用于发现改变靶蛋白稳定性的疗法的方法与流程
相关申请案
本申请案主张根据2014年10月10日提交的美国临时申请案ussn62/062,257的35u.s.c.§119(e)的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
联邦政府资助的研究
本发明根据美国国立卫生研究院授予的2r01ca068490-19和2r01ca076120-13在政府支持下进行。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术：
报道基因测定已经在制药和生物技术工业中常规地使用以识别影响蛋白功能的前导化合物。在近十年中，化学家在短时间内通过如组合化学反应的技术合成大量化学化合物能力已大大提高，并且常常需要筛选数千到数百万的化合物以识别对所关注蛋白质具有期望效应的那些化合物。
通常，报道基因测定测量在样品中一种报道基因蛋白的活性，但是可结合多种报道基因。用于共表达多种报道基因的一个策略涉及双顺反子构建体的设计，其中通过内部核糖体进入位点(ires)序列分隔开的两种基因在常见上游启动子的控制下表达为单个转录盒(或双顺反子转录)(延(yen)等人，《科学(science.)》2008年11月7日；322(5903)：918-23)。插入ires序列充当用于有效的帽独立性内部翻译起始的核糖体结合位点。此设计实现具有ires引导的帽独立性翻译的两种基因的转录。此系统允许在实验处理时不期望改变的对照报道基因与在每个测试样品中归一化为所述对照的测试报道基因一起共表达。然而，相比于帽独立性翻译，在所述细胞中的许多扰动可差异地影响盖独立性翻译。此外，一些ires已经示出显示下游基因的可变表达(王(wong)等人《基因疗法(genether.)》2002年3月；9(5)：337-44)。这导致高的假阳性和不可靠的报道基因测定。因此，存在用于分析蛋白稳定性的有效的高通量方法的需要，其中报道基因活性的非特异性变异用于控制在细胞类蛋白稳定性测定中的固有变化。这使得降低有效且高效地运行hts测定所需要的数据中的错误。
技术实现要素：
在一些方面，本公开涉及可用于在特异性扰动之后有效监测数千蛋白的稳定性的质粒的开发。
根据一些方面，本公开提供一种识别使所关注蛋白稳定或使其不稳定的测试化合物的方法，所述方法包括：
(i)使包括dna质粒的转化的宿主细胞与测试化合物接触，其中所述质粒包括以可操作连接的
(a)启动子，
(b)第一内部核糖体进入位点(ires)；
(c)编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；
(d)第二ires；以及
(e)编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，
其中开放阅读框(orf)融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列，并且其中所述开放阅读框编码所关注蛋白；
(ii)在所述测试化合物的存在和不存在所述测试化合物下确定融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率；以及
(iii)当所述在测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比增加时，将所述测试化合物识别为稳定剂，而当在所述测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比降低时，将所述测试化合物识别为去稳定剂。
在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白具有可区分的可检测报道基因信号。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有由其产物产生的可区分信号的酶蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分的生物发光信号的生物发光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为具有可区分的荧光信号的荧光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由海肾荧光素酶(rluc)和萤火虫荧光素酶(fluc)组成的群组。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的群组。在一些实施例中，所述启动子为真核启动子或合成启动子。在一些实施例中，所述启动子包括巨细胞病毒(cmv)启动子。在一些实施例中，所述开放阅读框来源于生物体的orfeome。在一些实施例中，所述开放阅读框编码癌蛋白。在一些实施例中，所述癌蛋白选自由以下组成的群组：myc、ikaros家族锌指蛋白1(ikzf1)、ikaros家族锌指蛋白3(ikzf3)、干扰素调节因子4(irf4)、突变体p53、n-ras、c-fos和c-jun。在一些实施例中，使包括所述质粒的转化的宿主细胞与测试化合物接触包括在所述测试化合物存在下使所述转化的宿主细胞生长适当的时间。
本发明的所述实施例和方面中的每个可独立或组合实践。此外，本文所用的措词和术语是出于描述的目的并且不应被视为是限制性的。本文“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”以及其变体的使用意指涵盖在其后所列举的所述项目和其等效物以及额外项目。
参考具体实施方式，本发明的这些和其它方面以及各种优点和效用将变得显而易见。本发明的每个方面可涵盖如将被理解的各种实施例。
在本申请案中识别的所有文献以其全文引用的方式并入本文中。
附图说明
附图并不打算按比例绘制。在附图中，不同的图中所说明的每个相同或几乎相同的组件由类似数字表示。为了清楚的目的，可能不在每一个附图中标记每一个组件。在附图中：
图1确认在293ft和hela细胞中的pirigf构建体表达(图1a至1c)和在u-2os细胞中的pug-firp构建体表达(图1d)。测试若干不同形式的哺乳动物和慢病毒质粒构建体的产生表达标记的靶蛋白(例如萤火虫或nanoluc标签)和共表达报道基因荧光素酶(例如海肾或萤火虫)的细胞(例如293ft、hela或u-2os细胞)的能力。
