T细胞单型的分析的制作方法

本发明涉及用于研究T细胞单型的方法，并且特别涉及能够将炎性(也被称为反应性或良性)T细胞浸润与肿瘤(也称为恶性或淋巴瘤)T细胞浸润区分的引物、探针和其他包含寡核苷酸和抗体的特异性检测试剂。本发明还涉及区分炎性T细胞浸润与肿瘤T细胞浸润的方法。

背景技术：

组织浸润淋巴细胞的单型的分析是重要的和常见的临床病理学问题，以便将炎性浸润与肿瘤浸润(例如，淋巴瘤或白血病)区分。在B细胞淋巴瘤的环境下，这通常通过使用对κ和λ轻链特异的检测试剂在研究的早期阶段进行。偏离的κ:λ比率提高了组织B细胞浸润是肿瘤性而不是反应性/炎性的可能性。当B细胞种群中的所有B细胞仅表达一条轻链(仅κ或仅λ)时，其被称为单型种群。单型种群的存在支持存在克隆或肿瘤性B细胞种群的可能性，并且因此是临床实践中常用的诊断研究。B细胞的单克隆种群将具有相同的V区；这只能通过确定V区的确切序列或序列的一些替代物，例如使用特异性引物的PCR片段大小来确定。

然而，在T细胞浸润的环境中，单型的指定是不可能的，因为κ和λ链不由T细胞表达。代替地，通过进行T细胞受体基因重排研究支持T细胞赘生物(neoplasm)的诊断，其中通过PCR扩增重排的T细胞受体基因，然后通过凝胶或基因扫描仪分析来表征，以检验显性克隆扩增的T细胞受体可变区(α、β、γ或δ)的存在。与κ/λ染色相比，这是昂贵且耗时的途径，并且仅在专业中心进行。此外，由于反应性浸润也经常与寡克隆抗原特异性T细胞扩增相关，并且肿瘤种群可以具有相关的抗肿瘤或其它炎性T细胞应答，所以使用T细胞受体基因重排研究仍然常常难以将反应性浸润与肿瘤浸润区分。因此，对数据的解释是高度专业化的，并且是有争议的。实际上，在临床背景和相关的组织学特征的环境下解释T细胞受体基因重排研究，但是与其中可以使用κ和λ的B细胞不同，解释收到不能在组织学上可视化促进单/寡或多克隆性的T细胞的阻碍。因此，将炎性T细胞种群与肿瘤性T-细胞种群区分的简单测试在临床病理学实践中，以及作为人类和非人类系统中的研究工具以检验T细胞种群的单型程度(作为T细胞克隆性的替代)将是有价值的。这种系统的应用的实例是在淋巴结、皮肤、肠、骨髓、肺、肾、血液和实际上任何其它组织的组织中的T细胞单型的分析。此外，作为克隆性的替代，T-细胞种群是否为单型的确定在预测T细胞淋巴瘤之外的一系列病症中的预后中可能是重要的，其中T细胞种群的作用是重要的，例如(但不限于)，T细胞种群浸润其他肿瘤，或T细胞种群在各种器官中引起病症，如在自身免疫疾病中或在骨髓或实体器官移植后。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供使得能够分析T细胞单型和提供克隆性的支持证据的方法和试剂。然后该信息可以用于将炎性细胞与肿瘤性细胞区分和/或评估种群在其他情况下(其可以是结果预测、药物反应等)是克隆性的可能性。

所有的T细胞，包括自然杀伤T细胞(NKT细胞)，在其表面上表达多个T细胞受体(TCR)的拷贝。TCR由两条链(α链和β链或γ链和δ链)组成，每条链具有恒定区和可变区。由于在T细胞发育期间的体细胞(遗传)重组，可变区可以以数百万个不同序列存在。作为单克隆，T细胞种群必须具有其中所有V区都相同的T细胞。每条链也具有恒定区。所有α恒定区是相同的，然而β恒定区可以以两种形式，作为TRBC1(也称为TCRBC1)和TRBC2(也称为TCRBC2)存在。Droese et al.Leukemia(2004)18,1531-1538中讨论了TRBC1和TRBC2。类似地，γ链包含称为TRGC1(也称为TCRG1)和TRGC2(也称为TCRG2)的两个非常相似的恒定区中的一种。T细胞受体的总体结构决定了其与由MHC或MHC样分子代表的抗原结合的特异性。在单型种群中，种群中的所有(或基本上所有)的T细胞将具有相同的恒定区，例如，均为TCRBC1或TCRBC2。在T细胞的多型种群中，一些T细胞具有带有这些恒定区中的每种中的一种形式的受体，并且一些T细胞具有这些恒定区中的每种中的其他形式的受体，但每个单独的T细胞将仅具有一种类型的恒定区。

在第一方面，本发明提供了研究T-细胞(包括NKT细胞)种群的单型的方法，包括检测T细胞受体β和/或γ链恒定区的至少一种变体的表达。

可以将T细胞定义为在RNA和/或蛋白质水平表达T细胞受体的细胞。T细胞的种群可以包括试样中的所有T细胞或者具有特定形态的所有T细胞，或者由在蛋白质/RNA/DNA/碳水化合物水平的特定的生物标志物表达来定义的所有T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞或自然杀伤T细胞。可以将其中所有的细胞表达一种β恒定区或一种γ恒定区的T细胞种群定义为单型。T细胞的单克隆种群来自于单一细胞的扩增，并且因此在种群中的T细胞具有带有相同的恒定区和相同的可变区的T细胞受体。单型的T细胞种群是全部表达相同的恒定区变体(TRBC1或TRBC2之一以及TRGC1或TRGC2之一)的T细胞的种群。完全单型的T细胞种群还可能是单克隆种群，但是对于一种或甚至两种T细胞受体恒定区的单型的检测不明确地证明单克隆性，尽管它是单克隆性的优异替代。对单型的筛选比对单克隆性的筛选更便宜且更容易，但条件是相同或增强的诊断性、治疗性和预言性的选择。将单型种群定义为其中种群中的大部分T-细胞具有相同的TRBC类型(即，均为TRBC1或TRBC2，取决于使用的TRBC基因片段；相同的恒定区)的种群，而将单克隆性定义为种群中的所有T-细胞具有相同的可变区序列。存在几百万种可变区序列，但是仅存在两种可能的TRBC类型。筛选两种TRBC类型比筛选数百万的可变区更容易且更便宜得多。

特异性检测的变体T细胞受体β或γ链恒定区可以是选自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的至少一种β和/或γ链恒定区。该方法可以包括检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种。该方法可以包括检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的两种。该方法可以包括检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的三种。该方法可包括检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的全部。

特异性检测的T细胞受体β恒定区的变体可以是TRBC1或TRBC2中的至少一种或两者。如上所述，TRBC1和TRBC2是一对可替换的β链恒定区，并且T细胞将表达任一TRBC1或TRBC2，但不表达两者。因此，在T细胞的种群中，可以通过检测这些变体中的一种或两种来确定表达TRBC1或TRBC2的细胞的百分比。

特异性检测的T细胞受体γ恒定区的变体可以是TRGC1或TRGC2中的至少一种或两者。如上所述，TRGC1和TRGC2是一对可替换的γ链恒定区，并且T细胞将表达任一TRGC1或TRGC2，但不表达两者。因此，在T细胞的种群中，可以通过检测这些变体中的一种或两种来确定表达TRGC1或TRGC2的细胞的百分比。

该方法可以包括检测一种或两种β恒定链变体和/或一种或两种γ恒定链变体。

优选地，本发明的方法包括检测TRBC1和TRBC2，和/或TRGC1和TRGC2。优选地，在本发明的方法中测定细胞种群中的TRBC1与TRBC2和/或TRGC1与TRGC2的相对量。优选地，本发明的方法允许测定在特定的T细胞种群中表达特定的TCR恒定区的的细胞数目或相对细胞数目。

可以使用任何合适的方法检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2中的一种或多种。可以在DNA、RNA或蛋白质水平中的一种或多种下检测这些受体的恒定区的差异。本领域技术人员将理解，存在许多可以检测T细胞受体恒定区的差异的方式，并且本文呈现的实例不旨在是详尽的。

然后，可以使用PCR来检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种或多种的相对量。可以对提取的DNA或RNA、或对整个T细胞或组织样品进行PCR。该方法可以包括使用适用于PCR反应的一对寡核苷酸以特异性检测TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2。该方法可以包括同时地使用多于一对的适用于PCR反应的寡核苷酸以特异性检测TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的多于一种。使用PCR检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA的优点是仅需要较小的细胞样品，并且不存在提供合适的组织切片的需要。使用PCR检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA的进一步的优点是，且可以在非固体组织，如血液和骨髓抽吸物的样品上进行，以及在提取自固体或非固体组织样品中的DNA或RNA上进行。

