甜菊醇糖苷的微生物产生的制作方法

相关申请本申请要求2014年11月5日提交的美国临时申请第62/075,644号的优先权和权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。本公开涉及酶(包括工程化的酶)、编码多核苷酸、宿主细胞和用于产生甜菊醇糖苷的方法。
背景技术：
：：高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上是无热量的，并且通常用于饮食和低热量产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引起升糖反应，这使其适用于针对糖尿病患者的产品和意在控制碳水化合物摄入量的其它产品。甜菊醇糖苷是在甜叶菊(steviarebaudianabertoni)(原产南美某些地区的菊科(asteraceae)(菊科(compositae))家族的多年生灌木)的叶中发现的一类化合物。它们的结构特征在于差异在于碳水化合物残基在c13位和c19位存在单一碱基甜菊醇。它们在甜叶菊叶中积累，占总干重的约10％至20％。基于干重，甜叶菊叶中发现的四种主要糖苷通常包括甜菊苷(9.1％)、莱鲍迪苷a(3.8％)、莱鲍迪苷c(0.6-1.0％)和杜尔可苷a(0.3％)。其它已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷b、c、d、e、f和m、甜菊双糖苷和甜茶苷。估计次要糖基化产物莱鲍迪苷m的效力为蔗糖的约200-350倍，并且被描述为具有稍微苦味或甘草回味的甘醇味道。prakashi等，developmentofnextgenerationsteviasweetener:rebaudiosidem,foods3(1),162-175(2014)。rebm对全球食品行业具有重大意义。虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但是许多这类方法不适合在商业上使用和/或不可持续。因此，仍然需要用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效和经济的方法。另外，需要用于产生大量次要糖基化产物(包括具有多个糖基化的产物诸如reba、rebd、rebe、rebi、rebm等)的方法。发明概述在各个方面，本发明提供了制备甜菊醇糖苷(包括rebd和rebm以及作为甜叶菊叶中次要产物的糖基化产物)的方法，并提供用于这些方法的酶、编码多核苷酸和宿主细胞。本发明提供了用于以高纯度和/或产率产生甜菊醇糖基化产物诸如rebd和rebm的工程化的酶和工程化的宿主细胞。本发明还提供了制备含有甜菊醇糖苷的产品的方法，其中所述产品包括食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂和调味品。在各个方面和实施方案中，本发明提供了用于产生在c13和/或c19处具有多个糖基化的甜菊醇糖苷的酶、编码多核苷酸、宿主细胞和方法。甜菊醇糖苷可具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个糖基化。在各种实施方案中，糖基化选自：c13-o、c19-o、1-2'(在甜菊醇的c-13和/或c19处)和1-3’(在甜菊醇的c13和/或c19处)。进行这些糖基化的示例性酶列于表8中，包括催化甜菊醇的c13-o糖基化(例如，srugt85c2)、甜菊醇的c19-o糖基化(例如，srugt74g1)、甜菊醇糖苷的1-2’糖基化(例如，srugt91d1、srugt91d2、osugt1-2)和甜菊醇糖苷的1-3’糖基化(例如，srugt76g1)的酶。本文公开了可用于各种实施方案的许多衍生物，包括在本文中被鉴定为mbugtc13(seqidno:51)、mbugtc19(seqidno:8)、mbugtc19-2(seqidno:46)、mbugt1-2(seqidno:9)、mbugt1,2-2(seqidno:45)和mbugt1-3(seqidno:10)及其衍生物的酶。在一些实施方案中，本发明提供子了表达用于在体内对菊糖醇底物进行这些糖基化的至少2种、3种或4种ugt酶的宿主细胞。可根据本发明的实施方案可产生的各种甜菊醇糖苷产物示于图28-31和表10中，这些产物包括rebm、rebd、rebe和rebi。根据本发明的实施方案，这些甜菊醇糖苷可在细菌宿主细胞诸如大肠杆菌(e.coli)中(包括在适于大肠杆菌生长和代谢的温度下)以高产率产生。在一些方面，本发明提供了与其亲本ugt酶相比在莱鲍迪苷a(reba)的c19处具有1-2'糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的c13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。此类酶可以提供至rebd的增加的碳通量。另外，本发明提供了与其亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷d(rebd)的c19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的c13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。