等,histolhistopathol2000jul;15(3):791)、银屑病关节炎(pa)、脊柱炎、强直性脊柱炎(janvoswinkel等,arthritisres2001;3(3):189)、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(eriksonj.等,immunolres1998;17(1-2):49)、硬化症、系统性硬化症(renaudineauy.等,clindiagnlabimmunol.1999mar;6(2):156);chanot.等,immunolrev1999jun;169:107)、腺疾病、腺自身免疫性疾病、胰腺自身免疫性疾病、糖尿病、i型糖尿病(zimmetp.diabetesresclinpract1996oct;34suppl:s125)、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、graves病(orgiazzij.endocrinolmetabclinnortham2000jun;29(2):339)、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎(braley-mullenh和yus,jimmunol2000dec15;165(12):7262)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto’sthyroiditis)(toyodan.等,nipponrinsho1999aug;57(8):1810)、粘液性水肿、特发性粘液性水肿(mitsumat.nipponrinsho.1999aug;57(8):1759)；自身免疫性生殖疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫(garzakm.等,jreprodimmunol1998feb;37(2):87)、自身免疫性抗-精子不孕(diekmanab.等,amjreprodimmunol.2000mar;43(3):134)、反复胎儿丧失(tincania.等,lupus1998;7suppl2:s107-9)、神经变性疾病、神经疾病、神经自身免疫性疾病、多发性硬化(crossah.等,jneuroimmunol2001jan1;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(oronl.等,jneuraltransmsuppl.1997;49:77)、重症肌无力(infanteaj.和kraige,intrevimmunol1999;18(1-2):83)、运动神经病(kornbergaj.jclinneurosci.2000may;7(3):191)、吉兰-巴雷综合征(guillain-barresyndrome)、神经病和自身免疫性神经病(kusunokis.amjmedsci.2000apr;319(4):234)、肌无力疾病、lambert-eaton肌无力综合征(takamorim.amjmedsci.2000apr;319(4):204)、副肿瘤性神经疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩、非-副肿瘤性僵人综合征、小脑萎缩、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯姆森脑炎(rasmussen’sencephalitis)、肌萎缩侧索硬化症、sydeham舞蹈症、抽动秽语综合征(gillesdelatourettesyndrome)、多内分泌腺病(polyendocrinopathies)、自身免疫性多内分泌腺病(antoinejc.和honnoratj.revneurol(paris)2000jan;156(1):23)；神经病、免疫障碍神经病(nobile-orazioe.等,electroencephalogrclinneurophysiolsuppl1999;50:419)；神经性肌强直、获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩症(vincenta.等,annnyacadsci.1998may13;841:482)、心血管疾病、心血管自身免疫性疾病、动脉粥样硬化(matsuurae.等,lupus.1998;7suppl2:s135)、心肌梗塞(vaaralao.lupus.1998;7suppl2:s132)、血栓症(tincania.等,lupus1998;7suppl2:s107-9)、肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿(wegener’sgranulomatosis)、动脉炎、takayasu动脉炎和川崎综合征(kawasakisyndrome)(praprotniks.等,wienklinwochenschr2000aug25;112(15-16):660)；抗-因子viii自身免疫性疾病(lacroix-desmazess.等,seminthrombhemost.2000;26(2):157)；血管炎、坏死性小血管血管炎、显微镜下多血管炎、churg和strauss综合征、肾小球肾炎、寡免疫的局灶性坏死性肾小球肾炎(pauci-immunefocalnecrotizingglomerulonephritis)、新月体肾小球肾炎(noellh.annmedinterne(paris)2000may;151(3):178)；抗磷脂综合征(flamholzr.等,jclinapheresis1999;14(4):171)；心力衰竭、心力衰竭中的激动剂-样β-肾上腺素受体抗体(wallukatg.等,amjcardiol.1999jun17;83(12a):75h)、血小板减少性紫癜(mocciaf.annitalmedint.1999apr-jun;14(2):114)；溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血(efremovdg.等,leuklymphoma1998jan;28(3-4):285)、胃肠道疾病、胃肠道的自身免疫性疾病、肠道疾病、慢性炎性肠道疾病(garciaherolaa.等,gastroenterolhepatol.2000jan;23(1):16)、乳糜泻疾病(landauye.和shoenfeldy.harefuah2000jan16;138(2):122)、肌肉组织的自身免疫性疾病、肌炎、自身免疫性肌炎、斯耶格伦氏综合征(sjogren’ssyndrome)(feiste.等,intarchallergyimmunol2000sep;123(1):92)；平滑肌自身免疫性疾病(zaulid.等,biomedbiomedpharmacother1999jun;53(5-6):234)、肝疾病、肝自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎(mannsmp.jhepatol2000aug;33(2):326)和原发性胆汁性肝硬化(strassburgcp.等,eurjgastroenterolhepatol.1999jun;11(6):595)。

iv或t型细胞介导的超敏反应，包括，但不限于，类风湿性疾病、类风湿性关节炎(tischr,mcdevittho.procnatlacadsciusa1994jan18;91(2):437)、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(dattask.,lupus1998;7(9):591)、腺疾病、腺自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰腺自身免疫性疾病、1型糖尿病(castanol.和eisenbarthgs.ann.rev.immunol.8:647)；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、graves病(sakatas.等,molcellendocrinol1993mar;92(1):77)；卵巢疾病(garzakm.等,jreprodimmunol1998feb;37(2):87)、前列腺炎、自身免疫性前列腺炎(alexanderrb.等,urology1997dec;50(6):893)、多腺体综合征、自身免疫性多腺体综合征、i型自身免疫性多腺体综合征(harat.等,blood.1991mar1;77(5):1127)、神经疾病、自身免疫性神经疾病、多发性硬化症、神经炎、视神经炎(soderstromm.等,jneurolneurosurgpsychiatry1994may;57(5):544)、重症肌无力(oshimam.等,eurjimmunol1990dec;20(12):2563)、僵人综合征(hiemstrahs.等,procnatlacadsciusa2001mar27;98(7):3988)、心血管疾病、在南美锥虫病(chagas’disease)中的心脏自身免疫(cunha-netoe.等,jclininvest1996oct15;98(8):1709)、自身免疫性血小板减少性紫癜(semplejw.等,blood1996may15;87(10):4245)、抗-辅助t淋巴细胞自身免疫(caporossiap.等,viralimmunol1998;11(1):9)、溶血性贫血(sallahs.等,annhematol1997mar；74(3):139)、肝疾病、肝自身免疫性疾病、肝炎、慢性活动性肝炎(francoa.等,clinimmunolimmunopathol1990mar;54(3):382)、胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(jonesde.clinsci(colch)1996nov;91(5):551)、肾疾病、肾自身免疫性疾病、肾炎、间质性肾炎(kellycj.jamsocnephrol1990aug;1(2):140)、结缔组织疾病、耳疾病、自身免疫性结缔组织疾病、自身免疫性耳疾病(yootj.等,cellimmunol1994aug;157(1):249)、内耳疾病(gloddekb.等,annnyacadsci1997dec29;830:266)、皮肤疾病、皮肤病、真皮疾病、大疱性皮肤疾病、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。注意：几种相同的疾病可由于这些疾病的异质性而分类为不同类型的超敏反应。

迟发型超敏反应的实例包括，但不限于，接触性皮炎和药疹。

t淋巴细胞介导超敏反应的类型的实例包括，但不限于，辅助t淋巴细胞和细胞毒性t淋巴细胞。

辅助t淋巴细胞-介导的超敏反应的实例包括，但不限于，th1淋巴细胞介导的超敏反应和th2淋巴细胞介导的超敏反应。

自身免疫性疾病

包括，但不限于，心血管疾病、类风湿性疾病、腺疾病、胃肠道疾病、皮肤病、肝疾病、神经疾病、肌肉疾病、肾疾病、与生殖相关的疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。