可以在组织样品、切片或细胞培养中的T细胞中原位检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA、RNA或蛋白质。

可以通过原位杂交和免疫组织化学原位检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白质，例如在组织切片中。这样的方法可以使用能够区分不同的β和γ链恒定区的抗体。可替换地，可以使用可以区分不同的β和γ链恒定区的标记的DNA或RNA探针。可以直接地或间接地标记抗体或DNA或RNA探针。用于促进分子(如寡核苷酸或抗体)的检测的标记可以包括任何已知的标记，包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶以及荧光和显色部分，以及放射性核苷酸、底物、辅因子、抑制物、磁性颗粒等。如果标记是酶，其可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各种蛋白酶和磷脂酶。其它标记包括荧光团或半抗原(hapten)，如地高辛(digoxygenin)或二硝基苯/二硝基苯酚。这种标记的探针通常用于原位杂交方法。可以“通过肉眼”或使用数字病理学分析技术来探测抗体或标记的DNA或RNA探针的结合。数字病理分析技术可用于评估用一种或多种特异性检测试剂标记的组织样品或切片，每种特异性检测试剂特异性识别恒定区中的一种。例如，数字病理学分析技术可以计数用特异性检测试剂标记的细胞的数量，并且可以计算表达特定的恒定区的T细胞的百分比。数字病理分析技术还可以处理图像，例如染色的组织切片的图像，以评估用特异性识别T细胞受体恒定区中的一种的特异性检测试剂标记的T细胞的分布。数字病理分析还可以，例如通过计数与细胞相关联的点的数量(其中点表示阳性染色)或通过分析染色强度，来确定单个细胞是否应当被认为对特定恒定区的检测为阳性。技术人员将理解，取决于用于检测T细胞恒定区的方法，不同的数字病理分析方法将是合适的，并且上述实例不是详尽的。

可以使用流式细胞术在细胞中检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白质。这样的方法可以使用能够区分不同的β和γ链恒定区的抗体，或者它们可以使用可以区分不同的β和γ链恒定区的标记的DNA或RNA探针。

短语“特异性检测试剂”在本文中用于指能够在DNA、RNA或蛋白质水平上区分TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的试剂，并且包括，例如PCR引物、寡核苷酸探针和抗体。

T细胞的种群的蛋白质组分析也可用于检测T细胞种群中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2蛋白质。

可以使用DNA或RNA测序技术，例如全转录组鸟枪法测序(RNAseq)，检测T细胞受体β或γ链恒定区(TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的一种)。

除了TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2之外，还可以特别通过免疫组织化学、原位杂交和流式细胞术检测其它标记物的表达，例如但不限于CD2、CD3、CD5、CD4、CD7、CD8或CD30、CD56、颗粒酶、穿孔素、Mib-1、Ki-67、PD1、CD10、CXCL13和bcl6。这种其它的标记物的检测可以与TRBC1、TRBC2-]、TRGC1和/或TRGC2的检测同时进行。

通过原位杂交，免疫组织化学或流式细胞术检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白质的优势是可以同时检测其他因素，如细胞形态学和免疫表型，以及在原位杂交和免疫组织化学的情况下，表达特定恒定区的T细胞的结构分布模式。

在一个实施方式中，在本发明的方法中为了原位杂交的目的，使用多于一至，优选2种、3种、4种或更多个对每种恒定区唯一的不同的寡核苷酸。这具有两个优势：首先其增加该方法的灵敏度，并且其次其增加信号的强度。

可以使用抗体、双特异性抗体、拟抗体或它们的片段或变体来检测变体T细胞受体β或γ链恒定区。确定T细胞种群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率的方法可以使用抗体、拟抗体或它们的片段。TRBC1/TRBC2和TRGC1/TRGC2在蛋白质水平非常相似，但抗体可以区分它们的蛋白质序列。除了或代替免疫组织化学技术中的寡核苷酸特异性检测试剂，可以将抗体用作特异性检测试剂或检测试剂。

该方法可以包括测定在表达特异性T细胞受体β或γ链恒定区的特定种群中的T细胞的百分比。可以在T细胞的种群中检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种或更多种的表达。可以测定表达所检测的T细胞受体恒定区(TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2)的种群中的T细胞的百分比。可以检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的两种或更多种的表达。可以检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的三种或更多种的表达。可以检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的全部四种的表达。优选测定至少TRBC1和TRBC2、和/或TRGC1和TRGC2的表达。

该方法可以包括测定在T细胞种群中表达TRBC1的细胞与表达TRBC2的细胞的比率或者测定T细胞种群中表达TRGC1的细胞与表达TRGC2的细胞的比率或两者。

TRBC1与TRBC2的比率或TRGC1与TRGC2的比率可以通过特异性检测来自一对的恒定区中的一种并且比较其中检测到标记物的细胞数目与其中未检测到标记物的细胞数目来确定。可替代地，可以检测TRBC1和TRBC2两者，和/或可以检测TRGC1和TRGC2两者，并且可以测定TRBC1与TRBC2的比率或TRGC1与TRGC2的比率或两者。

T细胞种群中的单型程度的测定可以用作提供关于T细胞种群是炎性还是肿瘤性T细胞种群的信息的工具。与对于该组织类型或该个体中的T细胞种群所预期的相比，具有高单型程度的T细胞种群可以诊断为其是肿瘤性T细胞种群。这可能表明需要使用其他指标的进一步研究以确定是否存在T细胞赘生物，或者其可以单独使用以明确地诊断T细胞赘生物。

可以将T细胞的种群(T细胞的测试种群)中TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的百分比或者TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率与T细胞的参考种群中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的百分比或者TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率比较。T细胞的参考种群可以是已知为炎性T细胞种群的T细胞种群。T细胞的参考种群可以是已知为肿瘤性T细胞种群的T细胞种群。T细胞的参考种群可以是已知为非肿瘤性或非炎性T细胞种群的T细胞种群。T细胞的参考种群可以是来自与测试种群相同的受试者或者来自与测试种群不同的受试者的T细胞种群。T细胞的参考种群可以来自相似的组织类型或类似的受试者。T细胞的参考种群还可以包括在体外生长的永生化T细胞淋巴瘤系。

与T细胞的参考种群相比，在T细胞的测试种群中的单型的较高水平可以表明T细胞种群是肿瘤性T细胞种群而不是炎性T细胞种群。由于应答于抗原的T细胞的克隆扩增，可以在T细胞的炎性种群中改变TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率。因此，可以单独使用关于T细胞种群中的TRBC1:TRBC2和/或TRGC1:TRGC2的比率的信息或者与关于细胞的其他信息组合，以确定T细胞种群是炎性T细胞种群还是肿瘤性T细胞种群。例如，其他信息可以包括TRBC1(或TRBC2)细胞是否出现非典型/多形性(例如具有较大的或异常的细胞核或有丝分裂)或T细胞的位置(例如在皮肤活检的表皮或真皮中)，或者种群中多少百分比的T细胞染色有其他标记物(包括但不限于CD2、CD3、CD5、CD4、CD7、CD8或CD30、CD56、颗粒酶、穿孔素、Mib-1、Ki-67、PD1、CD10、CXCL13和bcl6)。

TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率可以是任何比率，并且可以取决于T细胞种群的具体情况。T细胞的肿瘤性种群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率可以比炎性T细胞种群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率更远离1:1。炎性和肿瘤性T细胞种群两者可以具有不为1:1的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。

T细胞的多型种群可以具有比T细胞的单型种群更接近1:1的比率。看起来是多型的T细胞种群可以是炎性T细胞种群。

T细胞的单型种群可以具有比T细胞的多型种群更远离1:1的比率。看起来是单型的T细胞种群可以是肿瘤性T细胞种群。

在本发明的一个实施方式中，如果样品中多于约60％、或多于约70％、或多于约80％、或多于约85％、或多于约90％的T细胞表达特定的β或γ恒定链，即TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2，那么可以将该种群定义为单型的并且可能是克隆的。如果种群被定义为单型的，并且因此可能是克隆的，其还可以被定义为肿瘤性的。在一个实施方式中，如果T细胞的种群具有超过80％的其细胞表达特定的β或γTCR恒定链区，则该种群可以被认为是肿瘤性的。

T细胞的种群可以是T细胞的组。T细胞的种群可以是在样品中或者分离自来自受试者的样品。T细胞的种群可以是在样品中，或者分离自血液或骨髓的特定组织的样品。T细胞的种群可以是在特定组织中的一些或全部的T细胞。T细胞的种群可以是取自特定组织和/或特定受试者的样品中的一些或全部的T细胞。

受试者可以是人类或非人类的哺乳动物。非人类的哺乳动物可以包括小鼠(mouse)、大鼠(rat)、猫、狗、绵羊、山羊、奶牛、马、灵长类、羊驼或美洲驼中的一种或更多种。