在图2中，293ft和hela细胞用ikzf1-萤火虫、ikzf3-萤火虫和myc-萤火虫融合蛋白转染并且分别使用嘌呤霉素和遗传霉素选择。这些集合体非常不稳定并且在10到30天中丢失信号并且通常对imid具有极小应答(图2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分离单个克隆。存活的细胞被分离为菌落，进一步扩增并且测试荧光素酶信号和对imid的应答。克隆2b4被识别为对来那度胺的强应答者。hela细胞表达非常低水平的荧光素酶，这使hela克隆的分离非常困难。通过对萤火虫、ikzf1和myc的蛋白质印迹的检测确认所述融合蛋白的表达和与萤火虫荧光素酶信号相关的相对表达(图2d)。
在图3中表达指定萤火虫融合蛋白的细胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在dual-glo测定中评估再现性。imid的效能和萤火虫荧光素酶信号的相对降低确认期望的应答并且产生具有足够用于筛选的z'值的数据(图3a至3d)。
图4示出了对于ikzf12b4细胞-活性化合物(prestwick收集；图4a)和nci收集；图4b)的试验性筛选结果。
图5示出了对于myc5f2细胞-活性化合物nci收集)的试验性筛选结果。
图6确认在ikzf12b4和myc5f2细胞系(图6a至6c)上测试命中物。来自市售化合物和来自dtp化合物的概述重复测试数据在图6d至6e中示出。
图7示出了使用蛋白质印迹的确认数据。ikzf12b4细胞系实例(图7a至7b)、myc5f2实例(图7c)。
图8示出了hsp90抑制剂的进一步评估。图8a表明在用myc-萤火虫融合蛋白暂时转染的细胞上的hsp90抑制剂cct018159和格尔德霉素的测试。图8b示出了在稳定表达myc-萤火虫融合蛋白的293ft细胞上的hsp90抑制剂cct018159和格尔德霉素的测试。图8c示出了在稳定表达myc-萤火虫融合蛋白的5种不同细胞系上的若干hsp-90抑制剂在各种剂量下的测试。图8d比较在暂时表达ikzf1-萤火虫融合蛋白的293ft细胞上的所述hsp90抑制剂biib021和泊马度胺。
图9示出了iccb筛选结果的概貌图。具体地说，它示出了用于ikzf1iccb筛选的最佳挑选重复试验。
图10示出了比较ikzf1对myc细胞系的活性。测试在ikzf1和myc细胞系中的133种最佳挑选。
图11示出了在16小时对于hsp90抑制剂：biib021(图11a)和pf-04929113(图11b)的较好剂量应答。
图12示出了在包含环己酰胺未标记的荧光素酶(图12a)和环己酰胺标记的荧光素酶(图12b)的7种myc细胞系上的环己酰胺时程。
图13示出了在包含mg-132标记的荧光素酶(图13a)和mg-132未标记的荧光素酶(图13b)的7种myc细胞系上的mg132时程。
图14示出了在包含mln4924标记的荧光素酶(图14a)和mln4924未标记的荧光素酶(图14b)的7种myc细胞系上的mln4924时程。
图15示出了在用针对mycmrna的sirna处理48小时的myc阻断基因表现之后的a549-myc-萤火虫和h1299-myc-萤火虫蛋白质印迹确认。如通过具有myc和萤火虫导入抗体的蛋白质印迹观察，融合蛋白的降低(图15a)与荧光素酶信号的降低(图15b)比较。myc抗体还检测内源性myc的降低。
图16示出了来自针对包含表达myc-萤火虫的a549(图16a)、h1299(图16b)和hek293t(图16c)细胞和表达myc-nanoluc的u2os(图16d)细胞的dub酶家族的sirna的商业文库的筛选结果。
具体实施方式
在一些方面，本公开基于可用于在特异性扰动之后有效监测数千蛋白的稳定性的所述质粒的开发。所述质粒允许两种报道基因蛋白的所述共表达，其中的每种处于ires的控制下。以此方式，两种报道基因一起被转录(即由相同mrna编码)并且两者均使用ires翻译。这将由差异地影响ires依赖性与ires独立性翻译的扰动(例如化合物)引起的所述两种报道基因的比率的伪改变的问题最小化，并且因此将假阳性最小化。
根据一些方面，本公开提供一种识别使所关注蛋白稳定或使其不稳定的测试化合物的方法。所述方法包括
(i)使包括dna质粒的转化的宿主细胞与测试化合物接触，其中所述质粒包括以可操作连接的
(a)启动子，
(b)第一内部核糖体进入位点(ires)；
(c)编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；
(d)第二ires；以及
(e)编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，
其中开放阅读框(orf)融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列，并且其中所述开放阅读框编码所关注蛋白；
(ii)在所述测试化合物的存在和不存在所述测试化合物下确定融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率；以及
(iii)当在所述测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比增加时，将所述测试化合物识别作为稳定剂，而当在所述测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的比率相比降低时，将所述测试化合物识别为去稳定剂。
如本文所用，“可操作连接”是指在两种核酸序列，如转录控制元件(例如启动子)和连接的经转录序列之间的功能连接。因此，启动子如果可调节基因的转录，那么它与基因处于可操作连接中。