自身免疫性心血管疾病的实例包括，但不限于动脉粥样硬化(matsuurae.等,lupus.1998;7suppl2:s135)、心肌梗塞(vaaralao.lupus.1998;7suppl2:s132)、血栓症(tincania.等,lupus1998;7suppl2:s107-9)、韦格纳氏肉芽肿病、takayasu动脉炎、川崎综合征(praprotniks.等,wienklinwochenschr2000aug25;112(15-16):660)、抗-因子viii自身免疫性疾病(lacroix-desmazess.等,seminthrombhemost.2000;26(2):157)、坏死性小血管脉管炎、显微镜下多血管炎、churg和strauss综合征、寡免疫的局灶性坏死性和新月体肾小球肾炎(noellh.annmedinterne(paris)2000may;151(3):178)、抗磷脂综合征(flamholzr.等,jclinapheresis1999;14(4):171)、抗体-诱导的心力衰竭(wallukatg.等,amjcardiol.1999jun17;83(12a):75h)、血小板减少性紫癜(mocciaf.annitalmedint.1999apr-jun;14(2):114;semplejw.等,blood1996may15;87(10):4245)、自身免疫性溶血性贫血(efremovdg.等,leuklymphoma1998jan;28(3-4):285;sallahs.等,annhematol1997mar;74(3):139)、在南美锥虫病中的心脏自身免疫(cunha-netoe.等,jclininvest1996oct15;98(8):1709)和抗-辅助t淋巴细胞自身免疫(caporossiap.等,viralimmunol1998;11(1):9)。

自身免疫性类风湿性疾病的实例包括，但不限于类风湿性关节炎(krennv.等,histolhistopathol2000jul;15(3):791;tischr,mcdevittho.procnatlacadsciunitssa1994jan18;91(2):437)和强直性脊柱炎(janvoswinkel等,arthritisres2001;3(3):189)。

自身免疫性腺疾病的实例包括，但不限于，胰腺疾病、i型糖尿病、甲状腺疾病、graves病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗-精子不孕、自身免疫性前列腺炎和i型自身免疫性多腺体综合征。疾病包括，但不限于胰腺自身免疫性疾病、1型糖尿病(castanol.和eisenbarthgs.ann.rev.immunol.8:647;zimmetp.diabetesresclinpract1996oct;34suppl:s125)、自身免疫性甲状腺疾病、graves病(orgiazzij.endocrinolmetabclinnortham2000jun;29(2):339;sakatas.等,molcellendocrinol1993mar;92(1):77)、自发性自身免疫性甲状腺炎(braley-mullenh.和yus,jimmunol2000dec15;165(12):7262)、桥本氏甲状腺炎(toyodan.等,nipponrinsho1999aug;57(8):1810)、特发性粘液性水肿(mitsumat.nipponrinsho.1999aug;57(8):1759)、卵巢自身免疫(garzakm.等,jreprodimmunol1998feb;37(2):87)、自身免疫性抗-精子不孕(diekmanab.等,amjreprodimmunol.2000mar;43(3):134)、自身免疫性前列腺炎(alexanderrb.等,urology1997dec;50(6):893)和i型自身免疫性多腺体综合征(harat.等,blood.1991mar1;77(5):1127)。

自身免疫性胃肠道疾病的实例包括，但不限于，慢性炎性肠道疾病(garciaherolaa.等,gastroenterolhepatol.2000jan;23(1):16)、乳糜泻疾病(landauye.和shoenfeldy.harefuah2000jan16;138(2):122)、结肠炎、回肠炎和克罗恩氏病(crohn’sdisease)。

自身免疫性皮肤病的实例包括，但不限于，自身免疫性大疱性皮肤疾病，例如，但不限于，寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。

自身免疫性肝疾病的实例包括，但不限于，肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(francoa.等,clinimmunolimmunopathol1990mar;54(3):382)、原发性胆汁性肝硬化(jonesde.clinsci(colch)1996nov;91(5):551;strassburgcp.等,eurjgastroenterolhepatol.1999jun;11(6):595)和自身免疫性肝炎(mannsmp.jhepatol2000aug;33(2):326)。

自身免疫性神经疾病的实例包括，但不限于，多发性硬化(crossah.等,jneuroimmunol2001jan1;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病(oronl.等,jneuraltransmsuppl.1997;49:77)、重症肌无力(infanteaj.和kraige,intrevimmunol(1999)18(1-2):83;oshimam.等,eurjimmunol(1990)20(12):2563)、神经病、运动神经病(kornbergaj.jclinneurosci.(2000)7(3):191)；吉兰-巴雷综合征和自身免疫性神经病(kusunokis.amjmedsci.(2000)319(4):234)、肌无力、lambert-eaton肌无力综合征(takamorim.amjmedsci.(2000)319(4):204)；副肿瘤性神经疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征(hiemstrahs.等,procnatlacadsciunitssa(2001)98(7):3988)；非-副肿瘤性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯姆森脑炎、肌萎缩侧索硬化症、sydeham舞蹈症、抽动秽语综合征和自身免疫性多内分泌腺病(antoinejc.andhonnoratj.revneurol(paris)2000jan;156(1):23)；免疫障碍神经病(nobile-orazioe.等,electroencephalogrclinneurophysiolsuppl1999;50:419)；获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩症(vincenta.等,annnyacadsci.1998may13;841:482)、神经炎、视神经炎(soderstromm.等,jneurolneurosurgpsychiatry1994may;57(5):544)和神经变性疾病。

自身免疫性肌肉疾病的实例包括，但不限于，肌炎、自身免疫性肌炎和原发性斯耶格伦氏综合征(feiste.等,intarchallergyimmunol2000sep;123(1):92)和平滑肌自身免疫性疾病(zaulid.等,biomedpharmacother1999jun;53(5-6):234)。

自身免疫性肾疾病的实例包括，但不限于，肾炎和自身免疫性间质性肾炎(kellycj.jamsocnephrol1990aug;1(2):140)。

与生殖相关的自身免疫性疾病的实例包括，但不限于，反复胎儿丧失(tincania.等,lupus1998;7suppl2:s107-9)。

自身免疫性结缔组织疾病的实例包括，但不限于，耳疾病、自身免疫性耳疾病(yootj.等,cellimmunol1994aug;157(1):249)和自身免疫性内耳疾病(gloddekb.等,annnyacadsci1997dec29;830:266)。

自身免疫性系统性疾病的实例包括，但不限于，系统性红斑狼疮(eriksonj.等,immunolres1998;17(1-2):49)和系统性硬化症(renaudineauy.等,clindiagnlabimmunol.1999mar;6(2):156);chanot.等,immunolrev1999jun;169:107)。

感染性疾病

感染性疾病的实例包括，但不限于，慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、原虫病、寄生虫病、真菌病、支原体病与朊病毒病。

移植排斥疾病

与移植物移植相关的疾病的实例包括，但不限于，移植排斥、慢性移植排斥、亚急性移植排斥、超急性移植排斥、急性移植排斥和移植物抗宿主疾病。

过敏性疾病

过敏性疾病的实例包括，但不限于，哮喘、麻疹、荨麻疹、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏(venomallergy)、化妆品过敏、乳胶过敏、化学品过敏、药物过敏、昆虫叮咬过敏、动物皮屑过敏、植物刺破过敏、毒常春藤过敏与食物过敏。

癌症疾病

癌症的实例包括，但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤，和白血病。癌症疾病的具体实例有，但不限于：髓系白血病例如慢性髓细胞性白血病、成熟的急性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、伴有增加的嗜碱细胞的急性非淋巴细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病伴嗜酸性粒细胞增多；恶性淋巴瘤，例如伯基特氏(burkitt's)非-何杰金氏淋巴瘤；淋巴细胞性白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病；骨髓增殖性疾病，例如实体瘤良性脑膜瘤、涎腺混合瘤、结肠腺瘤；腺癌，例如小细胞肺癌、肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠、肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤(肺泡)、骨外粘液样软骨肉瘤、尤文氏瘤(ewing'stumor)；其它，包括睾丸和卵巢无性细胞瘤、视网膜母细胞瘤、维尔姆斯瘤(wilms'tumor)、神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌和卵巢癌。