样品可以是来自受试者的，或者血液样品、淋巴结吸出物或骨髓吸出试样的全部的或部分的组织或液体或悬浮液。样品可以是一片组织。样品可以是来自活检的组织。样品可以是部分的或全部的组织、淋巴结或者部分或全部的肿块、肿胀或肿瘤。样品可以是来自看起来宏观上正常的组织或部分的组织。

组织可以是任何的组织样品，或血液样品或骨髓样品或者它们的部分。组织可以是部分的或全部的淋巴结。组织可以是，例如，皮肤、胃肠道、骨髓、肺脏、肝脏、脾脏、脂肪、肾脏或血液。由于淋巴瘤、白血病和炎性T细胞浸润可以出现在身体内的任何地方，因此组织可以是任何组织并且样品可以是来自任何组织的固体或液体样品。

可以在组织样品(如以上描述的)内的T细胞的种群中检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2。可以在测试前由组织分离的T细胞的种群中检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2。可以在从样品或T细胞种群中提取的蛋白、DNA或RNA样品中检测TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2蛋白、DNA或RNA。

在进一步的方面，本发明提供了确定T细胞的种群是肿瘤性T细胞种群还是炎性T细胞种群的方法，其中，该方法包括，使用能够量化或另外表明TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的表达并且可以用于提供表达具有TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的T细胞受体的T细胞的百分比的指标的任何方法，测定T细胞种群中TRBC1:TRBC2的比率和/或TRGC1:TRGC2的比率。

优选地，如果在所研究的T细胞种群中多于60％、70％、80％、85％、90％的T细胞表达TRBC1，则样品可以被定义为肿瘤性的。优选地，如果在所研究的T细胞种群中多于60％、70％、80％、85％、90％或更多表达TRBC2，则样品可以被定义为肿瘤性的。优选地，如果在所研究的T细胞种群中多于60％、70％、80％、85％、90％或更多表达TRGC1，则样品可以被定义为肿瘤性的。优选地，如果在所研究的T细胞种群中大于60％、70％、80％、85％、90％或更多表达TRGC2，则样品可以被定义为肿瘤性的。优选地，如果在所研究的T细胞种群中大于60％、70％、80％、85％、90％的T细胞表达相同的TCR恒定区，则样品可以被定义为肿瘤性的。

在进一步的方面，本发明提供了适合用于PCR反应以特异性检测TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的寡核苷酸对。该对寡核苷酸可以用于测定T细胞种群中的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。该寡核苷酸可以适合用于PCR反应以确定T细胞种群中的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。

该对寡核苷酸可以特异性地检测TRBC1而非TRBC2。该对寡核苷酸可以特异性结合并且扩增TRBC1而非TRBC2的部分或全部。该对寡核苷酸中的一个或两个可以结合在TRBC1而非TRBC2内。该对寡核苷酸中的一个或两个可以结合在TRBC1的3'非翻译区内，例如可以结合在SEQ ID NO：1中所列的序列内。特异性结合并且扩增TRBC1而非TRBC2的部分或全部的寡核苷酸对可以具有在SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所列的序列。

该对寡核苷酸可以特异性地检测TRBC2而非TRBC1。该对寡核苷酸可以特异性地结合并且扩增TRBC2而非TRBC1的部分或全部。该对寡核苷酸可以结合在TRBC2而非TRBC1内。该对寡核苷酸中的一个或两个可以结合在TRBC2的3'非转译区内，例如可以结合在SEQ ID NO：2所列的序列内。特异性地结合并且扩增TRBC2而非TRBC1的部分或全部的该对寡核苷酸可以具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所列的序列。由于TRBC1和TRBC2的3'非转译区(3'UTR)彼此不同，可以将寡核苷酸设计为结合在3'UTR内以区分TRBC1和TRBC2。

在进一步的方面，本发明提供了能够特异性地结合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的仅一种的寡核苷酸或寡核苷酸的组。可以将寡核苷酸直接地或间接地标记，并且通过显色、荧光、放射性同位素或其他的方式检测。该寡核苷酸可以适合用于原位杂交。本发明的寡核苷酸可以结合至彼此不同的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的DNA或RNA序列的任何部分。在本申请中示出的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的序列可以因此用于设计任何长度的寡核苷酸，条件是它们特异性地结合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的仅一种的序列。在一个实施方式中，至少2种、或至少3种、或至少4种或更多种的寡核苷酸用于检测TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的每一种。

该寡核苷酸可以具有选自包括SEQ ID NO.9、10、11或12的组中的任一种的序列，或者与SEQ ID NO.9、10、11或12具有80％、90％、95％或99％的一致性的序列，或者任何这些序列的互补。

寡核苷酸探针可以包括一种或多种、优选地至少2种、3种或4种的结合至具有序列ID No:15(部分的TRBC1)或序列ID No:16(部分的TRBC2)的序列的探针。

为了检测TRBC1，可以使用Seq ID Nos:17至22的序列的一种或多种的寡核苷酸探针。优选地，使用17和18。优选地，使用Seq ID Nos:19至22中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或者全部。

为了检测TRBC2，可以使用Seq ID Nos:23至29的序列的一种或多种的寡核苷酸探针。优选地，使用具有Seq ID Nos:23至25中的一种或多种、两种或更多种或全部的序列的寡核苷酸探针。可替代地，使用具有Seq ID Nos:26至29中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或全部的序列的寡核苷酸探针。可替代地，使用具有Seq ID Nos:23至29中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或全部的序列的寡核苷酸探针。

优选地将寡核苷酸探针直接地或间接地标记，并且可以通过肉眼或数字地，例如通过人眼或数字地在显微镜下检测结合，如通过使用流式细胞术或者其他数字检测方式。

在进一步的方面，本发明提供了包含特异性地结合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的仅一种的寡核苷酸或抗体的诊断试剂。诊断试剂也可以包含可检测的标记，例如，有色的、荧光的、放射性的、特异性结合的、特定尺寸的试剂。

TRBC1和TRBC2核苷酸序列在图7中以较大字体示出的序列处不同。结合至该序列的部分或全部或包含该序列的寡核苷酸、寡核苷酸的组、特异性的检测试剂或试剂可以用于特异性地检测仅TRBC1或者仅TRBC2，而非两者。

TRGC1和TRGC2核苷酸序列在图8中以较大字体示出的序列处不同。与TRGC1相比，TRGC2具有一个或多个额外的外显子。结合至该额外的序列的部分或全部或者包含该序列的寡核苷酸、寡核苷酸的组、探针或试剂可以用于特异性地检测仅TRGC1或者仅TRGC2，而非两者。

在进一步的方面，本发明提供了寡核苷酸的组确定T细胞的种群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率的用途。

该寡核苷酸与互补于特异性结合至其的序列可以具有大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％或100％的序列一致性。

寡核苷酸的组可以包含一种或多种的在本文中描述为具有Seq ID Nos:9至12和17至29的序列的寡核苷酸。

该寡核苷酸必须足够长以特异性地结合至它们的靶向DNA或RNA序列。该寡核苷酸可以为5个至50个核苷酸的长度、10个至40个核苷酸的长度、15个至30个核苷酸的长度或者20个至25个核苷酸的长度。

对于特异性结合，可以使用50个至100个核苷酸的长度、或100个至1000个核苷酸的长度、或200个至800个核苷酸的长度、或500个至700个核苷酸的长度的较长的寡核苷酸。

优选地，将寡核苷酸直接地或间接地标记以使得结合可视化。

在进一步的方面，本发明提供了特异性结合至选自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种多肽的一种或多种抗体、拟抗体、双特异性抗体或它们的片段。抗体可以结合至TRBC1或TRBC2而非两者。抗体可以结合至TRGC1或TRGC2而非两者。抗体可以用于在蛋白水平区分这些蛋白中的每一种的表达水平。抗体可以用于量化替代的恒定区的对的表达，从而确定T细胞的种群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率。可以将抗体或抗体片段或拟抗体修改或标记。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以适合用于免疫组织化学。本发明的抗体可以结合至彼此不同的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的一种的区域。通过比较TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的多肽序列并且确定差异区域，可以确定用于本发明的抗体的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2上的可能的结合位点。

在进一步的方面，本发明提供了根据本发明的寡核苷酸或抗体在研究T细胞单型中的用途。

本发明的方法可以是体外方法。本发明的方法可以在细胞培养中进行。本发明的方法可以在固体或液体的细胞学样品或组织吸出物上进行。本发明的方法可以是体内方法。

可以将本发明的寡核苷酸直接地连接至标记或者经由一些层连接。例如，可以使用将信号放大的支链DNA聚合物的层，将寡核苷酸特异性检测试剂连接至荧光的、显色的或其他形式的标记。该标记可以是荧光的、显色的、放射性的或其他标记。

本发明进一步地提供了寡核苷酸、肽或抗体特异性的检测试剂确定T细胞的种群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率的用途。