如本文所使用，“启动子”通常含有提供用于rna聚合酶的结合位点和用于发生转录的转录因子的特异性dna序列(响应性元件)。在一些实施例中，启动子为真核启动子或合成启动子。启动子的实例包含但不限于tata盒、来自猿猴病毒40的sv40晚期启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、泛素c启动子(ubc启动子)和t7启动子。这些和其它启动子序列是在本领域中是众所周知的。在本发明的一个实例中，启动子为cmv启动子。在本发明的一个实例中，启动子为ubc启动子。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“ires”为调节在rna分子上的核糖体的内部进入并且由此调节在真核系统中的翻译的顺式作用核酸元件。在本发明的所述方法和组合物中，第一与第二ires元件包含于所述质粒中。所述第一和第二ires元件允许独立翻译编码报道基因蛋白的核苷酸序列并且开放阅读框融合到编码来自单个信使rna的另一报道基因蛋白的核苷酸序列。在一些实施例中，所述第一和第二ires相同(即，它们具有相同序列)。在一些实施例中，所述第一和第二ires是不相同的(即，它们不具有相同序列)。
许多ires元件已经在病毒和真核基因组两者中识别。此外，也已开发合成ires元件。例如，ires元件已经发现于多种病毒中，包含以下病毒属的成员：肠病毒属(例如人类脊髓灰质炎病毒1(石井(ishii)等人(1998)《病毒学杂志(jvirol.)》72：2398-405和白(shiroki)等人(1997)《病毒学杂志》77：1-8)、人类b型柯萨奇病毒)；鼻病毒(例如人类鼻病毒)；肝病毒(a型肝炎病毒)；心病毒属(脑心肌炎病毒ecmv(基因库寄存编号ab041927的核苷酸2137-2752和金(kim)等人(1992)《分子细胞生物学(molcellbiology)》72：3636-43)和泰勒脑脊髓炎病毒(etheirler'sencephalomyelitisvirus))；口蹄疫病毒属(口蹄疫病毒(基因库寄存编号af308157的核苷酸600-1058；贝尔斯罕(belsham)等人(1990)《欧洲分子生物学学会(embo)》77：1105-10；贝利(poyry)等人(2001)rna7：647-60；以及斯通利(stoneley)等人(2000)《核酸研究(nucleicacidresearch)》25：687-94)，a型马鼻炎病毒、马b型鼻炎)；瘟病毒属(例如牛病毒腹泻病毒(普尔(poole)等人(1995)《病毒学(virology)》206：150-154)和典型猪瘟病毒(莱茵布兰(rijnbrand)等人(1997)《病毒学杂志》77：451-7)；丙型肝炎病毒属(例如c型肝炎病毒(冢山-小原(tsukiyama-kohara)等人(1992)《病毒学杂志》66：1476-1483，莱蒙(lemon)等人(1997)《病毒学研讨会(semin.virol.)》5：274-288，和基因库登录号aj242654的核苷酸1201-1812)和gb病毒b)。这些参考文献中的每个均以引用方式并入本文中。
ires元件也已在来自逆转录病毒科的病毒中发现，其包含慢病毒科的成员(例如猿猴免疫缺乏病毒(奥尔曼(ohlmann)等人(2000)《生物化学杂志(journalofbiologicalchemistry)》275:11899-906)和人类免疫缺陷病毒1(巴克(buck)等人(2001)《病毒学杂志》75:181-91)；blv-htlv逆转录病毒(例如人类t亲淋巴病毒1型(阿塔尔(attal)等人(1996)《eees快报(eeesletters)》392：220-4)；以及哺乳动物c型逆转录病毒家族(例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)(瓦格纳(vagner)等人(1995)《生物化学杂志(j.biol.chem)》270：20316-83)，弗云德鼠白血病病毒(friendmurineleukemiavirus)、哈维鼠肉瘤病毒(harveymurinesarcomavirus)，禽类网状内皮组织增殖病毒(洛佩兹-拉斯特拉(lopez-lastra)等人(1997)《人类基因疗法》5:1855-65)，鼠白血病病毒(环境rna)(迪福德(deffaud)等人(2000)《病毒学杂志》74:846-50)，劳斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)(迪福德等人(2000)《病毒学杂志》74:11581-8)。这些参考文献中的每个均以引用方式并入本文中。
真核mrna还含有ires元件，其包含例如bip(马切亚克(macejak)等人(1991)《自然(nature)》355：91)；果蝇的触角控制基因(外显子d和e)(奥(oh)等人(1992)《基因和发展(genesanddevelopment)》6：1643-1653；c-myc；以及细胞凋亡的x链抑制剂(xiap)基因(美国专利第6,171,821号)。
已经产生各种合成ires元件。参见例如格雷戈里(degregorio)等人(1999)《欧洲分子生物学杂志(emboj.)》75：4865-74；欧文斯(owens)等人(2001)《美国国家科学院院刊(pnas)》4：1471-6；以及文卡特桑(venkatesan)等人(2001)《分子和细胞生物学(molecularandcellularbiology)》21：2826-37。对于本领域中已知的另外的ires元件参见例如rangueil.inserm.fr/iresdatabase。
在具体实施例中，ires序列来源于脑心肌炎病毒(ecmv)。
如本文所用，报道基因蛋白为当表达时可例如经由其荧光或酶活性特异性地检测(即，当表达时具有可检测信号)的任何蛋白。所述质粒包括编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列和编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列。开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。在一些实施例中，所述开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列。在一些实施例中，所述开放阅读框融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。这允许人们研究响应于不同刺激的所述连接开放阅读框的所述表达。如本文所用，“融合”旨在意指由所述orf编码的所述氨基酸和所述报道基因蛋白通过肽键接合以产生连续的蛋白序列。因此，融合到所述开放阅读框的所述报道基因蛋白充当所述融合的开放阅读框的稳定性的标记。未融合到所述开放阅读框的其它报道基因蛋白(并且因此不产生具有由所述orf编码的所述氨基酸的连续蛋白序列)充当归一化细胞数量和表达变化的内部对照。