根据特定的实施方案，炎性疾病选自类风湿性关节炎(ra)、银屑病关节炎、阿尔茨海默氏病、癌症和心血管疾病。

根据其它的特定实施方案，炎性疾病包括ra。

如本文所用的，短语“类风湿性关节炎(ra)”指主要影响关节的自身免疫性疾病。ra包括，但限于，成人ra、青少年特发性关节炎、青少年ra和青少年慢性关节炎。ra可根据美国类风湿性协会对类风湿性关节炎分类的标准，或任何类似的标准诊断，并包括活动性、早期(活动性ra诊断至少8周，但不长于4年)和初期(不能充分满足ra的诊断标准的多关节炎，与ra特异性预后生物标志物例如抗-ccp和共享表位的存在相关)ra。

可以监测以指示在用本发明的分离的多肽和物质组合物治疗期间有改善的ra临床参数症状的实例有：

•早晨僵硬至少一小时并存在至少6周；

•3个或更多个关节肿胀至少6周；

•腕、掌指关节，或近端指间关节肿胀至少6周；

•对称关节肿胀；

•手x-线改变，包括腐损或明确的骨质脱钙；

•类风湿性皮下结节；和

•类风湿性因子。

可用于在人中评价ra改善的另外的参数可根据美国风湿病学会(americancollegeofrheumatology)(acr)并包括例如acr改善标准-acr20、acr50和acr70，其代表通过减轻某些ra症状的疾病活动改善的百分比(20、50或70%)。因此，例如，acr20指实现在脆弱和肿胀的关节计数方面的20%改善和在5个保留的acr核心组测量的3个中的20%改善的患者。

由于本发明人发现分离的多肽的3个潜在靶蛋白并且也已显示加入这些蛋白之一(即saa)可阻止多肽的体外活性(见其后实施例部分中的实施例7和9和图15)，本发明构思了使用包含本发明的分离的多肽或物质组合物和血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和/或载脂蛋白b抑制剂的联合治疗。

因此，根据本发明的另一个方面，提供在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，该方法包括：

(a)给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方案的分离的多肽或物质组合物；和

(b)给予所述受试者治疗有效量的选自血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂，

从而治疗受试者的炎性疾病。

根据另一方面，提供本发明一些实施方案的分离的多肽或物质组合物和选自血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供经确定用于治疗炎性疾病的制品或药剂盒，其包含包装本发明的一些实施方案的分离的多肽或物质组合物和选自saa、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂的包装材料。

根据本发明的另一个方面，提供在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，该方法包括：

(a)给予受试者治疗有效量的包含选自seqidnos:1-3的氨基酸序列的分离的多肽，其中所述多肽具有抗炎活性；和

(b)给予所述受试者治疗有效量的选自血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂，

从而治疗受试者的炎性疾病。

根据另一方面，提供包含选自seqidnos:1-3的氨基酸序列的分离的多肽(其中所述多肽具有抗炎活性)；和选自血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供经确定用于治疗炎性疾病的制品或药剂盒，其包含包装包含选自seqidnos:1-3的氨基酸序列的分离的多肽(其中所述多肽具有抗炎活性)；和选自saa、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b的蛋白的抑制剂的包装材料。

如本文所用的，术语“抑制剂”指在基因组(如同源重组和位点特异性核酸内切酶)和/或转录水平(采用多种干扰转录和/或翻译的分子(如，rna沉默剂如sirna、shrna、微-rna))上，或在蛋白水平上(如，适体、小分子和抑制肽、拮抗剂、裂解多肽的酶、抗体等)，下调蛋白(如saa、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b)的表达和/或活性的试剂。

非-限制性实例包括抑制saa的抗体例如抗-血清白蛋白a，靶向saamrna的rna干扰(见例如国际公布申请号wo2006071691)，靶向载脂蛋白b的反义寡核苷酸，例如，但不限于米泊美生(mipomersen)(isis-301012,kynamro™)，作为载脂蛋白b合成抑制剂的三唑酮(见例如美国专利号us6197972)和载脂蛋白b分泌抑制剂(见例如欧洲专利公布号ep1099438)。

根据一个特定实施方案，步骤(a)在步骤(b)之前进行。

根据另一个特定实施方案，步骤(a)在步骤(b)之后进行。

根据又一个特定实施方案，步骤(a)与步骤(b)同时进行。

可给予根据本发明的方法的多轮给药和多个剂量的分离的多肽或物质组合物和抑制剂。根据特定的实施方案，步骤(a)进行多次。因此，根据特定的实施方案，给予抑制剂在至少一次给予分离的多肽或物质组合物之后进行。根据特定的实施方案，步骤(b)进行多次。因此，根据特定的实施方案，给予本发明的分离的多肽或物质组合物在至少一次给予抑制剂之后进行。根据特定的实施方案，给予本发明的分离的多肽或物质组合物与给予抑制剂按序贯顺序进行。

分离的多肽或物质组合物和抑制剂可被包装在相同的容器或在分开的容器中；每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据特定的实施方案，分离的多肽或物质组合物和抑制剂在分开的制剂中。

根据其它的特定实施方案，分离的多肽或物质组合物和抑制剂在共同的制剂中。

本发明的分离的多肽，物质组合物和抑制剂可以本身提供给受试者，或作为与药学上可接受的载体混合的药用组合物的一部分提供。

因此，根据本发明的一个方面，提供包含作为活性剂的分离的多肽或物质组合物；和药学上可接受的载体或稀释剂的药用组合物。

如本文所用的"药用组合物"指本文描述的一或多种活性成分与其它化学成分例如生理学上适合的载体和赋形剂的制剂。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给予。

本文术语"活性成分"指多肽或包含多肽的物质组合物，其是生物效应的原因。

下文中，可互换使用的短语"生理学上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"指对有机体不引起显著刺激作用且不消除所给予化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。辅助剂被包括在这些短语中。

本文术语"赋形剂"指加入到药用组合物以进一步促进活性成分的给予的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

用于配制和给予药物的技术可以在“remington’spharmaceuticalsciences”,mackpublishingco.,easton,pa,最新版中发现，其通过引用结合到本文中。

给药的合适途径可，例如，包括口服、局部、皮内、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠内或胃肠外传递，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、心内，例如，注射到右或左心室腔内，注射到总冠状动脉、静脉内、腹腔内、鼻内，或眼内注射。

根据特定的实施方案，给予途径是口服给予。

根据其它的特定实施方案，给予途径是进入皮肤。给予活性剂进入皮肤的方法是本领域已知的并包括，例如，皮内注射、包含活性剂并应用于皮肤外表面的凝胶剂、液体喷雾剂和贴剂。

根据本发明的一些实施方案，给予活性剂进入受试者的皮肤经局部(在皮肤上)进行。

根据本发明的一些实施方案，给予活性剂进入受试者的皮肤以无创方式进行，例如，使用包含活性成分的凝胶剂、液体喷雾剂或贴剂(如贮库型贴剂和基质型贴剂)，其应用于受试者的皮肤上。

应该注意，为增加活性剂传递到皮肤中，活性剂可用各种经设计增加传递至表皮或真皮层的媒介配制。这样的媒介包括，但不限于脂质体、树枝状聚合物、noisome、传递体、微乳液和固体脂质纳米颗粒。

根据本发明的一些实施方案，给予经皮内注射进行。

药物传递至中枢神经系统(cns)的常规的途径包括：神经外科策略(如，脑内注射或脑室内输注)；试图利用bbb的内源性运输途径之一的药物的分子操纵(如，嵌合融合蛋白的生产，其包含具有内皮细胞表面分子的亲和力的转运肽与本身无法穿越bbb的药物的组合)；经设计增加药物的脂溶性的药理策略(如，水溶性药物与脂质或胆固醇载体的缀合)；和通过高渗性破坏(其由输注甘露醇溶液进入颈动脉或使用生物活性剂如血管紧张素肽导致)短暂中断bbb的完整性。然而，这些策略的每一个都有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，由内源性运输系统固有的限制所施加的尺寸限制，与系统性给予由载体基序(其在cns外可能是有活性的)构成的嵌合分子相关的潜在不良生物学副作用，和其中bbb被中断的脑区域内脑损伤可能的风险，这使得它成为一种次优的传递方法。