此类酶可提供至rebm的增加的碳通量。根据本公开，通过产生从糖酵解至甜菊醇再到甜菊醇糖苷的各种途径模块在宿主细胞中工程化甜菊醇糖苷的产生，并且可优化和平衡所述途径模块以促进至甜菊醇，然后至rebd或rebm(或其它糖基化产物)(作为主要糖基化产物)的碳通量。在另一个方面，本发明提供了制备rebd的方法。该方法包括提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(ugt)从甜菊醇产生rebd的宿主细胞，以及在产生rebd的条件下培养所述宿主细胞。ugt酶包含与其亲本ugt酶相比在莱鲍迪苷a(reba)的c19处具有1-2'糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的c13处没有1-2'糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。在某些实施方案中，莱鲍迪苷a(reba)的c19处的1-2'糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的c13处的1-2'糖基化活性。在另一个方面，本发明提供了制备rebm的方法。该方法包括提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(ugt)从甜菊醇产生rebm的宿主细胞，以及在产生rebm的条件下培养所述宿主细胞。ugt酶包括以下酶的一种或多种：(a)与其亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷a(reba)的c19处具有1-2’糖基化活性的增加，而在1-2’甜菊醇糖苷的c13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶；和(b)与其亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷d(rebd)的c19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的c13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。在某些实施方案中，莱鲍迪苷a(reba)的c19处的1-2’糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的c13处的1-2’糖基化活性。可选地或另外地，莱鲍迪苷d(rebd)的c19处的1-3’糖基化活性等于或优于甜菊醇糖苷的c13处的1-3'糖基化活性。在一些实施方案中，本发明提供了经修饰的srugt76g1酶，其提供甜菊醇糖苷和rebd的1-3’糖基化活性，包括在野生型酶(例如，l200a或l200g)的位置200处具有氨基酸取代的酶，其表现出活性的显著提高。在其它方面和实施方案中，本发明提供了ugt酶(以及编码多核苷酸)的环状重排体，其可提供相对于野生型酶新型的底物特异性、产物特征谱和反应动力学。如本文所述，可在宿主细胞中表达环状重排体以产生甜菊醇糖苷。因此，在各种实施方案中，微生物细胞表达至少一种为野生型或亲本ugt酶的环状重排体的ugt酶。一个环状重排体保留了亲本酶的相同基本折叠，但具有不同的n-末端位置(例如，“切割位点”)，原始的n-和c-末端任选地通过连接序列连接。例如，在环状重排体中，n-末端甲硫氨酸位于蛋白质中的除天然n末端外的位置上。例如，本发明提供了osugt1-2和srugt74g1的环状重排体，其可如本文所述被进一步修饰以产生甜菊醇的糖基化产物。在另一个方面，本发明提供了用于在大肠杆菌中产生具有至少4个糖基化的甜菊醇糖苷的方法。根据本发明，大肠杆菌细胞包含多种ugt酶，其可包括本文所述的一种或多种酶，所述酶一起进行至少4个，至少5个，或至少6个连续的糖基化反应。如本文所公开的，糖基化底物和低级糖基化产物充分累积在大肠杆菌细胞中，以允许下游反应以可接受的速率进行，其中大部分糖基化产物最终在细胞外积聚。可从培养基成分中纯化甜菊醇糖苷。因此，大肠杆菌是用于甜菊醇糖苷的产生(这需要菊糖醇主链的若干糖基化反应)的理想宿主。在其它方面，本发明提供了在大肠杆菌中产生甜菊醇糖苷(包括rebm、rebd、rebe、rebi等)的方法。虽然已知用于在宿主细胞中产生甜菊醇的许多酶是植物酶(其通常具有在20至24℃范围内的最佳温度)，但是在较高的温度下，大肠杆菌生长速率和代谢是最佳的。本公开通过在高于24℃的温度(诸如24℃至37℃或27℃至37℃或30℃至37℃下)提高酶生产率来使得能够在大肠杆菌中以高产率产生甜菊醇糖苷。在各种实施方案中，本公开提供用于在大肠杆菌或其它微生物宿主中产生甜菊醇或甜菊醇糖苷的替代性或工程化的ggpps、ks、cpps、ko和kah酶。本发明的其它方面和实施方案将从下面的详细公开内容变得显而易见。附图说明图1显示莱鲍迪苷m(rebm)的化学结构，其为甜菊醇糖苷家族的次要组分，并且是具有六个葡糖基修饰基团的二萜甜菊醇(框)的衍生物。