本发明进一步地提供了用于药物的根据本发明的寡核苷酸或寡核苷酸的组、根据本发明的寡核苷酸的对或根据本发明的抗体。根据本发明的寡核苷酸或抗体可以选择性地结合至表达T细胞受体恒定区TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中选择的一种的T细胞。根据本发明的寡核苷酸或抗体或其他的治疗模式可以用于治疗表达选自TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的T细胞受体恒定区的目标T细胞。由于可以选择性地抑制或破坏表达特定的一种T细胞受体恒定区的T细胞，同时使表达其他T细胞恒定区的T细胞不受影响，这可以有用于治疗或预防淋巴瘤或移植排斥、自身免疫性疾病或炎性疾病。这限制了治疗的免疫抑制的量。一旦确定了表达特定的T细胞受体恒定区的T细胞，通过本发明的方法或者通过其他的方法，可以通过包含本发明的特异性检测试剂的药剂选择性地靶向作为不期望的克隆扩增的结果，表达已经确定的恒定区的T细胞。

本发明进一步地提供了包含一种或更多种的本发明的寡核苷酸、肽或抗体探针的试剂盒，以及使用该探针和/或试剂盒以确定T-细胞种群中或由其提取的物质中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种或多种的表达的水平的说明。

试剂盒可以进一步地包含阴性对照的寡核苷酸或探针。该试剂盒可以旨在与原位杂交技术或PCR技术一起使用。其可以与试验或者与其他的来自任何制造商的专有的检测试剂一起使用。

本发明进一步提供了诊断方法，包括使用本发明的寡核苷酸、肽或抗体探针以获得T细胞种群的单型或克隆性的标志。该方法可以包括测定T细胞种群中的RBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。该方法可以包括使用探针以将T细胞种群中表达TRBC1、TRBC2、TRGC1、TRGC2中的一种或多种的T细胞可视化。该方法可以包括使用寡核苷酸探针或抗体探针在样品上进行原位杂交或免疫组织化学。该方法可以包括使用TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2特异性的寡核苷酸探针在样品上进行PCR。

本发明进一步地提供了用于检测细胞T-细胞单型的方法，该方法包括：

I)由受试者获得含有T细胞的样品；

II)使用直接或间接标记的寡核苷酸以确定在I中获得的T细胞中的TRBC1和TRBC2，和/或TRGC1和TRGC2的表达水平；

III)检测与寡核苷酸探针杂交有关的信号；

IV)如果多于约60％、70％、80％、85％或90％的T细胞表达相同的恒定区，则得出存在表明克隆性的T细胞单型的结论。

该方法可以进一步地包括如果观察到表明克隆性的T细胞单型，则得出样品包含肿瘤性T细胞的结论。优选地，为了得出T细胞单型为克隆性的标志的结论，至少80％或更多的T细胞必须表达相同的T细胞受体恒定区。

可以通过原位杂交确定样品中的一种或多种寡核苷酸与细胞的结合。

本发明的方法可以因此用于诊断赘生物。其也可以用于通过观察T细胞TCR恒定区表达模式随时间的变化来监测疾病进展和/或对治疗的反应和/或缓解状况。其也可以用于监测免疫应答用于指示它们是否是单克隆的。这些免疫应答可以是自然的或者由多种种类的治疗操控的，例如，在用如易普利姆玛(ipilimumab)的药物治疗或不治疗下，T细胞对肿瘤的应答；在骨髓移植之后骨髓及其他器官中的T细胞应答；在治疗或不治疗下在自身免疫病症中的T细胞应答，以及在传染性疾病，如肺结核、麻风病和病毒感染中的T细胞应答。

在本发明的另一方面，可以特异性地靶向表达选自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的T细胞恒定区的T细胞，以增加或调节那些T-细胞的行为或功能用于治疗性或实验性的(研究)目的。用于特异性靶向的方法可以包括特异性寡核苷酸、特异性抗体、双特异性抗体、拟抗体、抗体片段或它们的变体或者任何其他的特异性检测试剂。

本发明可以进一步地提供治疗赘生性病症的方法，例如通过使用探针以靶向细胞并且递送毒性剂至该细胞。可替换地，本发明可以用于标记肿瘤性的种群中的细胞，其随后可以通过，例如使用FACS，从该种群中去除，并且随后可以将不含赘生性细胞的细胞种群送回至受试者。通过以这种方式处理骨髓样品，其可以用于治疗淋巴瘤或白血病。

本领域技术人员将理解，可以将本发明的任何一个实施方式和/或方面和/或权利要求的优选特征应用至本发明的所有其它的实施方式和/或方面和/或权利要求。

附图说明

现在以下是仅通过实例的方式的参照附图的本发明的详细描述，在附图中；

图1-示出了包含TRBC1和TRBC2之间的序列差异的拼接后的mRNA的区域。上一个外显子的末端以粗体示出，3’UTR以普通字体示出，并且聚腺苷酸化位点(AATAA)是下划线的。其中反向引物(示于图2中)结合的位点以较大字体、下划线和粗体突出。

图2–示出了扩增TRBC1和TRBC2的引物。原则上，许多其他的含有3’未翻译RNA的区域可以用作为用于引物或特异性检测试剂结合的位点。例如，可以使用所有的或一些的3’UTR，或者3’UTR可以包含在结合TRBC1和TRBC2的较大区域的特异性检测试剂内。在该实例中，反向引物结合在图1中以较大字体示出的位点处，而正向引物结合在编码区的上游。

图3-示出了来自两种多克隆T细胞种群(C12和C14)和一种克隆种群(38)的TRBC1和TRBC2PCR的结果，示出后者仅表达TRBC2，

图4-示出了对于来自从反应性组织和T细胞淋巴瘤组织，*T细胞淋巴瘤样品的石蜡包埋的切片分离的RNA的样品的TRBC1(CB1)和TRBC2(CB2)的定量rtPCR的结果。虚线以上表示P<0.05，

图5-示出了TRGC1和TRGC2之间的蛋白差异的区域。由TRGC2额外的外显子编码的氨基酸是下划线的。

图6示出了TRBC1(SEQ ID NO：5)的蛋白质序列和TRBC2(SEQ ID NO：6)的蛋白质序列

图7示出了TRBC1(SEQ ID NO：3)和TRBC2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列。其中图2的寡核苷酸结合的位点是下划线的。其中TRBC1和TRBC2在序列上不同的主要区域以较大字体标明。Tga(TRBC1)或tag(TRBC2)终止密码子和主要的aataaa聚腺苷酸化信号以斜体和下划线标明。

图8示出了TRGC1和TRGC2的核苷酸序列。其中TRBC1和TRBC2在序列上不同的区域以较大字体标明。相比于TRGC1，TRGC2具有额外的外显子。taa终止密码子和主要的aataaa聚腺苷酸化信号以下划线标明。

图9A和9B显示了根据本发明的寡核苷酸探针在非赘生性(良性)的淋巴结样品上示出了阳性染色。图9A示出了使用指向TRBC1的探针的阳性染色，并且图9B示出了使用指向TRBC2的探针的阳性染色。

图10显示了根据本发明的寡核苷酸探针可以区分克隆细胞系，更具体地在唯一地表达TRBC1的Jurkat细胞中。

图11进一步显示了根据本发明的寡核苷酸探针可以区分克隆细胞系，更具体地，唯一地表达TRBC2的CEM细胞中的TRBC表达，。在该图中，使用Seq ID nos：26至29的探针检测TRBC2。

图12显示了使用原位杂交，根据本发明的寡核苷酸探针可以检测淋巴瘤细胞。

图13进一步显示了使用原位杂交，根据本发明的寡核苷酸探针可以检测淋巴瘤细胞。在该图中，使用Seq ID nos：19至22的探针检测TRBC1，并且使用Seq ID nos：26至29的探针检测TRBC2。

图14和15显示了根据本发明的TRBC1和TRBC2探针两者均结合至非赘生性，良性的T细胞种群。

图16详述了在本发明中使用的多种寡核苷酸探针的序列。

图17详述了具有Seq ID Nos：26至29的序列的TRBC2寡核苷酸位于反向和互补的靶序列中的何处。

图18详述了具有Seq ID Nos：19至22的序列的TRBC1寡核苷酸位于反向和互补的靶序列中的何处。

T细胞受体的总体结构确定了其对于结合至由MHC或MHC样分子表现的抗原的特异性。T细胞可以表达α-βT细胞受体或者γ-δT细胞受体。β链包含两个可替换的但非常相似的，被称为TRBC1和TRBC2的恒定区中的一种。类似地，γ链包含两个非常相似的被称为TRGC1和TRGC2的恒定区中的一种。在T细胞种群中，一些T细胞具有带有这些恒定区中的每一种的一种形式的受体，并且一些T细胞具有带有这些恒定区中的每一种的其他形式的受体。因此，表达α-β的T细胞将表达TRBC1或TRBC2中的一种作为β链的恒定区。类似地，表达γ-δ的T细胞将表达TRGC1或TRGC2中的一种作为γ链的恒定区。