或者，可以局部而不是系统性的方式给予药用组合物，例如，经由注射药用组合物直接进入患者的组织区域，例如局部注射进入关节。给予活性剂进入关节的方法是本领域已知的并包括关节内注射，其中皮下注射针插入关节内，从而传递活性剂至关节内关节的关节内空间。

如所描述的，本发明的多肽和物质组合物可被用来治疗如阿尔茨海默氏病。药物传递至中枢神经系统(cns)的常规途径包括：神经外科策略(如，海马内(ih)、颅内(ic)、脑内注射、脑室内注射(icv)或输注或鞘内给予)；试图利用bbb的内源性运输途径之一的药物的分子操纵(如，嵌合融合蛋白的生产，其包含具有内皮细胞表面分子的亲和力的转运肽与本身无法穿越bbb的药物的组合)；经设计增加药物的脂溶性的药理策略(如，水溶性药物与脂质或胆固醇载体的缀合)；和通过高渗性破坏(其由输注甘露醇溶液进入颈动脉或使用生物活性剂如血管紧张素肽引起)短暂中断bbb的完整性。然而，这些策略的每一个都有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险，由内源性运输系统固有的限制所施加的尺寸限制，与系统性给予由载体基序(其在cns外可能是有活性的)构成的嵌合分子相关的潜在不良生物学副作用，和其中bbb被中断的脑区域内脑损伤可能的风险，这使得它成为一种次优的传递方法。

本发明的一些实施方案的药用组合物可通过本领域熟知的方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、封装、包埋或冻干方法制备。

因此，根据本发明的一些实施方案使用的药用组合物可以常规的方式，使用一或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)配制，所述载体有利于将活性成分加工成可在药学上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射，药用组合物的活性成分可配制在水性溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液例如hank’s溶液、ringer’s溶液，或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给药，适宜于透过屏障的渗透剂被用于制剂中。这样的渗透剂一般是本领域已知的。

对于口服给药，药用组合物可通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合而容易地配制。这样的载体能够将药用组合物配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂、混悬剂等，用于由患者口服摄入。口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂，任选地研磨生成的混合物，在加入合适的辅助剂(如果需要)后加工颗粒混合物，以获得片剂或锭芯来制得。具体而言，合适的赋形剂是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇，或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或藻酸或其盐例如藻酸钠。

根据特定的实施方案，药用组合物被配制为用于口服给予。

给锭芯提供合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可被加入到片剂或锭包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同的组合。

可口服使用的药用组合物，包括由明胶制得的推入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制得的软的、密封胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉，润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶于或悬浮于合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡，或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。用于口服给予的所有制剂应为适合于所选择的给药途径的剂量。

对于含服给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或糖锭剂的形式。

对于经鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分以使用合适的抛射剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳)，从加压包或喷雾器以气溶胶喷雾剂的形式常规地传递。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供传递计量的量的阀确定。例如，用于分药器的明胶胶囊和药筒可被配制为含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

在此描述的药用组合物可被配制用于胃肠外给予，例如通过推注或连续的输注。用于注射的制剂可以单位剂型，例如以安瓿或以任选地加入防腐剂的多计量容器存在。组合物可以是在油性或水性媒介中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有配方剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于胃肠外给予的药用组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。另外地，活性成分的混悬剂可制备为适宜的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加悬浮液的粘性的物质，例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解性的试剂，以使得制剂为高度浓缩的溶液。

备选地，活性成分可呈现为在使用前用合适的媒介，如无菌、无热原的水基溶液构成的粉末形式。

本发明的一些实施方案的药用组合物也可使用例如常规的栓剂基质例如可可酯或其它甘油酯配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂。

本发明的一些实施方案的药用组合物也可配制为用于持续释放以提供升高的血清半衰期。这样的持续释放系统是本领域技术人员熟知的并包括例如微胶囊和纳米颗粒。根据特定的实施方案，用于蛋白和肽的prolease可生物降解的微球传递系统(tracy,1998,biotechnol.prog.14,108;johnson等,1996,naturemed.2,795;herbert等,1998,pharmaceut.res.15,357)，一种由含有在聚合物基质中的蛋白的可生物降解的聚合物微球组成的干燥粉末，其可混合为一种含或不含其它药物的干燥制剂。

适合用于本发明的一些实施方案的药用组合物包括活性成分以有效实现预定目的量包含于其中的组合物。更特别地，治疗有效量指活性成分有效预防、缓解或改善疾病(如，ra)的症状或延长受治疗的受试者的存活的量。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细的公开内容。

对于用于本发明的方法的任何制剂，治疗有效量或剂量可最初从体外和细胞培养测定来估算。例如，剂量可在动物模型中配制以获得所需浓度或滴定量。这样的信息可被用来更精确地确定在人中的有用的剂量。

本文描述的活性成分的毒性和治疗效果可由标准药物程序在体外、在细胞培养或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的一定范围的剂量。剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径而变化。精确的制剂、给药途径和剂量可由单个医生根据患者的病情选择(见例如，fingl,等,1975,"thepharmacologicalbasisoftherapeutics",ch.1p.1)。

给药的量和间隔可单独调整以提供活性成分的水平足以诱导或抑制生物学作用(最小有效浓度，mec)。对于每一制剂，mec将是变化的，但可从体外数据估算。获得mec所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测分析可被用来测定血浆浓度。

本文示出的关于小鼠动物模型的剂量可转换为治疗其它物种，例如经诊断患有炎性疾病的人和其它动物。由fda批准的转换表显示于reagan-shaws.,等,fasebj.22:659-661(2007)中。

人体等效剂量计算如下：hed(mg/kg)=动物剂量(mg/kg)乘以(动物km/人km)。

根据本发明的一些实施方案，分离的多肽或物质组合物以在小鼠中相当于从约2.5-40mg/kg/天范围的量提供，包括任何中间的子范围以及其中的值。

根据特定的实施方案，分离的多肽或物质组合物以在小鼠中相当于约3.5mg/kg/天的量提供。

取决于要治疗的病症的严重性和响应，剂量可以单次或多次给予，疗程持续从几天至几周或直到实现治愈，或实现疾病状态的减轻。

要给予的组合物的量当然将取决于受治疗的受试者，病痛的严重性，给药方式，开具处方的临床医师的判断等。

本发明的一些实施方案的组合物，如果需要，可存在于药物包装或分药器装置中，例如fda批准的药剂盒，其可含有含有活性成分的一个或多个单位剂型。药物包装可例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。药物包装或分药器装置可附有给药说明书。药物包装或分药器也可容纳与容器相关的、由管控药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的注意事项，该注意事项是由该机构批准组合物形式或人或兽医给药的反映。这样的注意事项，例如，可以是由美国食品和药品管理局对处方药批准的标签或批准的产品插页。也可制备在相容的药用载体中配制的包含本发明制剂的组合物，置于适宜的容器中，并标记为治疗指定的病症，如进一步在上文详述的。

应该意识到，本发明的治疗剂可与另外的活性剂一起向个体提供，以达到与用每种药物本身治疗比较的改进的治疗效果。在这样的疗法中，对可与组合疗法有关的副作用采取措施(如，补充剂的给予和选择)。

这样的组合疗法的给予可以是同步的，例如在具有固定比例的这些活性剂的单一胶囊中，或在对于每种药物的多个胶囊中。

因此，本发明的药物可单独或与治疗炎性疾病的其它确立的或实验治疗方案一起给予，例如非甾体抗炎药(nsaid)、疾病-改善抗风湿药物(dmards)、皮质激素、镇痛药、纤维肌痛药物、化学治疗剂和其它为本领域熟知的治疗方案。

如所提到的，本发明人已开发一种新的体外测定法，以测试本发明的肽和物质组合物的活性。所述测定法基于这样的认识，即ra肽可减少从ra患者的滑膜液分离的成纤维细胞的存活。因此，该测定法可被用来比较制造的肽和本发明的物质组合物的肽的批与批之间的变化，以定性测量抗炎活性以及测试例如本发明的肽和物质组合物在暴露于环境条件例如贮藏温度、对肽和制剂的修饰后的稳定性。