图2显示rebm的途径模块。糖酵解和mep途径被处理为一个模块，下游贝壳杉烯生物合成途径显示为第二模块。甜菊醇的合成显示为第三模块。第四模块是甜菊醇的糖基化和rebm生物合成途径。还显示了支持增强的udp-葡萄糖产生的第五模块。图3显示了包括至rebm的甜菊醇糖苷产生的示例性途径。pscks是双功能柯巴基二磷酸酯和贝壳杉烯合酶(来自暗球腔菌属某种(phaeosphaeriasp.)，其作用牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯(由加拿大红豆杉(taxuscanadensis)ggpp合酶从ipp和dmapp合成的，未显示)。srko是甜叶菊贝壳杉烯氧化酶，atkah是具有甜菊醇单加氧酶活性的拟南芥(arabidopsisthaliana)p450。实心箭头是已知的ugt活性。具有虚线边界的箭头是基于体外对其它底物显示的活性的预测的反应。mbugt1-2是本公开中设计的新型ugt酶。图4显示来自工程化的大肠杆菌细胞的贝壳杉烯产生曲线。(a)和(b)分别是来自选自植物甜叶菊(srcpps和srks)和小立碗藓(physcomitrellapatens)(ppck)的cpps/ks酶的贝壳杉烯产生。(c)和(d)是利用选自真菌物种藤仓赤霉(gibberellafujikuroi)(gfck)和暗球腔菌属某种(psck)的酶构建的菌株。图5显示来自从不同ks酶构建的菌株的gc特征谱。该途径示于图2中。框中的图(左图)是放大的色谱，以显示副产物积累。gc特征谱和对应的ms光谱显示，ks酶对产品特征谱可以是非特异性的。产生具有与贝壳杉烯类似的ms特性的其它萜类化合物副产物。在所有3个途径中，主要产物是贝壳杉烯。通过与先前发表的文献中报道的ms光谱和nmr数据进行比较，证实了贝壳杉烯的真实性。来自所有副产物的ms光谱显示出特征性272分子离子。图6显示来自工程化的菌株的产物特征谱。显示了在不同上游途径调节下来自下不同下游途径表达水平的产物特征谱。副产物与图5所示的相同。每种菌株的基因型细节示于表2中。图7显示，具有使得能够进行贝壳杉烯生物合成的适当平衡的模块的菌株(表2中的菌株47，ch1trcmep-ch1t7psckg)能够在2l生物反应器中具有每升多克规模的贝壳杉烯生产率。图8显示吲哚积累与工程化的菌株的贝壳杉烯产量成反比关系。图9显示了srko酶的重新设计和表征。(a)n末端跨膜区分析和具有对srko的修饰的截短。(b)设计的srko/srcpr酶构建体的示意图。(c)来自大肠杆菌中不同工程化的构建体的蛋白质表达：(1)wt，(2)wt+(ma)ko-o-cpr，(3)wt+(ma)ko-o-cpr，(4)wt+(ma)ko-l-cpr，(5)wt+(ma)ko-l-cpr，(6)wt+(8rp)ko-o-cpr，(7)wt+(8rp)ko-o-cpr，(8)wt+(8rp)ko-l-cpr，(9)wt+(8rp)ko-l-cpr。图10显示了在菌株47背景中处于含srcpr的接头或操纵子构型中的srko的贝壳杉烯酸生产率。图11举例说明在不同质粒拷贝数和启动子强度下的srko构建体的mmme景观探索。不平衡模块显示较少的贝壳杉烯酸积累或贝壳杉烯酸积累，相反地存在上游贝壳杉烯积累的相关增加。图12显示cyp450表达模块的设计，所述模块用于筛选最佳酶变体、n末端截短以及ko、kah或cpr基因的点突变。在各种启动子强度下以质粒或染色体整合的形式在多顺反子操纵子中表达所述两种酶p450和cpr酶。图13显示atkah酶的点突变体，如以相对于野生型atkah的贝壳杉烯酸羟化酶活性的倍数变化表示的。图14显示一系列工程化的atkah，其表现出提高的甜菊醇生产率和贝壳杉烯酸至甜菊醇的最终完全转化。图15显示，在适当平衡的模块中，所述两种酶p450(atkah和srko)和辅因子cyp450还原酶(srcpr)能够将贝壳杉烯通过贝壳杉烯酸完全转化成甜菊醇。图16显示大肠杆菌中的增加的udp-葡萄糖产量，所述大肠杆菌使用模型系统：利用就增加的udp-葡萄糖产量而工程化的产生萜烯的大肠杆菌菌株对小分子咖啡酸的糖基化，使用从pet质粒过表达的葡萄(vitisvinifera)葡萄糖基转移酶2(vvgt2)产生咖啡酸3-葡萄糖苷。相较于未修饰的背景菌株的糖基化咖啡酸滴度的升高显示了支持糖基化的udp-葡萄糖底物汇集物的增加。菌株1是具有半乳糖分解代谢模块(galetkm)、udp-糖焦磷酸酶(usha)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、葡萄糖-1磷酸酶(agp)、β-半乳糖苷酶(lacz)的敲除，并在trc启动子下过表达蔗糖磷酸化酶(spl)(见表7)的菌株47(表2)。菌株2是具有半乳糖分解代谢模块(galetkm)、udp-糖焦磷酸酶(usha)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、葡萄糖-1磷酸酶(agp)、β-半乳糖苷酶(lacz)的敲除，并在t7启动子下过表达蔗糖磷酸化酶(spl)(参见表7)的菌株47(表2)。