通常，所述第一和第二报道基因蛋白具有可区分的可检测报道基因信号。例如，所述第一和第二报道基因蛋白为具有由其产物产生的可区分的信号的酶蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白为发射不同波长的光和/或利用不同底物的生物发光蛋白。另选地，所述第一和第二报道基因蛋白为在不同波长下发荧光的荧光蛋白。
可使用本领域中已知的许多报道基因蛋白，其包含但不限于生物发光蛋白、荧光报道基因蛋白和酶蛋白，如产生特异性可检测产物的β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶和碱性磷酸酶。所述荧光报道基因蛋白包含例如绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、红色荧光蛋白(rfp)和黄色荧光蛋白(yfp)以及其改性的形式，例如增强的gfp(egfp)、增强的cfp(ecfp)、增强的rfp(erfp)、mcherry和增强的yep(eyep)。
生物发光蛋白如荧光素酶的实例，包含但不限于海肾荧光素酶(rluc)、萤火虫荧光素酶(fluc)和nanoluc，在本领域中是已知的(参见例如范(fan),f.和伍德(wood),k.《测定和药物发展技术(assayanddrugdevelopmenttechnologies)》v5#1(2007)；古普塔(gupta),r.等人《自然方法(naturemethods)》v8#10(2011)；nano-
报导报道基因蛋白的其它非限制性实例在下文示出：
物质特异性荧光素酶特异性、所需辅因子和物理特性。
在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由海肾荧光素酶(rluc)、萤火虫荧光素酶(fluc)和nanoluc组成的所述群组。在一些实施例中，所述第一和第二报道基因蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的所述群组。
开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。所述开放阅读框融合到所述核苷酸序列的5'或3'末端。如本文所用，开放阅读框或orf是指编码氨基酸的连续序列的核苷酸序列。翻译的开放阅读框可为编码蛋白或所关注的多肽的基因的全部或一部分。
所述质粒的所述orf编码所关注蛋白。如本文所用，“所关注蛋白”可为可被关注的任何可想象的多肽或蛋白，以便研究或以其它方式表征。在一些实施例中，所述orf可来源于生物体的orfeome。完全orfeome含有编码给定生物体的所有蛋白的核酸。完整的orfeome的代表性分数为至少60％的由所述生物体表达的所有蛋白。在一些实施例中，所述生物体为哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物为人类。
在一些实施例中，所关注的所述蛋白为人类多肽或蛋白。在一些实施例中，所关注的所述蛋白为癌蛋白，如但不限于ras、myc、src、fos、jun、myb、abl、bcl2、hox11、hox11l2、tal1/scl、lmol、lm02、egfr、mycn、mdm2、cdk4、gli1、igf2、egfr、flt3-itd、tp53、pax3、pax7、bcr/abl、her2neu、flt3r、flt3-itd、tan1、b-raf、e2a-pbx1，和npm-alk，以及pax和fkhr基因家族的成员的融合、wnt、myc、erkegfr、fgfr3、cdh5、kit、ret、干扰素调节因子4(irf4)和trk。其它示范性致癌基因为本领域中众所周知的并且若干此些实例描述于例如《人类癌症的基因基础(thegeneticbasisofhumancancer)》(沃格斯坦(vogelstein),b.和凯泽(kinzler),k.w.编，麦格劳希尔集团(mcgraw-hill)，纽约(newyork,n.y.)，1998)。
在一些实施例中，所关注的所述蛋白为转录因子。此些转录因子的一些实例包含但不限于所述stat家族(stat1、2、3、4、5a、5b和6)、fos/jun、nfκb、hiv-tat和所述e2f家族。在一些实施例中，所关注的所述蛋白为ikaros家族锌指蛋白。在一些实施例中，所关注的所述蛋白为ikzf1、ikzf2、ikzf3、ikzf4或ikzf5。在一些实施例中，所关注的所述蛋白为ikzf1或ikzf3。
编码报道基因蛋白的所述核苷酸序列和所述融合的orf“在框内”，即，包括编码所述报道基因蛋白的所述核苷酸序列的单个多核苷酸的连续三联体密码子，并且所述融合的开放阅读框编码单个连续的氨基酸序列。
本文所描述的方法允许人们筛选化合物的文库和识别使所关注蛋白稳定或使其不稳定的测试化合物。化合物文库为通常用于高通量筛选的存储化合物的收集。所述文库化合物可包含(例如)合成的有机分子、天然存在的有机分子、肽、多肽、核酸分子和其组分。化合物文库的实例包含但不限于screen-
本文所述的质粒可使用本领域中已知的任何可用的技术引入到所述宿主细胞。例如，所述质粒可通过脂质体转染、磷酸钙转染、deae聚葡萄糖介导的转染、电穿孔、转导、声致穿孔、感染和光学转染引入到所述宿主细胞。合适的宿主细胞包含但不限于细菌细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)、酵母细胞(例如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母)、植物细胞(例如烟草和陆地棉)，和哺乳动物细胞(例如cho细胞，和3t3成纤维细胞、hek293细胞、u-2os细胞)。