因此，根据本发明的一个方面，提供确定一批本发明的一些实施方案的分离的多肽、物质组合物或药用组合物的效力的方法，该方法包括：

(a)使一批分离的多肽、物质组合物或药用组合物与从类风湿性关节炎患者的发炎关节获得的成纤维细胞接触；和

(b)在预定的培养时间之后确定所述成纤维细胞的存活，以确定该批的效力。

根据特定的实施方案，该方法包括合成具有修饰的分离的多肽、物质组合物或药用组合物。这样的修饰可以是以上提出的任何修饰。

根据特定的实施方案，该方法在体外或离体进行。

如本文所用的，术语“效力”指基于与相关生物学性质(即；从ra患者获得的成纤维细胞的存活率降低)相关的产品属性，产物(即；分离的多肽或物质组合物)的生物学活性的量度。

如本文所用的，术语“批”指某一特定量的药物，其在规定的范围内意欲具有均一的特性和品质，且通常根据生产的同一周期期间的一个生产订单生产。因此，本发明的教导可用于生产程序的qa，以评价分离的多肽、物质组合物或药用组合物的生物学活性，作为批质量的一部分。

根据特定的实施方案，术语“批”也指药物暴露于稳定性特性和/或肽和制剂修饰时的数量。

如本文所用的，术语“成纤维细胞”指合成细胞外基质和胶原蛋白并从ra患者的滑膜液获得的结缔组织细胞。根据所述方法使用的成纤维细胞可以是直接从ra患者分离出来的原代培养物，或从成纤维细胞获得的细胞系(例如可从atcc获得的可市售获得的细胞系sw982、pcs-201-010和acs-1023)。

从受试者获得滑膜液的方法是本领域熟知的并包括，但不限于活组织检查例如关节活组织检查和关节抽吸。通常地，获得组织或体液活组织检查的程序被详细描述于hypertexttransferprotocol://worldwideweb(dot)healthatoz(dot)com/healthatoz/atoz/search.asp中。

特别地，关节抽吸，也被称为关节穿刺术，指用针头和注射器从关节周围的腔隙取出液体。这通常在局部麻醉下进行，以缓解肿胀或者获得用于分析的液体以诊断关节疾病和/或问题。关节抽吸通常膝关节上进行；然而，也可从其它关节，例如髋、踝、肩、肘或腕关节取出液体。

关节活组织检查指关节或滑膜液活组织检查。在该程序中，取出关节衬里或滑膜液膜或液体的样本。简言之，该程序由外科医生在临床设施中进行。可利用许多方法执行这种活组织检查：例如通过关节切口；将内窥镜插入关节；或更通常地，通过插入尖锐的器械穿过皮肤。样本可从任何关节取得，通常检查的关节是膝盖。将尖锐的器械(套管针)推入关节腔。将带有附接的注射器的针头插入关节以抽出液体供实验室分析。外科医生可以将镇痛化合物沿着针迹慢慢地灌输到关节内，然后抽出针头。先后插入套管针和活组织检查针并取出标本。取出标本后，抽出套管针和活组织检查针。

不管所用的程序，一旦获得生物学样本，可进一步分离成纤维细胞。成纤维细胞群的富集可通过本领域熟知的方法获得，并包括在例如bendersky等,jimmunol.;188:4349-59,2012中公开的那些方法，磁细胞分离和流式细胞术细胞分选。

因此，例如成纤维细胞可通过在补充有dmem的培养基的塑料孔中培养粘附性滑膜液细胞约48小时，接着除去所有未粘附的细胞来分离。包含成纤维细胞的粘附细胞通常显示成纤维细胞的形态学并表达cd90、低水平的cd49a整联蛋白、对巨噬细胞(cd14)、t细胞(cd3)和b细胞(cd20)表面标记物阴性(如通过流式细胞术测定的)并对通过天狼猩红染色(siriusredstaining)测定的胶原蛋白i型染色阳性。

根据特定的实施方案，成纤维细胞的原代培养包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多的成纤维细胞。

在成纤维细胞准备后，将预定量的细胞在含有适宜的生长培养基的组织培养板(如，12、24、96、384孔板)中培养并用预定量的试验分离的多肽、物质组合物或药用组合物刺激。培养基的选择完全在本领域技术人员的能力范围内。因此，例如，rpmi或dmem(可例如从sigma-aldrich或biologicalindustries,beithaemek,israel获得)可用作生长培养基。培养基可补充有l-谷氨酰胺、非-必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素/抗真菌溶液、2-巯基乙醇和血清。

对于将导致对细胞存活的可检测作用的体外测试，培养的细胞的预定量的选择完全在本领域技术人员的能力范围内。因此，例如细胞浓度可以是1x10⁴/ml-5x10⁶/ml；1x10⁴/ml-1x10⁶/ml；5x10⁴/ml-5x10⁶/ml；1x10⁵/ml-5x10⁶/ml；或1x10⁵/ml-1x10⁶/ml。

根据特定的实施方案，细胞浓度是2x10⁵/ml。

对于将导致对细胞存活的可检测作用的体外测试，使用的肽或物质组合物浓度的选择完全在本领域技术人员的能力范围内。优选地，所用的浓度应在选定的刺激参数的线性范围内。因此，例如，浓度可以是1μg/ml-30μg/ml；1μg/ml-20μg/ml；5μg/ml-30μg/ml；或5μg/ml-20μg/ml。

测试的浓度的数目可以是至少1、至少2、至少3、至少5、至少6、1-10、2-10、3-10、5-10、1-5、2-5和3-5种不同浓度。

对于各测试的浓度，样品重复数可以是2、3、4、5或6个重复。

在预定的培养时间后，测定成纤维细胞的存活。监测细胞存活的具体方法是本领域已知的并包括例如，mtt试验(其基于活细胞减少黄盐mtt(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)(可例如从sigma,aldrich获得)至紫蓝色的不溶性甲沉淀(formazan)的选择能力)；细胞凋亡分析(例如tunel分析(例如可从roche获得))；和annexinv分析[例如apoalert®annexinv细胞凋亡试剂盒(clontechlaboratories,inc.,ca,usa)]。

培养时间可以是变化的且将导致对细胞存活的可检测作用的培养时间的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。根据一个特定实施方案，培养时间在12小时-96小时之间。根据本发明的一些实施方案，培养时间在12-72小时；12-48小时；12-24小时；24-96小时，24-72小时或24-48小时之间。根据本发明的特定实施方案，培养时间在24-48小时之间。

根据特定的实施方案，成纤维细胞在所述接触后的存活减少是该批有效力的指示。

根据特定的实施方案，所述测定可进一步包括阳性和阴性对照样本。用于测定的阳性对照可包括诱导非特异性成纤维细胞细胞死亡的试剂，例如抗坏血酸盐(见例如schmidt等,jbiomedmaterres.1993apr;27(4):521-30)。

用于测定的阴性对照可包括阻止试验的多肽或物质组合物例如saa(可例如从peprotech获得)的生物学活性的试剂。

根据特定的实施方案，该方法包括比较细胞的存活与细胞在接触标准参照批的分离的多肽、物质组合物或药用组合物后的存活，以确定该批的相对效力。

如本文所用的，术语“相对效力”指相对于具有已知效力的标准参考(rs)的分离的多肽、物质组合物或药用组合物，一批分离的多肽、物质组合物或药用组合物的效力的定性量度。

根据特定的实施方案，确定一批分离的多肽、物质组合物或药用组合物相对于参考标准(rs)的已知效力的效力。

如本文所用的，短语“参考标准”或“rs”指一种标准化的分离的多肽、物质组合物或药用组合物，其被用作分离的多肽、物质组合物或药用组合物的测量基础。rs提供分离的多肽、物质组合物或药用组合物的新制剂可与之比较的校准水平的生物学作用。

根据特定实施方案，rs通过有效治疗疾病(如，ra)的活性成分的最佳效力和性质来表征。

计算效力和相对效力是本领域已知的。根据特定的实施方案，相对效力使用适合于生物学分析的软件，例如平行线分析软件如pla(stegmannsystemsgmbh)和gen5数据分析软件(biotek)计算。