图17显示用于鉴定整合所有四种ugt活性的最佳糖基化模块的方法。可将所有24种可能的组合快速地组装在3种不同的质粒中，从而使得对于总共72种潜在的构建体，能够以三个不同的水平表达。图18显示了rebm的体内产生。(a)来自大肠杆菌培养物的甜菊醇糖苷的产物滴度。(b)显示rebm鉴定的lc/ms示踪。阴性对照菌株已被修饰来产生甜菊醇和增加的udp-葡萄糖汇集物，而4ugt菌株是阴性对照菌株加上四种ugt。图19显示作为环状重排体设计的起始点的osugt1-2(来自稻，水稻的1-2'糖基化酶)的同源模型。图20显示连接天然n末与c末端的ugt环状重排体的接头。显示了三种不同的接头：(a)附接现有序列的ykddsgysssyaaaagm(seqidno:48)，(b)生成中等长度环的ykdaagm(seqidno:49)，和(c)生成最小环的ygsgm(seqidno:50)。图21举例说明用于选择ugt环状重排体的新的n-和c-末端的标准。新末端的位置应为：(1)暴露于溶剂并远离活性位点以最小化扰动，(2)接近序列中间以最大化与亲本序列的差异，和(3)具有通常在现有环状重排体分割点处发现的氨基酸(lo等，2012,plosone7(2):e31791)。g198、k240、g250和g259处的新的n末端符合这些标准。图22显示osugt1-2的第一轮环状重排体的1-2'糖基化活性。数字表示切割位点在用于生成n-和c-末端的新位置的亲本序列中的位置，而l/m/s标识描述长/中等/短接头(其描述于图20中)。图23显示1-2'ugt环状重排体(mbugt1-2)的细化。对切割位点和接头长度的修饰显示了对于该酶可能的至少一种底物的活性显著增强。l之前的数字(例如xxxl)表示新的切割位点的位置，而l之后的数字(例如1lxx)表示具有198个切割位点的背景中的新接头长度[bl21＝阴性无ugt对照]。图24显示mbugt1-2酶中的点突变。点突变显示对于底物甜菊单苷的活性增加，证明了用于改善通过环状重排生成的的ugt酶的潜力[bl21＝阴性无ugt对照]。图25显示mbugt1-2酶中的点突变。点突变显示对于底物莱鲍迪苷a的活性增加，证明了改善通过环状重排生成的ugt酶的潜力。[bl21＝阴性无ugt对照]。图26显示，对mbugt1-2酶有益的点突变，当被翻译成亲本ugt酶中的适当的氨基酸残基时，不会对活性产生中性或甚至有害的作用。这表明，与亲本酶相比，环状重排体具有进行独特的改善和进化的潜力，这是通过将序列改组成先前未被选择用于天然选择的新型排列而引起的。[bl21＝阴性无ugt对照]。图27显示了通过融合srugt85c2的n末端与srugt76g1的c末端产生的具有c13-o-糖基化活性的嵌合ugt。图28是由srugt85c2催化的可能的反应(由箭头标记的)(即，c13-o-糖基化)的概括。图29是由srugt74g1催化的可能的反应(由箭头标记的)(即，c19-o-糖基化)的概括。图30是由mbugt1-2催化的可能的反应(由箭头标记的)(即，1-2-糖基化)的概括。图31是由srugt76g1催化的可能的反应(由箭头标记)(即，1-3个糖基化)的概括。图32显示srugt85c2酶中的点突变对比对于甜菊醇底物的活性变化。[bl21＝阴性无ugt对照]。图33显示srugt85c2酶中的点突变对比对于c19-吡喃葡糖基甜菊醇物的活性变化。[bl21＝阴性无ugt对照]。图34显示srugt74g1的第一轮环状重排体的c19-o-糖基化活性。数字表示切割位点在用于生成新型n-和c-末端的亲本序列中的位置，而wt/l/s标识描述野生型/长/短接头(其中‘wt’表示无序列改变的现有n-末端与c-末端序列的简单融合)。图35显示srugt76g1酶中的点突变对比对于甜菊苷底物的活性变化。[bl21＝阴性无ugt对照]。图36显示srugt76g1酶中的点突变对比对于莱鲍迪苷d底物上的活性变化。[bl21＝阴性无ugt对照]。图37显示srugt76g1的第一轮环状重排体的1-3’糖基化活性。数字表示切割位点在用于生成新型n-和c-末端的亲本序列中的位置，而l/s标识描述长/短接头。图38显示锚定于2vce的ugt的比对和二级结构，所述ugt是具有解析的晶体结构的拟南芥ugt。q0dpb7-orysj是osugt1-2。加框的是76g1-l200a点突变的位置，所述突变促进了显著提高的活性。框中还显示了保守的pspg基序。图39显示在22℃、30℃和37℃下针对性能体内测试的替代性ggpps酶。图40显示在22℃、30℃和37℃下针对性能体内测试的替代性cpps/ks酶。图41显示在22℃下使用选择的菌株产生的与甜菊醇和其它糖基化产物相比的rebm的滴度图42显示大部分rebm在细胞外积聚。左图显示细胞内外部的rebm和甜菊醇糖苷的滴度。右图显示与在细胞外观察到的每种化合物的百分比相同的数据。图43显示基于甜菊单苷的产量在22℃、30℃和34℃下进行的ugt85c2突变体的筛选。图a和b显示了34℃下的突变体小组，图c显示了在22℃、30℃和34℃下针对甜菊单苷产量筛选的选择的突变体。图44显示在30℃和34℃下对74g1环状重排体的活性的筛选。图44a显示对于甜菊醇的活性，图44b显示对于甜菊双糖苷的活性。