这些恒定区中的每一种的差异表达可以用作帮助确定T细胞单型和克隆性的方法，并且因此将炎性的(也被称为反应性或良性的)T细胞浸润与赘生性的(也被称为恶性或淋巴瘤或白血病的)T细胞浸润区分。

人类TRBC1和TRBC2的蛋白质序列因仅极少的氨基酸不同，使得它们很难区分。RNA序列仅在编码区内略微不同，然而在本发明中，使用在3’非翻译区中的差异来将TRBC1和TRBC2区分。在图1中示出了TRBC1和TRBC2共用等位基因的3’非翻译区的mRNA序列。该序列是来自于专业的IMGT数据库，但是应注意的是，在一些出版物和序列提交中，作者已经反向参考了序列名称。在图1中示出了所使用的TRBC1和TRBC2，其中突出的序列表示可以用作为研究表达T细胞种群的TRBC1和TRBC2的方式的差异。

TRGC1和TRGC2等位基因的3’UTR是相同的，但是在编码区存在差异，其一个实例示出于图5中。相比于TRGC1等位基因，TRCG2等位基因全部都具有一个或两个额外的外显子。可以使用在TRGC1和TRGC2的氨基酸序列或mRNA序列中的突出的差异把它们区分开。

使用PCR以区分T细胞受体恒定区

设计了可以用于特异性地扩增在TRBC1和TRBC2之间不同的特有的3’非翻译区的部分的PCR引物(图2)。正向引物结合在TRBC1或TRBC2的编码区内，并且反向引物在图1中的较大字体示出的位置处结合在3’UTR中。cDNA产生自分离自组织切片(包括石蜡包埋的切片、新鲜切片或冷冻切片)的或者从培养物中分离的细胞的RNA。证实了使用其中反向引物结合在3’非翻译区内且正向引物结合在上游的引物，，可以使用来自生长于培养物，包括克隆和多克隆T细胞种群中的细胞的rtPCR区分TRBC1和TRBC2(图3)。

定量rtPCR用于比较分离自反应性或赘生性的甲醛固定石蜡包埋的组织的RNA中的TRBC1和TRBC2比率。由于反应性组织可以包含抗原特异性T细胞扩增，在所有的样品中存在TRBC1和TRBC2的差异表达。然而，四个样品示出了显著地(P<0.05)不同于反应性样品的TRBC1/TRBC2比率(图4)。所有这些均分离自主要含有T细胞淋巴瘤的淋巴结。这些数据证实，TRBC1和TRBC2表达的比率的分析可以用于测试培养物或组织中的T细胞种群，以检验它们的相对单型和克隆性。

已经将基于PCR的方法用作验证，但是可替换地，原位RNA杂交或免疫组织化学的/免疫细胞化学的方法可以用于分析该比率，因为其允许共同产生结构的、形态学的和/或免疫表型的数据并且在不同细胞亚群(例如，CD4+或CD8+细胞，或者在不同组织部位中的细胞，例如，在皮肤活检中的真皮细胞或表皮细胞)中检测TRBC1或TRBC2，这可以增强从恶性的或淋巴瘤的或赘生性T细胞种群中进一步地区分反应性的(或良性或炎性)的T细胞种群的能力。

最后，尽管TRBC1和TRBC2的蛋白质序列是相似的，但是可以产生特异性地结合至选自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一种多肽的单克隆抗体，其可以从TRBC2中区分TRBC1以及从TRGC2中区分TRGC1，潜在性地允许在蛋白水平下确定差异表达水平。

3’未翻译RNA区在RNA序列上含有差异，其可以用于检验表达的差异水平。原位或基于PCR的RNA检测可以基于TRBC1和TRBC2之间的序列差异的任何区域的表达。

由于大多数的赘生性人类T细胞浸润(例如淋巴瘤)源自α-βTCR-表达T细胞，初步研究已经使用了TRBC1和TRBC2，但存在罕见的赘生性γ-δT细胞浸润(例如淋巴瘤)。图5和8示出了在蛋白或RNA水平是相似的差异表达分析的原因的TRGC1和TRGC2的区域。

总之，本实验表明了T细胞受体恒定区基因的表达的比率可以用于确定T细胞种群是反应性的/炎性的还是赘生性的。使用TRBC1和TRBC2的3’非翻译区解决了编码基因序列相似的问题，并且使用检测3’非翻译区的方法将因此特别有用于特异性地检测TRBC1和TRBC2表达的水平。

RT-PCR方法

根据制造商的说明使用RNeasy FFPE试剂盒(QIAGEN 73504)和III第一链合成系统(Life Technologies 18080-051)进行自甲醛固定的石蜡包埋组织的RNA提取和cDNA合成。设计了以下引物组

TRBC1

正向ACCCTGTATGCTGTGCTGGT(SEQ ID NO：9)；

反向GGGATGCAGAGAGGTGAGAG(SEQ ID NO：10)

TRBC2

正向ACCTTGTATGCCGTGCTGGT(SEQ ID NO：11)；

反向CTGGGATGGTTTTGGAGCTA(SEQ ID NO：12)

肌动蛋白

正向GGACTTCGAGCAAGAGATGG(SEQ ID NO：30)；

反向AGCACTGTGTTGGCGTACAG(SEQ ID NO：31)

使用Power Green PCR Master Mix(4367659)在7500快速热循环器(Fast Thermal Cycler)(Applied Biosystems)中进行反应。通过添加25μl的Green PCR Master Mix、300nM的引物组、10μl的cDNA和H2O(最高至50μl)制备实时PCR反应混合物。RT-PCR条件如下：酶活化(保持)95℃持续10min，40次循环的95℃持续15秒以及60℃持续1分钟。

使用原位杂交以区分T细胞受体恒定区并诊断赘生性病症

实施例1-RNAScope验证T细胞中的TRBC1和TRBC2表达水平，可以使用RNAScope确定

为了证实当将活检样品放于玻片上时保留了RNA，在载玻片上的活检样品上进行使用针对具有低表达水平的RNA转录物，例如PPIB的RNAScope探针的体外杂交实验。所得结果显示在对照实验中RNA保存良好。

下一步是使用RNAScope(Minca EC et al.J Cutan Pathol.2015Feb；42(2):82-9)以及用于TRBC1和TRBC2的探针确定是否存在信号。当将对TRBC1和TRBC2特异性的标记的探针应用至非赘生性(良性)淋巴结组织样品时，在所有的玻片上看到信号(图9)。在图9中的染色是其中T细胞表达TRBC1和TRBC2表达的混合物的正常淋巴结的表示。

为了显示可以单独地检测TRBC1/TRBC2表达，用相同的对TRBC1或TRBC2特异性的标记的探针将仅表达TRBC1(Jurkat细胞)或TRBC2(CEM细胞)的克隆细胞系染色。结果示出于图10和11中，由此清楚的是，当T细胞是克隆种群，如在这种情况下示出的细胞系的一部分时，它们是TRBC1或TRBC2的单型。在该组织学研究中观察到的结果由RT-PCR分析支持。

当计数用TRBC1和TRBC2染色的克隆细胞系中的细胞的数目时，观察到以下结果：

单个的细胞系数据(阳性细胞的百分数)：

CEM(PCR限制的TRBC2)

TRBC1 0.17(0.04-0.53)％

TRBC2 95.56％(94.48–96.44)

MOLT-4(PCR限制的TRBC2)

TRBC1 0.06(0.00–0.37)％

TRBC2 97.06(96.14–97.77)％

RPMI8402(PCR限制的TRBC1)

TRBC1 86.00(84.29–87.55)％

TRBC2 22.00(20.12–24.00)％

Jurkat(PCR限制的TRBC1)

TRBC1 90.72(89.26–92.00)％

TRBC2 3.17(2.43–4.12)％

由3个观测者对所有的细胞系记数，对于TRBC1每人记数600个细胞，对于TRBC2每人记数600个细胞，意味着每个细胞系总共记数1800个细胞。对于所有记数(所有细胞系和探针组一起)，由任何一对观察者获得的结果之间的相关性为0.99至1.00(Spearman's)。使用具有连续性校正的Wilson方法计算95％置信区间。

图10和11中已经显示，TRBC1和TRBC2可以用于区分不同的克隆性赘生性细胞系，问题是显示该原理可以转化至患者样品，并且可以用于，例如淋巴瘤的诊断。难点是从相关的反应性(非赘生性)T细胞中区分淋巴瘤细胞，在一些情况下其可以代表>50％的浸润。反应性T细胞是非克隆性的并且应当是大致相等的表达TRBC1和TRBC2的细胞的混合物。然而，有时淋巴瘤细胞是形态学上可确认的(大的、多形态的等等)。通过使用本发明的方法以将TRBC1和TRBC2细胞原位染色，该结果可以与形态分析结合以作出诊断。这在图12和13中示出，两者都显示T-细胞淋巴瘤看起来主要表达仅一种TRBC类型。