本发明的实施方案的方法和/或系统的实施可包括手工、自动，或其组合来执行或完成选择的任务。此外，根据本发明的方法和/或系统的实施方案的实际仪器和设备，几种选择的任务可通过硬件、通过软件或通过固件或其组合，使用操作系统实施。

如本文所用的，术语“约”指±10%。

术语"包含"、"含有"、"包括"、"包纳"、“具有”和它们的变化意指"包括，但不限于"。

术语“由…组成”意指“包括且限于”。

术语"基本上由…组成"意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但只要另外的成分、步骤和/或部件不会实质性地改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖的特性。

如本文所用的，单数形式"一"、"一个"和"该"包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。例如，术语"一个化合物"或"至少一个化合物"可包括多个化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，本发明的各个实施方案可以范围格式提出。应该理解，在范围格式中的描述仅仅是为了方便和简明，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制，因此，范围的描述应被认为已具体公开所有的可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，范围例如从1至6的描述应被认为已具体公开例如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等的子范围，以及在该范围内的各个数值，例如，1、2、3、4、5和6。这适用于无论多宽的范围。

每当本文指明一个数值范围时，则意味着包括在该指明的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一次指明的数字和第二次指明的数字之间的范围”和“从第一次指明的数字至第二次指明的数字的范围”在此可互换使用并意欲包括第一次和第二次指明的数字以及在其之间的所有分数和整数数值。

如本文所用的，术语"方法"指为完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，为化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知，或从已知的方式、手段、技术和程序由化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。

当引用特定的序列表时，这样的引用应被理解为也涵盖基本上对应于其互补序列的序列，如包括由例如测序错误、克隆错误，或导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其它改变生成的较小序列变化，只要这样的变化的频率少于1/50的核苷酸，或者少于1/100的核苷酸，或者少于1/200的核苷酸，或者少于1/500的核苷酸，或者少于1/1000的核苷酸，或者少于1/5,000的核苷酸，或者少于1/10,000的核苷酸。

要意识到本发明的某些特征，为了清楚起见，其在独立的实施方案的背景中被描述，也可在单一实施方案中组合提供。反过来，本发明的各个特征，为了简要起见，其在单一实施方案的背景中被描述，也可分开地或以任何合适的亚组合或合适时在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。在各个实施方案的背景中描述的某些特征并不认为是那些实施方案的必要特征，除非没有那些要素时所述实施方案无法实施。

如上文描述的和如在下文权利要求书部分所要求的本发明的各个实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参照以下实施例，其与上文的描述一起，以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。

一般来说，本文所用的命名和本发明所用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组dna技术。这样的技术在文献中有充分的解释。见，例如，"分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)"sambrook等,(1989);"分子生物学现代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)"volumesi-iiiausubel,r.m.,ed.(1994);ausubel等,"分子生物学现代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)",johnwileyandsons,baltimore,maryland(1989);perbal,"分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)",johnwiley&sons,newyork(1988);watson等,"重组dna(recombinantdna)",scientificamericanbooks,newyork;birren等(编辑)"基因组分析：实验室手册丛书(genomeanalysis:alaboratorymanualseries)",vols.1-4,coldspringharborlaboratorypress,newyork(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；"细胞生物学：实验室手册(cellbiology:alaboratoryhandbook)",i-iii卷,cellis,j.e.编辑(1994)；"动物细胞的培养-基础技术手册(cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique)"byfreshney,wiley-liss,n.y.(1994)，第3版；"免疫学现代方法(currentprotocolsinimmunology)"i-iii卷,coliganj.e.编辑(1994);stites等(编辑),"基础和临床免疫学(basicandclinicalimmunology)"(第8版),appleton&lange,norwalk,ct(1994);mishellandshiigi(编辑),"细胞免疫学的选择方法(selectedmethodsincellularimmunology)",w.h.freemanandco.,newyork(1980)；可获得的免疫分析在专利和科学文献中有广泛的描述，见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)"gait,m.j.编辑(1984)；“核酸杂交(nucleicacidhybridization)"hames,b.d.,andhigginss.j.编辑(1985)；"转录和翻译(transcriptionandtranslation)"hames,b.d.,andhigginss.j.编辑(1984)；"动物细胞培养(animalcellculture)"freshney,r.i.编辑(1986)；"固定化细胞和酶(immobilizedcellsandenzymes)"irlpress,(1986)；"分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)"perbal,b.,(1984)和"酶学方法(methodsinenzymology)"vol.1-317,academicpress；"pcr方案：方法和应用指导(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)",academicpress,sandiego,ca(1990)；marshak等,"蛋白纯化和鉴定的策略-实验室课程手册(strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual)"cshlpress(1996)；所有文献通过引用结合到本文中，如同在本文中全面阐明一样。本文通篇提供其它一般的参考。其中的程序相信是本领域熟知的并为读者提供方便。其中含有的所有信息通过引用结合到本文中。

实施例1

肽合成和表征

材料和方法

5、7和9mer肽的合成–5-、7-和9-mer肽[mtadv(seqidno:1)、mtadvdr(seqidno:2)和trmtadvdr(seqidno:3)],-3，酰基化-n和酰胺化-c末端5-、7-和9-mer肽[ac-mtadv-nh2(seqidno:4)、ac-mtadvdr-nh2(seqidno:5)和ac-trmtadvdr-nh2(seqidno:6)]和混杂的7-mer肽[ac-tmdvadr-nh2(seqidno:7)]通过sigmaisrael，使用固相合成fmoc化学合成。达到95-97%的纯度。

液相色谱-质谱(lcms)–肽的稳定性、药代动力学(pk)和靶蛋白通过lcms评估。

用于质谱的样本准备：蛋白-结合的珠用2.8mmdtt(60℃，30min)还原并用8.8mm碘乙酰胺(于室温、黑暗条件下30min)在8m脲和400mm碳酸氢铵中修饰。于37℃，将蛋白在2m脲、含修饰的胰蛋白酶(promega)(以1:50酶与底物比)的25mm碳酸氢铵中消化过夜。胰蛋白酶的肽使用c18tips(harvard)脱盐，干燥并再次悬浮于0.1%甲酸中(质谱测量)。生成的胰蛋白酶的肽经lc-ms/ms，使用装有毛细管hplc(eksigent)的orbitrapxl质谱仪(thermo-fisher)分析。特别地，所述肽被加载到一个在线连接于自制毛细管柱(75微米id)的c18捕集柱(0.35mm,lc-packings)上，所述柱用reprosilc18-aqua(drmaischgmbh,germany)装填，并在0.1%甲酸/水的存在下以流速0.25μl/min，使用线性94分钟5-40%乙腈梯度，接着12分钟95%乙腈解析。质谱以正模式，反复使用全ms扫描(分辨率60000)进行，接着碰撞诱导解离(collisioninducesdissociation)(cid)。从每个全质谱选择前7个(>1电荷的肽，350–2000m/z)区段。

数据分析：使用sequest和mascot搜索引擎，使用discoverer软件版本1.4针对人uniprot数据库和针对诱饵数据库(decoydatabases)(以确定错误发现率(fdr)，分析质谱。高置信度指0.01fdr。

半定量通过计算每个肽的峰面积进行。蛋白的面积是来自每个蛋白的三个最强烈的肽的平均值。

结果

导致代替原始mtdv序列的mtadv序列存在的cd44vra变体的变体外显子4和变体外显子5之间的剪接结合处中包含丙氨酸显示出赋予cd44vra的病理学活性(nedvetzki等,jclininvest111:1211-1220,2003)。

本发明人已经合成包含mtadv序列的5-、7-和9-mer肽(本文称为ra肽)。5-merra肽包含低分子量(少于700道尔顿)的相对疏水性的氨基酸序列。因此，它可容易地渗透进入组织，因此可用于局部应用和口服传递。

ra肽的蛋白水解分析证实没有蛋白水解位点(数据未示出)，表明该肽是至少相对稳定的。质谱定量分析表明，5-mer肽(seqidno:1)于4℃、室温下或于-20℃在盐水中贮藏22周后(图1)的稳定性几乎相同。假定于-20℃贮藏显示100%的稳定性，这些结果证实5-mer肽于室温下和4℃至少22周是稳定的。