图45显示了在22℃、26℃和30℃下对atkah点突变体的活性的筛选。图46显示在30℃和34℃下对mbugt1-2重组突变体的体外筛选。图a显示reba至rebd的转化。图b显示了甜菊单苷至13c甜菊双糖苷的转化。图47显示各种模块构建体在30℃下的贝壳杉烯产量。图48显示各种模块构建体在34℃下的贝壳杉烯产量。图49显示atkah点突变的文库在30℃下的甜菊醇产量。图50显示atkah点突变的文库中的各种atkah点突变在34℃下的甜菊醇产量。图51显示30℃、34℃和37℃下的mbugt1-2环状重排体的活性。图(a)显示reba至rebd的转化。图(b)显示了甜菊单苷至13c甜菊双糖苷的转化。图52显示ugt85c2突变体在30℃、34℃和37℃下将甜菊醇转化成13c甜菊单苷的活性。图53显示ugt76g1突变体在30℃、34℃和37℃下将rebd转化成13crebm的活性。图54显示ugt74g1环状重排体在30℃、34℃和37℃下将甜菊双糖苷转化成13c甜菊苷的活性。具体实施方式在各个方面，本发明提供了制备甜菊醇糖苷(包括rebm、rebd和作为甜叶菊叶中的次要产物的糖基化产物)的方法，并提供用于这些方法的酶、编码多核苷酸和宿主细胞。本发明提供用于以高纯度和/或产率产生甜菊糖醇糖基化产物的工程化的酶和工程化的宿主细胞。本发明还提供了制备含有甜菊醇糖苷诸如rebm或rebd的产品(包括食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味产品等)的方法。根据本公开，可以以降低的成本制备此类含甜菊醇糖苷的产品。在图1中举例说明了rebm，其中将所示的菊糖醇主链(二萜化合物)加框。rebm包含六个糖基化：(1)c13o-糖基化，(2)c131-2’糖基化，(3)c131-3’糖基化，(4)c19o-糖基化，(5)c191-2’糖基化，和(6)c191-3’糖基化。在图3中举例说明了从牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)至rebm的途径。从ipp和dmapp(mep或mva途径的产物)产生的ggpp通过柯巴基合酶和贝壳杉烯合酶的作用转化成贝壳杉烯，所述柯巴基合酶和贝壳杉烯合酶在一些实施方案中可以以为双功能酶的一些存在。通过由一种或多种p450还原酶酶再生的两种p450酶(贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸羟化酶)的作用，从贝壳杉烯产生甜菊醇。在产生甜菊醇后，c13和c19处的一系列糖基化反应能够产生各种甜菊醇糖苷产物，包括六糖基化的rebm。各种其它糖基化产物是可能的(如图3中所示的)，如图28-31中所示，已知的ugt糖基化酶各自能够作用于许多底物。因此，保真度、相对反应速率、表达水平和底物的可用性将影响糖基化产物的相对产量。例如，ugt91d2和osugt1-2均为1-2’糖基化酶，可从甜菊单苷产生甜菊双糖苷(通过在c13处的作用)以及从reba产生rebd(通过在c19处的作用)。另外，ugt76g1是可从甜菊苷产生reba(通过在c13处的作用)以及从rebd产生rebm(通过在c19处的作用)的1-3’糖基化酶。表8、9和10显示可由六个糖基化反应产生的各种可能的甜菊醇糖苷，以及用于每个反应的酶。表1列出了可用于产生甜菊醇糖苷的各种酶。本文还提供了氨基酸序列，其每一个可以任选地包括在位置2处插入或取代的丙氨酸以降低在细胞中的周转率。某些ggpps序列在序列末端还包含两个额外的残基(vd)，所述残基被认为不具有任何有害的作用，并且在某些实施方案中可被省略。因此，在一些方面，本发明提供了用于最大化所需甜菊醇糖苷(例如，rebm)的产生的酶、编码多核苷酸和工程化的宿主细胞。例如，本公开提供了与亲本ugt酶相比在莱鲍迪苷a(reba)的c19处具有1-2’糖基化活性的增加，而在甜菊醇苷的c13处没有1-2’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。此类酶可提供至rebd的增加的碳通量。另外，本公开提供了与亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷d(rebd)的c19处具有1-3’糖基化活性的增加，而在甜菊醇糖苷的c13处没有1-3’糖基化活性的显著损失的经修饰的ugt酶。此类酶可提供至rebm的增加的碳通量。在一些方面和实施方案中，并且不希望受理论束缚，本发明提供了具有能够更好地容纳底物(包括较大的底物)的底物结合袋，从而增加对于更加高度糖基化的甜菊醇底物(诸如reba或rebd)的活性速率(例如，底物结合和周转的速率)的经修饰的ugt酶。本发明在一些方面提供了受控糖基化途径，所述途径主要将rebm产生为糖基化产物。例如，在一些实施方案中，本发明提供了在微生物细胞中制备rebm的方法，其中rebm:rebd比率大于约1:1，或大于约1:0.5，或大于约1:0.25，或大于约10:1，或大于约25:1，或大于约50:1。在一些实施方案中，rebd以小于约20％，或小于约10％，或小于约5％，或小于约1％的rebm产率产生，或在分离的甜菊醇糖基化产物中是不可检测的。