在一些实施例中，使用本文所述的质粒的转化的宿主细胞与测试化合物接触包括在存在所述测试化合物的情况下使所述转化的宿主细胞在合适的培养条件下生长适当的时间。合适的培养条件(包含所述培养的持续时间)将根据所培养的所述细胞变化。然而，本领域技术人员可容易地通过以下标准协议确定所述培养条件，如《微生物学(microbiology)》学术出版社公司(academicpressinc.)中的系列方法所描述。通常，所述细胞培养基可含有以适当量和组合的以下营养物中的任一种：(一或多种)盐、(一或多种)缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其它(一或多种)糖、抗生素、血清或血清替代物，和其它组分如但不限于肽生长因子、辅因子和微量元素。在一些实施例中，所述经转染的宿主细胞在所述化合物存在下生长15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、24小时、30小时、48小时或72小时。
在一些实施例中，单个转化宿主细胞基于对对照测试化合物的优化的应答首先分离、克隆并且扩增并且经确认以提供hts活动所需要的足够低的误差。通过确定所关注的所述融合的报道基因蛋白相对于具有用于高通量筛选所需要的必需应答稳定性和再现性的所述未融合报道基因的所述应答来帮助选择适当的克隆。通过另外将所述融合的报道基因信号标准化为所述对照未融合的报道基因来帮助识别有用的克隆，这可显著地降低相对于测量单独来自所述融合的报道基因的所述应答的所述固有误差。这种误差降低对于对测试化合物(所述测试化合物具有相对于从治疗和未经治疗样品观察的相应的信号获得的所述应答误差的足够大的应答)对应的有用克隆细胞系的识别很重要，以便提供足够用于高通量筛选的z因子。(en.wikipedia.org/wiki/z-factor)。
“融合的报道基因蛋白信号”是指由融合到所述orf的所述核苷酸序列编码的所述报道基因蛋白的所述可检测信号。如本文所用，“未融合的报道基因蛋白信号”是指由未融合到所述orf的所述核苷酸序列编码的所述报道基因蛋白的所述可检测信号。在所述测试化合物的存在和不存在所述测试化合物下使用本领域中已知的方法确定所述融合的和未融合的报道基因蛋白信号。可使用的检测器如(但不限于)光度计、分光光度计和荧光计，或可检测报道基因蛋白活性的改变的任何其它装置。可使用本领域中已知的使得来自单个样品中的两种报道基因的稳定报道基因信号的定量的测定系统。实例包含但不限于依次测量来自单个样品的萤火虫和海肾荧光素酶的活性的dual-
在检测由所述报道基因蛋白产生的信号之后，在所述测试化合物存在下所述融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率与在不存在所述测试化合物的情况下所述融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比。与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在所述测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率增加时，将所述测试化合物识别为所关注的所述蛋白的稳定剂。相比之下，与在不存在所述测试化合物的情况下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在所述测试化合物存在下融合的报道基因蛋白信号与未融合的报道基因蛋白信号的所述比率降低时，将测试化合物识别为所关注的所述蛋白的去稳定剂。
在一些实施例中，所述开放阅读框融合到编码第一报道基因蛋白的所述核苷酸序列。在此类实施例中，在存在和不存在所述化合物下确定第一报道基因蛋白信号与第二报道基因蛋白信号的比率。与在不存在所述测试化合物的情况下第一报道基因蛋白信号与第二报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在所述测试化合物存在下所述第一报道基因蛋白信号与第二报道基因蛋白信号的所述比率增加时，将所述测试化合物识别为稳定剂。与在不存在所述测试化合物的情况下第一报道基因蛋白信号与第二报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在所述测试化合物存在下第一报道基因蛋白信号与第二报道基因蛋白信号的所述比率降低时，将所述测试化合物识别为去稳定剂。
在一些实施例中，所述开放阅读框融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。在此些实施例中，在存在和不存在所述化合物下确定第二报道基因蛋白信号与第一报道基因蛋白信号的比率。与在不存在所述测试化合物的情况下第二报道基因蛋白信号与第一报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在存在所述测试化合物下所述第二报道基因蛋白信号与第一报道基因蛋白信号的所述比率增加时，将所述测试化合物识别为稳定剂。与在不存在所述测试化合物的情况下第二报道基因蛋白信号与第一报道基因蛋白信号的所述比率相比，当在所述测试化合物存在下第二报道基因蛋白信号与第一报道基因蛋白信号的所述比率降低时，将所述测试化合物识别为去稳定剂。
通过以下实例进一步说明本发明，所述实例决不应理解为进一步限制。在整个本申请中引用的所有参考文献(包含文献参考、授予的专利、公开的专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容特此以引用的方式明确地并入。
实例
实例1
pirigf构建体在293ft和hela细胞中表达(图1a至1c)并且pug-firp构建体在u-2os细胞中表达(图1d)。测试若干不同形式的哺乳动物和慢病毒质粒构建体的产生表达标记的靶蛋白(例如萤火虫或nanoluc标签)和共表达报道基因荧光素酶(例如海肾或萤火虫)的细胞(例如293ft、hela或u-2os细胞)的能力。
293ft和hela细胞用ikzf1-萤火虫、ikzf3-萤火虫和myc-萤火虫融合蛋白转染并且分别使用嘌呤霉素和遗传霉素选择。这些集合体非常不稳定并且在10到30天中丢失信号并且通常对imid具有极小应答(图2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分离单个克隆。存活的细胞被分离为菌落，进一步扩增并且测试荧光素酶信号和对imid的应答。克隆2b4被识别为对来那度胺的强应答者。hela细胞表达非常低水平的荧光素酶，这使hela克隆的分离非常困难。通过对萤火虫、ikzf1和myc的蛋白质印迹的检测确认所述融合蛋白的表达和与萤火虫荧光素酶信号相关的相对表达(图2d)。