实施例2

5-和9-merra肽可减轻胶原诱导的关节炎(cia)小鼠模型的关节炎症

材料和方法

小鼠-胶原诱导的关节炎(cia)在dba/1或c57bl小鼠中，经注射ii型胶原生成，如在nedvetzki等,pnas101,18081-18086,2004中所述。

治疗方案–在6天内，将pbs，或9-merra肽(seqidno:3)经i.p给予cia小鼠4次，每次注射25µg、100µg或150µg的剂量(见下表3)。将pbs(n=7)，或5-merra肽(seqidno:1，n=7)经i.p给予c57bl/6背景的cia小鼠，每次注射70µg的剂量，连续10天。在所有组中，在疾病发生时(如通过爪肿胀测定的)给予第一次注射。

关节炎症的评价–炎症通过爪肿胀应答评价。爪肿胀用微型测径仪(microcaliber)测量。2.1-2.3mm范围内的爪肿胀被认为“疾病发生”并用于肽注射的起始点。表现出2.3mm以上的爪肿胀的小鼠从实验中排除。所有测量均采用盲法进行(对于另外的细节见nedvetzki,等,(2004)pnas101,18081-18086)。

组织学–在第11天处死小鼠(停止治疗后1天)，分离后肢并于室温下，用4%多聚甲醛固定过夜(对于另外的细节参见nedvetzki等(2004)pnas101,18081-18086)。固定后，制备动关节的关节切片，用苏木精和曙红(h&e)染色并由病理学家采用盲法评估。关节浸润评分：0=无浸润；4=大量浸润。

统计学分析–对每个测量点的统计学分析通过未配对值的student’st-检验进行。

表3：实验设计-剂量反应(图2a-c)

结果

胶原诱导的关节炎(cia)小鼠模型是人类风湿性关节炎(ra)的小鼠类似情况。为评估生成的ra肽对cia小鼠模型的关节炎症的效果，从疾病发生开始，将不同剂量的9-merra肽(seqidno:3)给予dba/1背景的cia小鼠；和关节炎症通过确定爪肿胀评估。如在图2a-b中所示，接受25和100µg的9-merra肽(seqidno:3)的小鼠的爪肿胀应答，与用pbs给予的小鼠比较，未显示显著的差异，暗示缺乏显著的治疗效果。相反，接受150µg的9-merra肽(seqidno:3)的小鼠已证实显著减少爪肿胀(图2c)。

在用pbs对照品治疗后，从c57bl/6背景的cia小鼠取出的后肢切片的组织学评价，显示单核炎性细胞大量浸润进入关节囊内，广泛性滑膜肥大和关节间隙严重狭窄，其中充满了反应性细胞。此外，关节软骨和软骨下骨的严重侵蚀，伴有软骨基质的破坏被注意到。其余的软骨基质也被严重浸润。合并在一起，pbs处理的小鼠的平均关节浸润评分=约4(图3a和3c)。

相反，在用5-merra肽(seqidno:1)处理后，从cia小鼠取出的后肢切片的组织学评价揭示，炎性单核细胞无-至-轻度浸润进入关节囊，无或者轻度滑膜肥大。少数样本中注意到有炎性浸润。关节腔保持，很少的反应性细胞(如果有的话)。此外，未发现有关节软骨和软骨下骨的侵蚀并且软骨基质一般被保存。此外，很少有样品是与未受影响的小鼠不能区别的(数据未示出)。合并在一起，5-merra肽治疗的小鼠的平均关节浸润评分=约1(图3b和3c)。

总之，对照pbs处理组的关节炎症评分比5-merra肽(seqidno:1)治疗组的关节炎症评分显著更高(p<0.0001)，表明用所述肽治疗可显著地恢复发炎关节的正常组织学。

合并在一起，用5-和9-merra肽(seqidnos:1和3)治疗抑制cia小鼠模型的关节炎症。

不受理论的束缚，已提出未知的cd44vra配体和cd44vra之间的相互作用创建cd44vra糖蛋白的一个构象变化。这种新的表位允许fgf-2结合于相同分子的v3外显子产物残基的硫酸肝素。结合的fgf-2趋向于与内皮细胞或表达fgf受体1的成纤维细胞相互作用，导致它们的增殖和炎性活性扩大(nedvetzki等,jclininvest111:1211-1220,2003)。ra肽可与细胞表面cd44竞争与未知配体的相互作用，导致阻断由nedvetzki等(jclininvest111:1211-1220,2003)描述的fgf-2-诱导的炎性级联。

实施例3

5-、7-和9-mer保护的ra肽可减少cia小鼠模型的关节炎症

材料和方法

小鼠–如在上面的实施例2中所述。

治疗方案–pbs，或测试的肽[ac-trmtadvdr-nh2(seqidno:6)、ac-mtadvdr-nh2(seqidno:5)、ac-mtadv-nh2(seqidno:4)和混杂的ac-tmdvadr-nh2(seqidno:7)]以每次注射70或200µg的剂量，经i.p.给予dba背景的cia/1小鼠，连续9-10天(见下表4-7)。作为非特异性对照，按照相同的方案，经i.p.给予几只小鼠50μg剂量的地塞米松(dex)。在所有的组中，在疾病发生时(如通过爪肿胀测定的)给予第一次注射。

关节炎症的评价–如在以上实施例2中所述。爪肿胀少于2mm被认为是健康的。

统计学分析–如在以上实施例2中所述.

表4：实验设计(图4)

*当小鼠的两只后爪发炎时，分析两只后爪的肿胀

表5a：实验设计(图5a)

表5b：实验设计(图5b)

*当小鼠的两只后爪发炎时，分析两只后爪的肿胀

表6：实验设计(图6)

表7：实验设计(图7a-c)

*当小鼠的两只后爪发炎时，分析两只后爪的肿胀

结果

在下一个步骤中，9-、7-和5-merra肽用保护残基，即在肽的氨基和羧基的末端的乙酰基和酰胺残基合成[ac-trmtadvdr-nh2(seqidno:6)、ac-mtadvdr-nh2(seqidno:5)和ac-mtadv-nh2(seqidno:4)，在此分别称为9-、7-和5-merra保护的肽]。这些保护残基在实验小鼠中保留肽的天然阶段，并稳定该肽。评估保护的肽在它们在cia发病时注射后减少dba/1小鼠的关节炎症的能力。所有的测量以盲法进行。

如可在图4和5a-b所见到的，与用pbs处理的小鼠比较，注射所有保护的ra肽(每次注射剂量200µg)显著地抑制dba背景的cia小鼠的关节炎症。如也在图5a中明显见到的，给予地塞米松也降低足垫肿胀，可能是由于这种甾族化合物产生了非特异性的抗-炎作用。5-mer保护的肽(seqidno:4)当每次注射给予70µg的剂量时，也能够显著地抑制c57bl/6背景的cia小鼠的关节炎症(图6)。所有的测量以盲法进行。

在下一个步骤中，评估混杂的ra肽对关节炎症的效果。为此，比较7-mer保护的ra肽(ac-mtadvdr-nh2,seqidno:5)的效果与7-mer混杂的保护的肽(ac-tmdvadr-nh2,seqidno:7)的效果。如在图7a-c中所示，混杂的非特异性7-mer保护的肽对足垫肿胀没有效果。所有的测量以盲法进行。

图7a-c所示的结果也通过确定每组中健康爪的百分比来评估。因此，ciadba/1小鼠后爪的评价(图8)，反映疾病的严重性，显示出在用7-mer保护的ra肽治疗的cia小鼠中，超过60%的后爪保持健康。比较而言，在其它试验组中保持健康的后爪的百分比在pbs处理组中是15%，而在7-mer肽混杂的组中是33%。

合并在一起，5-、7-和9-merra保护的肽(seqidnos:4-6)在给dba和c57bl/6背景的两种cia小鼠注射后抑制关节炎症，而非特异性的混杂的7-mer保护的肽(seqidno:7)对关节炎症没有效果。乙酰化和酰胺化不影响ra肽的活性(数据未示出)；然而，预期它们改进ra肽的稳定性和药代动力学。