因为rebd可能难以与rebm分离，或者如果这种分离是必需的，则可增加显著的纯化成本，因此在一些实施方案中具有低水平rebd的产物是想要的。在一些实施方案中，rebm代表至少约25重量％的由细胞产生的甜菊醇糖基化产物，或按重量计至少约50％的所述糖基化产物，或按重量计至少约75％的所述糖基化产物，或按所述糖基化产物的重量计至少约80％的所述糖基化产物，或按重量计至少约85％的所述糖基化产物，或按重量计至少约90％的所述糖基化产物，或按重量计至少约95％的所述甜菊醇糖基化产物。糖基化途径涉及13-o糖基化、19-o糖基化以及在甜菊醇的c13和/或c19处的一个或多个1-2’糖基化和/或一个或多个1-3’糖基化。术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，其包括但不限于甜菊醇糖苷、甜菊双糖苷、甜茶苷，杜尔可苷b、杜尔可苷a、莱鲍迪苷b、莱鲍迪苷g、甜菊苷、莱鲍迪苷c、莱鲍迪苷f、莱鲍迪苷a、莱鲍迪苷e、莱鲍迪苷h、莱鲍迪苷l、莱鲍迪苷k、莱鲍迪苷j、莱鲍迪苷m、莱鲍迪苷d、莱鲍迪苷n、莱鲍迪苷o。这些甜菊醇糖苷的化学特性是已知的，描述于例如表10中中以及wo2014/122227(其通过引用整体并入本文)中。根据本公开，如图2中所示，通过产生各种途径“模块”在宿主细胞中工程化甜菊醇糖苷的产生，并且其可优化和平衡所述甜菊醇糖苷的产生，以促进至甜菊醇，随后至所需的糖基化产物(诸如，rebm或rebd)(作为主要糖基化产物)的碳通量。通过将具有类似周转率的酶分成亚组或模块，并通过调节酶的浓度/活性来平衡不同亚组的周转率，可优化途径周转率对资源支出的比率。第一途径模块包括mep或mva途径中的酶，所述酶产生ipp和dmapp。mep和mva途径对于生物体可以是内源性的，并且通过提供某些限速酶的复制拷贝，这些途径可以通过下游途径来增加和平衡。ipp和dmapp用作用于作为第二途径模块的(-)-贝壳杉烯的产生(例如，通过分开的柯巴基合酶和贝壳杉烯合酶酶或双功能酶)的底物。第三途径模块通过两种p450酶(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko)和贝壳杉烯酸羟化酶(kah))和一种或多种p450还原酶酶的作用将(-)-贝壳杉烯酸转化成甜菊醇。催化ggpp的产生及其至甜菊醇的转化的示例性酶列于表1中。然后，通过udp酶模块将甜菊醇糖基化成最终产物。另外的模块包括增加udp-葡萄糖底物产生的基因。在本发明的各种实施方案中，这些模块各自以单或多顺反子操纵子的形式存在，所述操纵子各自包含在质粒上或被染色体整合。在某些实施例中，模块被构造来增加所需最终产品的产生。在一个方面，本发明提供了制备甜菊醇糖苷的方法，其任选地是rebm或rebd。该方法包括提供通过多种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶酶(ugt)从甜菊醇产生甜菊醇糖苷的宿主细胞，并在产生甜菊醇糖苷的条件下培养所述宿主细胞。ugt酶包括以下的一种或多种：(a)与其亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷a(reba)的c19处具有1-2’糖基化活性的增加，而在甜菊单苷的c13处没有1-2’糖基化活性的显著损失(例如，当在22℃、27℃或30℃下进行评价时)的经修饰的ugt酶；和(b)与其亲本ugt酶相比，在莱鲍迪苷d(rebd)的c19处具有1-3'糖基化活性的增加，而在甜菊苷的c13处没有1-3'糖基化活性的显著损失(例如，当在22℃、27℃或30℃下进行评估时)的经修饰的ugt酶。在某些实施方案中，莱鲍迪苷a(reba)的c19处的1-2’糖基化活性等于或优于甜菊单苷的c13处的1-2’糖基化活性。可选地或另外地，莱鲍迪苷d(rebd)的c19处的1-3’糖基化活性等于或优于甜菊苷的c13处的1-3’糖基化活性。在一些实施方案中，与亲本酶相比，具有1-2’糖基化活性的经修饰的ugt酶和/或具有1-3’糖基化活性的ugt酶在c13处不表现出显著的活性损失。例如，与亲本(例如，野生型)酶(例如，在22℃、27℃或30℃下评价时)相比，经修饰的酶在c13处保留至少50％的其活性，或在c13处保留至少约75％的其活性，或在c13处保留至少约80％、至少约90％或至少约95％的其活性。在一些实施方案中，所述酶在c13处具有提高的活性，诸如在c13处具有至少2倍或至少3倍提高的活性。可以在体外，例如在添加了目标底物的细胞萃取物中，或其它体外或体内测定中测定糖基化活性的损失或提高。例如，可在产生目标甜菊醇或甜菊醇糖苷底物的菌株中测定相对反应速率。在本文中以及wo2014/122227(其通过引用并入本文)中公开了用于定量糖基化活性的示例性测定。虽然在一些实施方案中，在c19处进行这些反应的酶(例如，没有任何另外的酶来进行这些酶促步骤)具有足够的在c13处的1-2’和1-3’糖基化活性的功能，在其它实施方案中，细胞还表达在c13处进行1-2’和/或1-3’糖基化的酶。在一些实施方案中，第二酶被工程化来即使在c19处的活性损失的情况下，在c13处进行1-2’和/或1-3’反应。