与检验表达每种TRBC的T细胞的差异形态一样，也可以使用与其他的T细胞标记的共染色，其可能显著地增强淋巴瘤检测的敏感度。

图14进一步显示了本发明的诊断性能。在图14中，用TRBC1探针(具有Seq ID nos：17和18的探针)和TRBC2探针(具有Seq ID nos：26至 29的探针)将赘生性的良性淋巴结组织染色。结果显示，对每个探针组(棕色点，DAB检测)，所示的副皮质区(T细胞区域)中的约一半的T细胞是阳性的。在每个图像的顶部，存在清楚限定的延伸的阴性区域，其是淋巴结皮质窦。这些很少含有T细胞。

图15示出了与图14相似的结果，但是使用不同的探针组和不同的检测方法。在全自动Ventana Discovery Ultra Immunostainer(Ventana Medical Systems Inc，Tuscon，AZ)的甲酰胺和SSC缓冲液中进行杂交。使用探针的混合物(具有Seq ID nos：19至22的序列的TRBC1探针以及具有Seq ID nos：26至29的序列的TRBC2探针)在37C至46C之间杂交。使用0.1％的SSC在37C和48C之间进行三次严格的洗涤。探针是地高辛标记的，并且通过连接有专用多聚体扩增系统的HRP标记的抗地高辛小鼠单克隆抗体(Ventana Medical Systems Inc，Tuscon，AZ)检测。随后酪胺扩增，沉积半抗原BF(Rimsza et al.Diagnostic Pathology 2014 9：144)，其用HRP标记的小鼠抗BF抗体检测。随后用二氨基联苯胺显色，在探针结合的所有位点留下棕色底物。用苏木精将切片复染色并置于Depex中。再次，对每个探针组，所示的副皮质区(T细胞区域)中的约一半的T细胞是阳性的(棕色点，DAB检测)。在每个图像的顶部，存在清楚限定的延伸的阴性区域，其在TRBC1染色中是淋巴结皮质窦且在TRBC2中是血管，两者都很少含有T细胞。

现在随后是本发明如何可以用于改变和改善当前的相关于淋巴瘤和白血病的临床实践的实例。

1.皮肤淋巴瘤(包括但不限于蕈样真菌病；赛扎里综合征；外周T细胞淋巴瘤，未另外规定；间变大细胞淋巴瘤；淋巴瘤样丘疹病；原发性皮肤CD4-阳性小/中型多形T细胞淋巴瘤)。

皮肤淋巴瘤以外观显示，通常是红色斑块，类似于良性的炎性皮肤病症。通常将这些活检，但通过当前的形态学和免疫组织化学手段难以区分良性病症和淋巴瘤。基于PCR的T细胞受体基因重排研究可能失败或给出单克隆、寡克隆或多克隆的结果，其显示与临床诊断不完全的相关，即淋巴瘤通常是单克隆的，但是作为炎症过程的一部分发生的强免疫应答也可给出单克隆的结果。相反，多克隆或寡克隆结果可能在良性的炎性皮肤病症中更常见，但由于存在大量对淋巴瘤反应的良性的T-细胞种群，一部分的淋巴瘤将产生多克隆或寡克隆结果，其掩盖了从淋巴瘤细胞获得的任何单克隆结果。在所有这些情况下，由于不能将在PCR结果中产生任何克隆峰的原因的细胞种群与其他种群区分开，因此产生困难。在高比例的病例中，尽管进行了这些分析，但没有达到确定性的诊断，因此可以进行血液和骨髓样品的放射学研究和实验室分析，以尝试达到确定性的诊断。这些额外的研究很少有帮助，并采取观望(“观察和等待”)的方法。一种等待患者返回并重复活检分析，希望更确定性的结果，并且一种进行血液和骨髓样品的放射学研究和实验室分析。

如在本发明中描述的TRBC1/2分析将解决该问题。例如，通过使用根据本发明的寡核苷酸或抗体，可以将TRBC1/2分析应用于细胞种群，其也可以基于它们的形态外观、免疫表型(例如，较大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表达)或其他特性限定。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD4+T细胞是TRBC1限制性的(即，表达TRBC1而非TRBC2)，则能够得出这是淋巴瘤而非良性炎性皮肤病症的结论，并且用放射疗法、化学疗法或其它适当的治疗来治疗患者。还应当注意，根据本发明的这种TRBC1/2分析可以在少于24小时内廉价且快速地进行，而T-细胞受体基因重排研究将需要一周至数周。本发明提供了可以更廉价地获得的更可靠的、确定性的和快速的结果。

2.小肠难治性乳糜泻/肠病相关的T细胞淋巴瘤

乳糜泻是一种自身免疫性疾病，由对发现于大麦、黑麦和小麦中的蛋白质谷蛋白的T-细胞应答引发。小百分比的乳糜泻患者发展为肠病相关的T-细胞淋巴瘤，即，在没有乳糜泻的情况下几乎不会见到的病症。乳糜泻与肠病相关的淋巴瘤之间的关键差异是，乳糜泻的组织学特征(小肠上皮中的淋巴细胞以及小肠绒毛的损伤)和症状(腹泻、腹胀、贫血、疲劳)由严格的避免膳食谷蛋白而消退，但是肠病相关的淋巴瘤和难治性乳糜泻(越来越多地被认为是早期形式的肠病相关的淋巴瘤)的那些没有。然而，一部分个体具有进行中的谷蛋白暴露而没有意识到，并且尽管表面上无谷蛋白饮食(其中他们未察觉到进行中的谷蛋白暴露)，他们的症状不能消退。由于存在进展中的肠病相关的T细胞淋巴瘤的怀疑，他们经常进行十二指肠活检，并且在活检中进行组织学检查和克隆性研究。如上述关于皮肤淋巴瘤讨论的，现有的克隆性研究不能可靠地区分良性病症、急性乳糜泻与淋巴瘤病症、难治性乳糜泻/肠病相关的淋巴瘤。血液和骨髓样品的放射学研究和实验室分析不能总是有助于这种区分，并且可以观察患者并进行饮食操作以及进一步地活检以试图达到确定性的诊断。

如参照皮肤淋巴瘤所描述的，通过本发明的技术，如(但不限于)组织学的TRBC1/2分析可以特别应用于基于它们的形态学外观、免疫表型(例如，较大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表达)或其他特性限定的细胞种群以确定是否存在对TRBC1或TRBC2的偏斜。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD8+T-细胞是TRBC1限制性的(即，表达TRBC1而非TRBC2)，则能够得出这是淋巴瘤病症、难治性乳糜泻/肠病相关的淋巴瘤中的一种的结论，并且用化学疗法治疗患者。这在侵袭性的乳糜泻相关的淋巴瘤中可以开始得越早，预后越好。如前所述，本发明的TRBC1/2分析可以在少于24小时内廉价且快速地进行，提供更可靠的、确定性的和快速的结果。

3.骨髓中的T细胞淋巴瘤和白血病

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGL)是CD8+T淋巴细胞的克隆增殖，其引起中性粒细胞减少(即，外周血中中性粒细胞数目减少)，贫血(即，外周血中红血细胞数目减少)，和/或血小板减少(即，外周血中血小板数目减少)。这种病症通常与自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎和其他淋巴增殖性疾病相关。有时通过流式细胞术显示CD8+CD57+T细胞数量增加来表明诊断，并且在一部分的病例中，这通过T细胞受体基因重排研究证实。可替换地，可以在骨髓环钻上诊断T-LGL，有时作为不可预见的偶然发现。在环钻中，可能存在T-细胞数量的质变增加，有时具有簇形成，并且通常具有CD4+:CD8+T细胞比率的反转，尽管该发现不是T-LGL特定的。

基于PCR的T细胞受体基因重排研究可能失败(骨髓环钻的常见问题)或给出为单克隆、寡克隆或多克隆的结果，其显示与临床诊断的不完全相关，即T-LGL通常是单克隆的，但是对骨髓或淋巴结中的淋巴瘤或其它病症，如另一种赘生物，例如B细胞淋巴瘤，骨髓瘤或脊髓发育不良综合症的存在的较强免疫应答可能使得单克隆结果更难以记录。类似地，仅少量的T细胞的存在可导致单克隆结果，称为假克隆性。对外周血进行的T细胞基因重排研究经受类似的限制。因此，在相当大比例的其中可能存在T-LGL的病例中，不能达到确定性诊断，并且采取观望的“观察和等待”方法。