表达所述指定萤火虫融合蛋白的细胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在用于再现性的所述dual-glo测定中评估。imid的效能和萤火虫荧光素酶信号的相对降低确认期望的应答并且产生具有足够用于筛选的z'值的数据(图3a至3d)。
在图4a和4b中示出了对于ikzf12b4细胞-活性化合物(prestwick收集和nci收集)的试验性筛选结果。
在图5中示出了对于myc5f2细胞-活性化合物nci收集的试验性筛选结果。
证实在ikzf12b4和myc5f2细胞系上测试的命中物(图6a至6c)。来自市售化合物和来自dtp化合物的概述复验数据在图6d至6e中示出。
图7示出了使用蛋白质印迹的确认数据。ikzf12b4细胞系实例(图7a至7b)、myc5f2实例(图7c)。
图8示出了hsp90抑制剂的进一步评估。图8a表明在用所述myc-萤火虫融合蛋白暂时转染的细胞上的hsp90抑制剂cct018159和格尔德霉素的测试。图8b示出了在稳定表达myc-萤火虫融合蛋白的293ft细胞上的hsp90抑制剂cct018159和格尔德霉素的测试。图8c示出了在稳定表达所述myc-萤火虫融合蛋白的5种不同细胞系上的若干hsp-90抑制剂在各种剂量下的测试。图8d比较在暂时表达ikzf1-萤火虫融合蛋白的293ft细胞上的所述hsp90抑制剂biib021和泊马度胺。
实例2：比较ikzf1对myc细胞系的活性
在hms筛选设施iccb处的筛选活动
在iccb处筛选ikzf1的最佳挑选重复试验(图9)。44,460种化合物中，筛选的0.6％的化合物具有基于相比于板平均值的大于35％的fluc/rluc降低的命中率。最佳挑选0.3％的化合物重复81％(108/133)的命中物，相比于dmso对照具有大于25％的fluc/rluc降低。在两种细胞系中大约90％(97/108)被命中。对于ikzf1对myc，存在11>25％的活性差异。所有上述结果为中等或弱命中。
所述iccb最佳挑选ikzf1对myc选择性比较的所述结果示出，在所述ikzf1细胞系筛选中的大部分命中物在表明非特异性机制的反向筛选测定中也有效(图10)。五种化合物在所述反向筛选中是惰性的，但是仍使ikzf1荧光素酶信号降低大于35％，这显示出一些选择性。
对于hsp90抑制剂的剂量反应
相比于所述反向筛选表达myc-萤火虫的293ft细胞系：表达myc-萤火虫的海肾和u2os细胞系：表明用于ikzf1机制非选择性的海肾，两种hsp90抑制剂，biib021(图11a)和pf-04929113(图11b)，在所述293ftikzf1细胞系中示出类似活性。蛋白水平的阻断基因表现通过蛋白质印迹确认，这表明所述荧光素酶报道基因系统精确地反映融合蛋白降低。
用于7myc-荧光素酶融合细胞系的稳定性时程
在用环己酰胺阻挡所有蛋白合成之后，七种细胞系用于测量所述荧光素酶的半衰期。观察的融合的荧光素酶(myc-萤火虫和myc-nanoluc；图12b)两者的衰减与观察的所述未融合的荧光素酶(海肾和萤火虫；图12a)的所述衰减相比，其使用所述myc-萤火虫：海肾和myc-nanoluc：萤火虫细胞系293t，u2os和所述myc-萤火虫：海肾细胞系a549，h1299和ls174t两者。正如期望，因为未标记的海肾含有pest域，所述未标记的萤火虫的所述半衰期(大约4小时)短于所述未标记的海肾(大约12小时)的所述半衰期。大约2小时的mycnanoluc半衰期长于少于1小时的myc-萤火虫半衰期并且更接近未标记的萤火虫的所述半衰期。myc-nanoluc和未标记萤火虫的平衡的半衰期应降低加工品命中的数量。
在阻挡用mg132的蛋白酶体后，七种myc-荧光素酶报道基因细胞系用于测量myc荧光素酶表达的改变。所述未融合的海肾和萤火虫的所述表达不变维持约6小时，但是在18小时之后降低到在细胞系中的可变程度(图13b)。所有细胞系示出myc荧光素酶融合蛋白增加至少50％，但是具有不同的时程。所述myc-nanoluc展示荧光素酶信号增加约4倍，这表明所述这些融合蛋白的较大部分通过蛋白酶体降解(图13a)。
在用类泛素化修饰抑制剂mln-4924抑制泛素依赖性蛋白分解之后，七种myc荧光素酶报道基因细胞系用于量测myc荧光素酶表达的改变(图14a至14b)。除293tmyc-萤火虫：海肾细胞系以外，最低限度地影响所述未融合的海肾和萤火虫的所述表达。所有细胞系示出myc荧光素酶融合蛋白增加至少50％，通常在治疗6小时之后达到峰值。这些结果确认，在所有7种细胞系中泛素依赖性蛋白分解至少部分造成所述myc融合蛋白的所述稳定性。
在simyc阻断基因表现之后表达myc萤火虫的a549和h1299细胞系
使用针对于mrcmrna的sirna治疗48小时，sirna用于阻断基因表现在所述a549和h1299细胞系中的所述myc萤火虫荧光素酶融合蛋白。如通过具有myc和萤火虫导入抗体的蛋白质印迹所观察，融合蛋白质的所述降低(图15a)与荧光素酶信号的所述降低(图15b)比较。myc抗体还检测内源性myc的所述降低。在所述a549细胞中观察到显著的myc-nick带。
sigenomesirna文库
图16a至16d示出了来自针对具有表达myc萤火虫的a549、h1299和hek293t细胞和表达myc-nanoluc的u2os细胞的dub酶家族的市售sirna的文库的筛选结果。
参考文献
1.r.martiniani，v.diloreto，c.disano，a.lombardo，a.m.liberati，来那度胺的生物活性和其在多发性骨髓瘤中的基础治疗作用(biologicalactivityoflenalidomideanditsunderlyingtherapeuticeffectsinmultiplemyeloma)，《血液学进展(advhematol)》2012,842945(2012)。