在一些实施方案中，细胞只表达一种在甜菊单苷的c13处具有1-2’糖基化活性的ugt酶，和/或只表达一种在甜菊苷的c13处具有1-3’糖基化活性的ugt酶。在此类实施方案中，酶可被工程化来增强在c19处的反应，从而将产物拉向c19糖基化产物，诸如rebm，而不需要表达将另外的代谢负担加在细胞上的另外的酶。在方面和实施方案中，本发明提供了ugt酶的环状重排体(以及编码多核苷酸和制备ugt酶的环状重排体的方法)，其可提供优于亲本(例如，野生型型)酶的新的底物特异性、产物特征谱和反应动力学。不希望受理论束缚，环状重排体提供了使ugt结合袋对较大底物(诸如具有一个或多个糖基基团的甜菊醇底物)更开放或可接近的机会。这样，本发明允许对更多的甜菊醇的糖基化形式进行糖基化反应以与对较少糖基化(且因此较小的)底物的反应相似或甚至更大的速率进行。如本文所述，环状重排体可在宿主细胞中表达以产生甜菊醇糖苷。因此，在各种实施方案中，产生甜菊醇糖苷(例如，rebm或rebd)的微生物细胞表达至少一种ugt酶，其是亲本(例如，野生型)ugt酶的环状重排体。环状重排体保留了亲本酶的相同基本折叠，但是具有天然n末端的不同位置(例如，“切割位点”)，其中原始的n-和c-末端任选地通过连接序列连接。ugt酶(例如，基于osugt1-2)的示例性结构示于图20中。图38中显示了ugt比对和二级结构元件。对于每种环状重排体，可参考亲本序列(例如，野生型序列)的对应位置，通过将重排体的n-末端氨基酸(例如，n-末端50或100个氨基酸)与亲本或野生型序列比对来描述切割位眯。如本文中所用，给定的环状重排体的“切割位点”是指位于环状重排体中的位置2(例如，在起始met之后)处或环状重排体的位置3(当将丙氨酸插入位置2以降低蛋白质周转率时)处的氨基酸的原始位置。应当将用于比较全球ugt序列的比对锚定在图38中所示的保守pspg基序周围。pspg(植物次生产物糖基转移酶)基序是植物ugt内的保守区域，其在结合核苷酸-二磷酸-糖供体分子中起作用。gachon等，plantsecondarymetabolismglycosyltransferases:theemergingfunctionalanalysis,trendsplantsci.10:542-549(2005)。udpgt家族中的该基序中的最保守残基显示出以下模式：wxpqxxxlxhxxxxafxxhxgxxxxxexxxxgxpxxxxpxfxxq，其加以下划线的组氨酸与二磷酸盐区域发生临界接触。finnrd，等.pfam:theproteinfamiliesdatabase,nucleicacidsres.42:d222-230(2014)。另外，围绕该基序的比对可用于描述转化成作为一类的ugt蛋白的有益性质的点突变。例如，与基序起始处的色氨酸或中间的重要组氨酸的的锚定比对可用于描述相对于该序列的点突变，所述点突变在植物gt1udp-葡萄糖糖基转移酶中是通用的。在一些实施方案中，所述环状重排体是来自甜叶菊的ugt85c2的环状重排体。srugt85c2在本文以seqidno：1的一些提供。在一些实施方案中，环状重排体是osugt1-2(seqidno：7)的环状重排体。在一些实施方案中，所述环状重排体是叶甜菊的ugt91d2(seqidno：5)。在一些实施方案中，所述环状重排体是甜叶菊的ugt74g1(seqidno：2)。在一些实施方案中，所述环状重排体是甜叶菊的ugt76g1(seqidno：3)。这样，通过改变ugt酶的n末端的位置，可以产生具有新的底物特异性和活性特征谱的酶。例如，当将环状重排体的n-末端(例如，n-末端50个氨基酸)与亲本或野生型酶对齐时，在一些实施方案中，切割位点位于氨基酸150与300之间，或在一些实施方案中位于氨基酸190与260之间，或在一些实施方案中位于残基190与210之间。在其它实施方案中，当将所述环状重排体的n末端50个氨基酸与亲本或野生型酶对齐时，所述环状重排体在氨基酸245与280之间(例如，位置272)或氨基酸260与275之间具有切割位点。在一些实施方案中，将新的n-末端置于局部二级结构元件(诸如α-螺旋或β-折叠片)之间，和/或置于野生型酶的环结构中。当选择n末端的所需位置时，将met作为起始氨基酸添加至切割位点，并且将ala任选地置于第二位置以降低细胞周转率。天然n和c-末端可任选地通过连接序列来连接。通常，例如使用主要或基本上由gly、ser和/或ala组成的序列，选择连接序列来提供柔性(例如，除潜在环外无确定的二级结构)。在一些实施方案中，连接氨基酸序列长度为约2个至约25个氨基酸，其可以形成环。相对于亲本或野生型酶的对应位置，环状重排体还可包含1个至约30个，或约1个至约20个，或1个至约10个，或1个至约5个氨基酸的取代、缺失或插入(例如，基于最高分数的局部比对)。在一些实施方案中，天然n末端met在分子中保持在其新位置上，或在其它实施方案中被删除。在一些实施方案中，至少一种ugt酶是嵌合ugt酶，其中将一种ugt的n末端结构域与不同ugt酶的c-末端结构域结合。例如，n-末端和c-末端结构域是选自表9的两种不同的酶，并且相对于亲本结构域序列，每个结构域还可包含1至10个氨基酸取代、缺失和/或插入。ugt具有两个结构域，更加可变的n末端底物结合(糖受体)结构域和更保守的c端udp-葡萄糖结合(糖供体)结构域。