如参照皮肤淋巴瘤所描述的，可以特异性地将通过本发明的技术，如(但不限于)组织学的TRBC1/2分析应用于基于它们的形态外观、免疫表型(例如，较大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表达)或其它特征限定的细胞的种群以测定是否存在对TRBC1或TRBC2的偏斜。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD8+T细胞是TRBC1限制性的(即，表达TRBC1而非TRBC2)，则可以得出这是T-LGL的结论并且用化疗剂如类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺治疗患者。其可以越早开始，预后越好。如先前所述，本发明的TRBC1/2分析可以在少于24小时内廉价且快速地进行，提供更可靠的、确定的和快速的结果。

用于分析TRBC1/2表达水平的本发明的方法允许更准确地诊断骨髓或淋巴结或其他组织或血液样品中存在或不存在淋巴瘤。这在确定例如是通过对皮肤的局部放射疗法还是通过全身化学疗法来治疗皮肤淋巴瘤是至关重要的。

此外，一些全身性T细胞淋巴瘤最初可以表现出相对低水平的骨髓侵犯(例如，淋巴瘤占骨髓中的20-30％的细胞)，并且即使在形态学和免疫组织化学检查以及基于PCR的T细胞受体基因重排研究之后该诊断仍是非确定性的。可以尝试放射学检查和外周血分析，以试图并达到诊断，但通常是不确定性的。然后采用观望(“观察和等待”)方法，直到第二次环钻或淋巴结活检显示高得多的淋巴瘤侵犯的水平，其允许对形态学和免疫组织化学检查确定性地诊断，或者等待在某处生长出可以在放射学上确定并活检以得到明确的组织学诊断的团块。应当注意的是，一部分的患者由于不能得到诊断并因此延迟治疗而死亡。对于以上的T-LGL，通过如(但不限于)组织学的技术来应用TRBC1/2分析可以导致对初始骨髓环钻的快速诊断，导致快得多地开始治疗以及更好的患者结果。

4.淋巴结中的T细胞淋巴瘤

当在显微镜下观察时，一些T细胞淋巴瘤由明显的赘生物样细胞组成。在淋巴结中，它们经常在副皮质区(通常含有丰富的T细胞的淋巴结的部分)中生长。因此可能非常难以测定是否存在淋巴瘤，并且进行昂贵且耗时的基于PCR的克隆性研究，由于在淋巴结中还存在许多的非赘生性细胞，其可能掩盖PCR研究的克隆性质，其通常不能给出确定性结果。

如在本发明中描述的TRBC1/2分析将解决该问题。例如，通过使用根据本发明的寡核苷酸或抗体，可以将TRBC1/2分析应用于也可以基于它们的形态外观、免疫表型(例如，较大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表达)或其他特性限定的细胞种群。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD4+T细胞是TRBC1限制性的(即，表达TRBC1而非TRBC2)，则能够得出这是淋巴瘤而非良性T细胞种群的结论，并用放射疗法、化学疗法或其他适当的疗法治疗患者。还应当注意的是，根据本发明的这种TRBC1/2分析可以在少于24小时内廉价且快速地进行，而T细胞受体基因重排研究将需要一周至数周。本发明提供了可以更廉价地获得的更可靠的、确定性和快速的结果。

序列ID

SEQ ID NO：1 TRGC2 mRNA 3’非翻译区，在图1中示出，上一个外显子的末尾以粗体示出并且主要的3’聚腺苷酸化位点示出为下划线-GTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGTGGAGTTAGGAGCTTCTAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCAGCGCTTCTGAAGAGCTGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTATGTGCATGCACACCTGCACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGACCTTAGCATGCCTAAGTGACTAAACCAATAAA

SEQ ID NO：2 TRBC2 mRNA 3’非翻译区，在图1中示出，上一个外显子的末尾以粗体示出并且主要的3’聚腺苷酸化位点示出为下划线-GTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCCAAAACCATCCCAGGTCATTCTTCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTCCCAATCTGTGTTCCTAAAAGTGATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACATGAATACTTCTCTCTTTTTTCTGTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAAGTACGAAATAGGCTAAACCAATAAA

SEQ ID NO：3 TRBC1外显子和3’UTR，在图7中示出。

SEQ ID NO：4 TRBC2外显子和3’UTR，在图7中示出。

SEQ ID NO：5 TRBC1蛋白质序列，在图6中示出。

SEQ ID NO：6 TRBC2蛋白质序列，在图6中示出。

SEQ ID NO：7 TRGC1蛋白质序列，在图5中示出-XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS

SEQ ID NO：8 TRGC2蛋白质序列，在图5中示出-XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDIIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGIDQEIIFPPIKTDVTTVDPKYNYSKDANDVITMDPKDNWSKDANDTLLLQLTNTSAYYTYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS

SEQ ID NO：9 TRBC1 Cβ1正向引物：ACCCTGTATGCTGTGCTGGT，在图2中示出。

SEQ ID NO：10 TRBC1 Cβ1反向引物：GGGATGCAGAGAGGTGAGAG，在图2中示出。

SEQ ID NO：11 TRBC2 Cβ2正向引物：ACCTTGTATGCCGTGCTGGT，在图2中示出。

SEQ ID NO：12 TRBC2 Cβ2反向引物：CTGGGATGGTTTTGGAGCTA，在图2中示出。

SEQ ID NO：13 TRGC1外显子和3’UTR，在图8中示出。

SEQ ID NO：14 TRGC2外显子和3’UTR，在图8中示出。

SEQ ID NO：15-CCATGTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGTGGAGTTAGGAGCTTCTAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCAGCGCTTCTGAAGAGCTGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTATGTGCATGCACACCTGCACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGACCTTAGCATGCCTAAGTGACTAAACC

SEQ ID NO：16-CATGGTGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCCAAAACCATCCCAGGTCATTCTTCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTCCCAATCTGTGTTCCTAAAAGTGATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACATGAATACTTCTCTCTTTTTTCTGTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAAGTACGAAATAGGCTAAACC

SEQ ID NO：17–ACCATGACGGGTTAGAAGCT

SEQ ID NO：18–TTAGGGAGATTTCAGCCGTGA

SEQ ID NO：19–TGGGTTAGGGAGATTTCAGCC

SEQ ID NO：20–ATTGGGATGCAGAGAGGTGAG

SEQ ID NO：21–TGTGTATTGAAACCATGACGG

SEQ ID NO：22–CTAACTCCACTTCCAGGGCTG

SEQ ID NO：23–TGTAAGTAGGAGATGAGAAGCA

SEQ ID NO：24–TTGGGAGCAGGTACAGGAGAAT

SEQ ID NO：25–AGGATGAAGAATGACCTGGGAT

SEQ ID NO：26–GCCTATTTCGTACTTGGGGGT

SEQ ID NO：27–GTAAGTAGGAGATGAGAAGCAG

SEQ ID NO：28–AGGAACACAGATTGGGAGCAG

SEQ ID NO：29–CCTGGGATGGTTTTGGAGCTA

SEQ ID NO：30–肌动蛋白正向引物：GGACTTCGAGCAAGAGATGG

SEQ ID NO：31–肌动蛋白反向引物：AGCACTGTGTTGGCGTACAG

SEQ ID NO：32–反向和互补的TRBC2靶序列，在图17中示出：TTTATTGGTTTAGCCTATTTCGTACTTGGGGGTTGGGAGCTCAATCTTCAGGGAAACAGAAAAAAGAGAGAAGTATTCATGTAAGTAGGAGATGAGAAGCAGAGTGAGAATCACTTTTAGGAACACAGATTGGGAGCAGGTACAGGAGAATCCTGGGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTTGAC

SEQ ID NO：33–反向和互补的TRBC1靶序列，在图18中示出：

TTTATTGGTTTAGTCACTTAGGCATGCTAAGGTCCCCCTGGGTTAGGGAGATTTCAGCCGTGAGTGTGCAGGTGTGCATGCACATAGGGGGATATCTATTGGGATGCAGAGAGGTGAGAGCAGCTCTTCAGAAGCGCTGGCAAAAGAAGAATGTGTATTGAAACCATGACGGGTTAGAAGCTCCTAACTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCAGAAATCCTTTCTCTTGAC

序列表

<110> 牛津大学科技创新有限公司

<120> T细胞单型的分析

<130> JA74505P.WOP

<150> GB 1417498.1

<151> 2014-10-03

<150> GB 1510237.9

<151> 2015-06-12

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gtcaagagaa aggatttctg aaggcagccc tggaagtgga gttaggagct tctaacccgt 60

catggtttca atacacattc ttcttttgcc agcgcttctg aagagctgct ctcacctctc 120

tgcatcccaa tagatatccc cctatgtgca tgcacacctg cacactcacg gctgaaatct 180

ccctaaccca gggggacctt agcatgccta agtgactaaa ccaataaa 228

<210> 2

<211> 218

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gtcaagagaa aggattccag aggctagctc caaaaccatc ccaggtcatt cttcatcctc 60

acccaggatt ctcctgtacc tgctcccaat ctgtgttcct aaaagtgatt ctcactctgc 120

ttctcatctc ctacttacat gaatacttct ctcttttttc tgtttccctg aagattgagc 180

tcccaacccc caagtacgaa ataggctaaa ccaataaa 218

<210> 3

<211> 915

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60

tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cccgaccacg 120

tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acggacccgc 180

agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240

gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300

acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360

tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc taccagcaag 420

gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc ctgtatgctg 480

tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc tgaaggcagc 540

cctggaagtg gagttaggag cttctaaccc gtcatggttt caatacacat tcttcttttg 600

ccagcgcttc tgaagagctg ctctcacctc tctgcatccc aatagatatc cccctatgtg 660

catgcacacc tgcacactca cggctgaaat ctccctaacc cagggggacc ttagcatgcc 720

taagtgacta aaccaataaa aatgttctgg tctggcctga ctctgacttg tgaatgtctg 780

gatagctcct tggctgtctc tgaactccct gtgactctcc ccattcagtc aggatagaaa 840

caagaggtat tcaaggaaaa tgcagactct tcacgtaaga gggatgaggg gcccaccttg 900

agatcaatag cagaa 915

<210> 4

<211> 905

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

aggacctgaa aaacgtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60

tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg 120

tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180

agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240

gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300

acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg 360

tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag 420

gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg 480

tgctggtcag tgccctcgtg ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctagc 540

tccaaaacca tcccaggtca ttcttcatcc tcacccagga ttctcctgta cctgctccca 600

atctgtgttc ctaaaagtga ttctcactct gcttctcatc tcctacttac atgaatactt 660

ctctcttttt tctgtttccc tgaagattga gctcccaacc cccaagtacg aaataggcta 720

aaccaataaa aaattgtgtg ttgggcctgg ttgcatttca ggagtgtctg tggagttctg 780

ctcatcactg acctatcttc tgatttaggg aaagcagcat tcgcttggac atctgaagtg 840

acagccctct ttctctccac ccaatgctgc tttctcctgt tcatcctgat ggaagtctca 900

acaca 905

<210> 5

<211> 176

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

165 170 175

<210> 6

<211> 178

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser

165 170 175

Arg Gly

<210> 7

<211> 173

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 杂项特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何自然存在的氨基酸

<400> 7

Xaa Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

165 170

<210> 8

<211> 189

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 杂项特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何自然存在的氨基酸

<400> 8

Xaa Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Glu

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Thr Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val

115 120 125

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Trp Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

130 135 140

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

165 170 175

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

180 185

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

accctgtatg ctgtgctggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

gggatgcaga gaggtgagag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

accttgtatg ccgtgctggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

ctgggatggt tttggagcta 20

<210> 13

<211> 958

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

gataaacaac ttgatgcaga tgtttccccc aagcccacta tttttcttcc ttcaattgct 60

gaaacaaagc tccagaaggc tggaacatac ctttgtcttc ttgagaaatt tttccctgat 120

gttattaaga tacattggga agaaaagaag agcaacacga ttctgggatc ccaggagggg 180

aacaccatga agactaatga cacatacatg aaatttagct ggttaacggt gccagaaaag 240

tcactggaca aagaacacag atgtatcgtc agacatgaga ataataaaaa cggagttgat 300

caagaaatta tctttcctcc aataaagaca gatgtcatca caatggatcc caaagacaat 360

tgttcaaaag atgcaaatga tacactactg ctgcagctca caaacacctc tgcatattac 420

acgtacctcc tcctgctcct caagagtgtg gtctattttg ccatcatcac ctgctgtctg 480

cttagaagaa cggctttctg ctgcaatgga gagaaatcat aacagacggt ggcacaagga 540

ggccatcttt tcctcatcgg ttattgtccc tagaagcgtc ttctgaggat ctagttgggc 600

tttctttctg ggtttgggcc atttcagttc ttatgtgtgt actattctat ctattgtata 660

acggttttca aaccagtggg cacacagaga acctcactct gtaataacaa tgaggaatag 720

ccacggcgat ctccagcacc aatctctcca tgttttccac agctcctcca gccaacccaa 780

atagcgcctg ctatagtgta gacatcctgc ggcttctagc cttgtccctc tcttagtgtt 840

ctttaatcag ataactgcct ggaagccttt cattttacac gccctgaagc agtcttcttt 900

gctagttgaa ttatgtggtg tgtttttccg taataagcaa aataaattta aaaaaatg 958

<210> 14

<211> 1013

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

gataaacaac ttgatgcaga tgtttccccc aagcccacta tttttcttcc ttcaattgct 60

gaaacaaaac tccagaaggc tggaacatac ctttgtcttc ttgagaaatt tttcccagat 120

attattaaga tacattggca agaaaagaag agcaacacga ttctgggatc ccaggagggg 180

aacaccatga agactaacga cacatacatg aaatttagct ggttaacggt gccagaagag 240

tcactggaca aagaacacag atgtatcgtc agacatgaga ataataaaaa cggaattgat 300

caagaaatta tctttcctcc aataaagaca gatgtcacca cagtggatcc caaatacaat 360

tattcaaagg atgcaaatga tgtcatcaca atggatccca aagacaattg gtcaaaagat 420

gcaaatgata cactactgct gcagctcaca aacacctctg catattacat gtacctcctc 480

ctgctcctca agagtgtggt ctattttgcc atcatcacct gctgtctgct tggaagaacg 540

gctttctgct gcaatggaga gaaatcataa cagacggtgg cacaaggagg ccatcttttc 600

ctcatcggtt attgtcccta gaagcgtctt ctgaggatct agttgggctt tctttctggg 660

tttgggccat ttcagttctc atgtgtgtac tattctatct attgtataat ggttttcaaa 720

ccagtgggca cacagagaac ctcactctgt aataacaatg aggaatagcc atggcgatct 780

ccagcaccaa tctctccatg ttttccacag ctcctccagc caacccaaat agcgcctgct 840

atagtgtaga cagcctgcgg cttctagcct tgtccctctc ttagtgttct ttaatcagat 900

aactgcctgg aagcctttca ttttacacgc cctgaagcag tcttctttgc tagttgaatt 960

atgtggtgtg tttttccgta ataagcaaaa taaatttaaa aaaatgaaaa gtt 1013

<210> 15

<211> 226

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

ccatgtcaag agaaaggatt tctgaaggca gccctggaag tggagttagg agcttctaac 60

ccgtcatggt ttcaatacac attcttcttt tgccagcgct tctgaagagc tgctctcacc 120

tctctgcatc ccaatagata tccccctatg tgcatgcaca cctgcacact cacggctgaa 180

atctccctaa cccaggggga ccttagcatg cctaagtgac taaacc 226

<210> 16

<211> 218

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

catggtgtca agagaaagga ttccagaggc tagctccaaa accatcccag gtcattcttc 60

atcctcaccc aggattctcc tgtacctgct cccaatctgt gttcctaaaa gtgattctca 120

ctctgcttct catctcctac ttacatgaat acttctctct tttttctgtt tccctgaaga 180

ttgagctccc aacccccaag tacgaaatag gctaaacc 218

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

accatgacgg gttagaagct 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

ttagggagat ttcagccgtg a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 19

tgggttaggg agatttcagc c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 20

attgggatgc agagaggtga g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

tgtgtattga aaccatgacg g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 22

ctaactccac ttccagggct g 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

tgtaagtagg agatgagaag ca 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

ttgggagcag gtacaggaga at 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

aggatgaaga atgacctggg at 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

gcctatttcg tacttggggg t 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

gtaagtagga gatgagaagc ag 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 28

aggaacacag attgggagca g 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

cctgggatgg ttttggagct a 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 30

ggacttcgag caagagatgg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

agcactgtgt tggcgtacag 20

<210> 32

<211> 218

<212> DNA

<213> 智人

<400> 32

tttattggtt tagcctattt cgtacttggg ggttgggagc tcaatcttca gggaaacaga 60

aaaaagagag aagtattcat gtaagtagga gatgagaagc agagtgagaa tcacttttag 120

gaacacagat tgggagcagg tacaggagaa tcctgggtga ggatgaagaa tgacctggga 180

tggttttgga gctagcctct ggaatccttt ctcttgac 218

<210> 33

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人

<400> 33

tttattggtt tagtcactta ggcatgctaa ggtccccctg ggttagggag atttcagccg 60

tgagtgtgca ggtgtgcatg cacatagggg gatatctatt gggatgcaga gaggtgagag 120

cagctcttca gaagcgctgg caaaagaaga atgtgtattg aaaccatgac gggttagaag 180

ctcctaactc cacttccagg gctgccttca gaaatccttt ctcttgac 228