2.e.terpos，n.kanellias，d.christoulas，e.kastritis，m.a.dimopoulos，泊马度胺：治疗复发和难治性多发性骨髓瘤的新颖药物(pomalidomide:anoveldrugtotreatrelapsedandrefractorymultiplemyeloma)，《肿瘤靶向和治疗(oncotargetsandtherapy)》6,531(2013)。
3.y.x.zhu，k.m.kortuem，a.k.stewart，在多发性骨髓瘤中的免疫调节药物沙立度胺、来那度胺和泊马度胺的分子作用机制(molecularmechanismofactionofimmune-modulatorydrugsthalidomide,lenalidomideandpomalidomideinmultiplemyeloma)《白血病和淋巴瘤(leukemia&lymphoma)》54,683(2013年4月)。
4.t.ito等人，沙立度胺致畸性的主要靶向的识别(identificationofaprimarytargetofthalidomideteratogenicity)，《科学》327,1345(2010年3月12日)。
5.a.lopez-girona等人，塞拉蛋白为用于来那度胺和泊马度胺的免疫调节和抗增生活性的直接蛋白靶向(cereblonisadirectproteintargetforimmunomodulatoryandantiproliferativeactivitiesoflenalidomideandpomalidomide)，《白血病(leukemia)》26,2326(2012年11月)。
6.l.h.zhang等人，在激活的b细胞类亚型弥漫性大b细胞淋巴瘤中的来那度胺功效取决于irf4和塞拉蛋白表达(lenalidomideefficacyinactivatedb-cell-likesubtypediffuselargeb-celllymphomaisdependentuponirf4andcereblonexpression)，《英国血液学杂志(brjhaematol)》160,487(2013年2月)。
7.y.yang等人，采用用于abc弥漫性大b细胞淋巴瘤的治疗的合成致死率(exploitingsyntheticlethalityforthetherapyofabcdiffuselargebcelllymphoma)，《癌细胞(cancercell)》21,723(2012年6月12日)。
8.y.x.zhu等人，来那度胺和泊马度胺的抗骨髓瘤活性需要塞拉蛋白表达(cereblonexpressionisrequiredfortheantimyelomaactivityoflenalidomideandpomalidomide)，《血液(blood)》118,4771(2011年11月3日)。
9.a.broyl等人，高塞拉蛋白表达与在用沙立度胺维持治疗的新诊断的多发性骨髓瘤患者中的较好存活率相关(highcereblonexpressionisassociatedwithbettersurvivalinpatientswithnewlydiagnosedmultiplemyelomatreatedwiththalidomidemaintenance)，《血液》121,624(2013年1月24日)。
10.d.heintel等人，塞拉蛋白(crbn)的高表达与在患有用来那度胺和地塞米松治疗的多发性骨髓瘤的患者中改善的临床应答相关(highexpressionofcereblon(crbn)isassociatedwithimprovedclinicalresponseinpatientswithmultiplemyelomatreatedwithlenalidomideanddexamethasone)，《英国血液学杂志》161,695(2013年6月)。
11.g.j.zhang等人，体内cdk2抑制的生物发光成像(bioluminescentimagingofcdk2inhibitioninvivo.)《自然·医学(natmed)》10,643(2004年6月)。
12.m.safran等人，用于hif脯胺酰基羟化酶活性的非侵入性成像的小鼠模型：对刺激红血球生成素产生的口服剂的评估(mousemodelfornoninvasiveimagingofhifprolylhydroxylaseactivity:assessmentofanoralagentthatstimulateserythropoietinproduction)，《美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)》103,105(2006年1月3日)。
13.h.c.yen，q.xu，d.m.chou，z.zhao，s.j.elledge，在哺乳动物细胞中的总体蛋白稳定性分布(globalproteinstabilityprofilinginmammaliancells)，《科学》322,918(2008年11月7日)。
14.t.a.soucy等人，作为治疗癌症的新方法的nedd8-活化酶的抑制剂(aninhibitorofnedd8-activatingenzymeasanewapproachtotreatcancer)，《自然》458,732(2009年4月9日)。
15.m.ohh等人，在哺乳动物细胞中的cullin依赖性泛素化需要完整nedd8路径(anintactnedd8pathwayisrequiredforcullin-dependentubiquitylationinmammaliancells)，《欧洲分子生物学学会报告(emboreports)》3,177(2002年2月)。
16.l.cong等人，使用crispr/cas系统的多重基因组工程(multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems)，《科学》339,819(2013年2月15日)。
17.p.mali等人，经由cas9的rna引导的人类基因组工程(rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9)，《科学》339,823(2013年2月15日)。