实施例4

每次注射70µg是5-mer保护的ra肽减轻cia小鼠模型的关节炎症的最适剂量

材料和方法

小鼠–如以上实施例2中所述。

治疗方案–pbs，或测试的肽[ac-mtadv-nh2(seqidno:4)]以每次注射10、25、70、200或600µg的剂量经i.p.给予cia小鼠连续10天(见下表8-9)。在所有组中，在疾病发生时(如通过爪肿胀测定的)给予第一次注射。

关节炎症的评价–如以上实施例2中所述。所有的测量以盲法进行。

统计学分析–如以上实施例2中所述。

表8：实验设计(图9a)

表9：实验设计(图9b)

结果

为评估5-merra肽的最佳抗-炎治疗剂量，将几个不同的剂量的保护的肽(seqidno:4)给予c57bl/6背景的cia小鼠，关节炎症通过足垫肿胀测量测定(足垫体积的电子自动测量，基于archimedes观察)。如可在图9a中见到的，当与pbs对照组比较时，注射70、200或600µg/每次注射的5-mer保护的ra肽(seqidno:4)减轻关节炎症；然而，剂量70µg的肽产生统计学上最显著的抗炎作用。此外，如在图9b中所示，注射10和25µg/每次注射的5-mer保护的ra肽(seqidno:4)未引起显著的抗-炎作用。

合并在一起，数据表示，每次注射70µg的剂量是5-mer保护的ra肽(seqidno:4)的cia抑制的最适的和最低剂量。

实施例5

5-merra肽不抑制cia小鼠模型的dth

材料和方法

dth模型–用噁唑酮溶液(致敏)在c57bl/6小鼠的腹部涂布。在第6天，每只小鼠的右耳用相同的半抗原，噁唑酮(诱导)涂布，以产生迟发型超敏反应(dth)响应。右和左耳之间厚度的差别，其表明dth发展，在24小时后用微测径器测量。dth诱导表示正常免疫反应。对于另外的细节，见weiss等,(2000)proc.natl.acad.sci.usa.97,285-290。

治疗方案–pbs和5-mer肽(seqidno:1)以200μg的剂量在致敏的前一天给予，然后在致敏期间(7天)每天给予。使用抗-tnf抗体(herrring等,(2002)infectimmun70,2959-64)进行比较，以证实非特异性作用。

统计学分析–如以上实施例2中所述。

结果

一般来说，为评估ra肽对免疫反应的影响，5-merra肽(seqidno:1)对迟发型超敏反应(dth)响应的作用在c57bl/6小鼠生成的dth模型中评估。dth反映急性炎症，表征对抗微生物的免疫应答。结果表明注射5-merra肽不影响dth响应，而在整个7天分析期间，用所述肽治疗的小鼠显示与用pbs处理的对照小鼠相同的dth响应(图10)。比较之下，用抗-tnfα抗体治疗的小鼠显示抑制的dth响应，其与对照小鼠比较是显著的。

实施例6

5-mer肽不在cia小鼠模型中产生中和抗体

材料和方法

小鼠–如以上实施例2中所述。

治疗方案–pbs，或5-merra肽(seqidno:1)以70µg/每次注射的剂量经i.p.给予c57bl/6背景的cia小鼠连续10天。在所有的组中，在疾病发生时(如通过爪肿胀测定的)给予第一次注射。

elisa–96孔elisa板用5-merra肽(seqidno:1)、胶原蛋白或免疫球蛋白(阳性对照)包被。将来自用pbs或5-merra肽处理的cia小鼠的血清加入到经包被的板中，针对胶原蛋白或ra肽的中和抗体的存在用抗-免疫球蛋白+检测系统检测。用1mg/ml肽或蛋白包被板孔。在冷的温度下，将小鼠血清加入到板孔中15小时。检测系统包括hrp-抗-小鼠igg和tmb(bako)底物。使用elisa读出仪，在450nm的波长处分析板

统计学分析–如以上实施例2中所述。

结果

为确定用ra肽治疗是否诱导可减少或甚至阻断肽抗-炎作用的特异性中和抗体的产生，使用elisa分析测定抗-5-mer肽抗体在血清中的丰度。如在图11中所示，在用所述肽治疗后，在cia小鼠的血清中未检测到对5-merra肽(seqidno:1)的中和抗体。相反，由于cia小鼠模型由胶原蛋白注射产生，抗-胶原蛋白特异性抗体在cia小鼠的血清中无疑是明显的。

实施例7

血清淀粉样蛋白a、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b是5-mer肽的潜在的靶蛋白

材料和方法

肽靶蛋白的分离-从类风湿性关节炎(ra)患者的关节取出滑膜液。滑膜液用pbs稀释至1:1并以1,200rpm离心。细胞沉淀经受含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。于4℃，震摇下，使细胞溶胞产物与生物素化的5-mer肽(sigma)或与pbs温育12小时。于4℃，震摇下，将链霉抗生物素琼脂糖珠(sephdex)加入到生物素化的5-mer肽-处理的细胞提取物或pbs-处理的细胞提取物中另外1小时。肽-结合的珠和对照珠通过离心分离，充分洗涤并送往质谱分析，见图12。质谱(ms)测量和分析在位于haifa的technion的吸烟者蛋白质组学研究中心进行。

结果

从ra患者的结合5-mer肽(seqidno:1)的滑膜液细胞提取的细胞溶胞产物的蛋白的质谱分析鉴定血清淀粉样蛋白a(saa)、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白b作为5-merra肽(seqidno:1)的潜在靶蛋白。指明的蛋白质已知参与ra的病理学，但也参与阿尔茨海默氏病、癌症疾病和心血管疾病的病理学。

实施例8

5-merra肽的药代动力学

材料和方法

治疗方案–c57bl/6小鼠经受单次i.p.注射200μg5-mer肽(seqidno:1)。在注射后15、35和60分钟，经末端抽血取得血样(500-1000μl)并将血清送往质谱评价。

质谱分析–5-merra肽在血液中的浓度通过如上所述的质谱分析测定。

结果

在单次i.p.注射后，小鼠血中5-merra肽消除的药代动力学(pk)示于图13中。

实施例9

评价ra肽的作用的体外模型

材料和方法

细胞–培养得自ra患者的发炎关节的成纤维细胞并如在bendersky等,jimmunol.;188:4349-59,2012中所示维持。将20,000个数量的细胞与指定浓度的肽、血清淀粉样蛋白a或α-乳白蛋白一起加入到96孔板的每一个中。

mtt分析–mtt分析如在madhyastha等(2015)jclindiagnres.;9:zc05-8中所示进行。

统计学分析–如以上实施例2中所述。

结果

开发作为评估生成的ra肽的生物学活性的工具的体外模型。为此，将得自ra患者的发炎关节的成纤维细胞体外培养，所述肽对细胞存活的影响通过mtt分析评估。

如在图14中所示，增加5-merra肽(seqidno:1)的剂量逐渐抑制细胞的存活。将50μg/ml血清淀粉样蛋白a(saa)与5-mer肽组合加入到成纤维细胞培养物中会阻止这种抑制作用。结果也表明低剂量2.5μg/ml(~5nm)的肽能够显著地抑制这个体外模型中的细胞存活，并且体外最大的抑制作用为60%。

为证实所述肽对细胞存活作用的特异性，将肽以恒定浓度(25μg/ml)加入到细胞培养物中，并将saa或乳白蛋白(la，一种具有类似的分子量的对照蛋白)以递增的浓度加入。如在图15中所示，5-mer肽减少成纤维细胞的存活，而加入saa以剂量反应方式逐渐阻止这种减少。相反，加入la对所述肽的抑制活性没有作用；表明saa以特异性方式阻止5-mer肽的抑制作用。

在下一个步骤中，将5-mer保护的ra肽(seqidno:4)的抑制作用与5-merra肽(seqidno:1)进行比较。如在图16中所示，肽修饰改进所述肽的抑制作用。

虽然本发明已结合其特定实施方案进行了描述，显然许多选择、修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，打算涵盖所有这样的落入所附权利要求书的精神和宽泛范围内的选择、修饰和变化。

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