18.m.merkenschlager，在免疫受体信令、淋巴细胞分化和功能中的ikaros(ikarosinimmunereceptorsignaling,lymphocytedifferentiation,andfunction)，《欧洲生物化学学会联合会快报(febslett)》584,4910(2010年10月15日)。
19.e.c.thompson等人，作为b细胞发育阶段特异性调节电路的一体式组分的ikarosdna结合蛋白(ikarosdna-bindingproteinsasintegralcomponentsofbcelldevelopmental-stage-specificregulatorycircuits)，《抗扰性(immunity)》26,335(2007年3月)。
20.i.ferreiros-vidal等人，ikaros靶向的全基因组识别阐明其对小鼠b细胞谱系标准和b细胞分化前的工作成果(genome-wideidentificationofikarostargetselucidatesitscontributiontomouseb-celllineagespecificationandpre-b-celldifferentiation)，《血液》121,1769(2013年3月7日)。
21.s.monticelli，f.sallusto，采用中心级的负调节剂(negativeregulatorstakecenterstage)，《自然免疫学(natureimmunology)》13,719(2012年8月)。
22.l.a.garraway，w.r.sellers，在人类癌症中的谱系依赖性和谱系存活致癌基因(lineagedependencyandlineage-survivaloncogenesinhumancancer)，《自然评论：癌症(natrevcancer)》6,593(2006年8月)。
23.s.p.shah等人，在卵巢的粒层细胞肿瘤中的foxl2的突变(mutationoffoxl2ingranulosa-celltumorsoftheovary)，《新英格兰医学杂志(nengljmed)》360,2719(2009年6月25日)。
24.p.kastner等人，作为在b细胞急性淋巴母细胞白血病中的肿瘤抑制的ikaros的功能(functionofikarosasatumorsuppressorinbcellacutelymphoblasticleukemia)，《美国血液研究期刊(americanjournalofbloodresearch)》3,1(2013)。
25.f.j.quintana等人，aiolos通过直接沉默il2表达促进th17分化(aiolospromotesth17differentiationbydirectlysilencingil2expression)，《自然免疫学(natureimmunology)》13,770(2012年8月)。
26.n.avitahl等人，用于t细胞激活和调节染色体增值的ikaros设置阈值(ikarossetsthresholdsfortcellactivationandregulateschromosomepropagation)，《抗扰性》10,333(1999年3月)。
27.j.laubach，p.richardson，k.anderson，多发性骨髓瘤(multiplemyeloma)，《医学年评(annurevmed)》62,249(2011)。
28.p.g.richardson等人，用于复发和复发/难治性多发性骨髓瘤的来那度胺加硼替佐米多的中心i期剂量升级试验(multicenter,phasei,dose-escalationtrialoflenalidomideplusbortezomibforrelapsedandrelapsed/refractorymultiplemyeloma)，《临床肿瘤学杂志(jclinoncol)》27,5713(2009年12月1日)。
29.g.r.crabtree，s.l.schreiber，三个部分的发明：胞内信令和诱导的邻近性(three-partinventions:intracellularsignalingandinducedproximity)，《生化科学趋势(trendsbiochemsci)》21,418(1996年11月)。
30.m.r.campanero，e.k.flemington，通过泛素-蛋白酶体依赖性衰退调节e2f：通过prb肿瘤抑制蛋白稳定(regulationofe2fthroughubiquitin-proteasome-dependentdegradation:stabilizationbytheprbtumorsuppressorprotein)，《美国国家科学院院刊》94,2221(1997年3月18日)。
31.d.wiederschain等人，用于肿瘤学靶向验证的单个载体诱导性慢病毒rnai系统(single-vectorinduciblelentiviralrnaisystemforoncologytargetvalidation)，《细胞周期(cellcycle)》8,498(2009年2月1日)。
32.c.j.ott等人，bet溴结构域抑制靶向在高风险急性淋巴母细胞白血病中的c-myc和il7r两者(betbromodomaininhibitiontargetsbothc-mycandil7rinhigh-riskacutelymphoblasticleukemia)，《血液》120,2843(2012年10月4日)。
33.k.kondo，j.klco，e.nakamura，m.lechpammer，w.g.kaelin，需要抑制hif用以通过vonhippel-lindau蛋白的肿瘤抑制(inhibitionofhifisnecessaryfortumorsuppressionbythevonhippel-lindauprotein)，《癌细胞》1,237(2002年，4月)。
34.j.loven等人，通过破坏超级增强子选择性抑制肿瘤致癌基因(selectiveinhibitionoftumoroncogenesbydisruptionofsuper-enhancers)，《细胞(cell)》153,320(2013年4月11日)。
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