n末端结构域主要是酶底物特异性的决定因子，但一些特异性由c末端结构域控制。这些结构域中的每一个构成蛋白质的大约一半。在一些实施方案中，具有1-2’糖基化活性的ugt酶是osugt1-2(seqidno:7)、srugt91d2(seqidno:5)、srugt91d1(seqidno:4)、srugt91d2e(seqidno:6)(见表9)或其衍生物。在一些实施方案中，衍生物在reba的c19处具有增加的糖基化活性。ugt酶通常可具有大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％的同一性水平，或对于osugt1-2、srugt91d2、srugt91d1和srugt91d2e中的一种或多种，大于约96％、97％、98％或99％的同一性水平。核苷酸和氨基酸序列的相似性或同一性，即序列同一性的百分比可以通过序列比对来测定。此类比对可用几种本领域已知的算法进行，例如用karlin和altschul(karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877)的数学算法，用hmmalign(hmmer包，http://hmmer.wustl.edu/)或用clustal算法(thompson,j.d.,higgins,d.g.和gibson,t.j.(1994)nucleicacidsres.22,4673-80)来进行。序列同一性(序列匹配)的等级可使用例如blast、blat或blastz(或blastx)来计算。类似的算法被并入altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410的blastn和blastp程序中。blast多核苷酸搜索可以使用blastn程序执行(得分＝100，字长＝12)来进行。blast蛋白质搜索可以用blastp程序(得分＝50，字长＝3)来进行。为获得用于比较目的的缺口比对，如altschul等(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402中所述，使用空位blast(gappedblast)。当使用blast和空位blast程序时，使用各个程序的缺省参数。序列匹配分析可通过已建立的同源性映射技术如shuffle-lagan(brudnom.,bioinformatics2003b,19增刊1:154-162)或马尔可夫随机场来进行补充。在一些实施方案中，具有1-2’糖基化活性的ugt酶是osugt1-2或其衍生物，并且其任选地是包含增加reba的c19处的1-2’糖基化活性的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的osugt1-2的环状重排体。例如，1-2’糖基化酶可具有切割位点，所述切割位点与osugt1-2(seqidno：7)的氨基酸190至210内的位置对齐或对应于所述位置，并且在一些实施方案中可以是seqidno:7的氨基酸194至200内的位置，诸如位置195、196、197或199。所述环状重排体可任选地具有在对应于osugt1-2的n末端和c末端残基的氨基酸之间的接头序列。接头长度可以变化，诸如在2个至约25个氨基酸的范围内。例如，在一些实施方案中，接头的长度可以为约8个至约20个氨基酸，诸如约17个氨基酸。在一些实施方案中，环状重排体不包含任何连接序列。环状重排体还可含有1个至20个，或1个至10个，或1个至5个从野生型序列的氨基酸取代、添加或缺失(通过与osugt1-2的突变序列的局部比对测定的)。在一些实施方案中，在位置2处插入或取代ala以降低细胞中的酶周转率。在一些实施方案中，所述突变共同地增加reba的c19处的1-2’糖基化活性(例如，当在22℃、27℃或30℃下进行评估时)。在一些实施方案中，具有1-2’糖基化活性的ugt酶是osugt1-2的环状重排体，其中切割位点对应于osugt1-2的位置195、196、197、198或199。本文公开了命名为mbugt1-2的示例性环状重排体。环状重排体可在对应于野生型酶的位置14、16、89、185、365、366、395、396、417、420、421、422、424、427、428、430、431、432、434和/或463的位置的一个或多个位置处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，所述环状重排体在位置14处具有氨基酸取代，并且此类取代可以是芳族氨基酸，诸如trp或tyr。在这些或其它实施方案中，环状重排体在位置366处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为pro。在这些或其它实施方案中，环状重排体在位置420处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为glu。在这些或其他实施方案中，环状重排体在位置421处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为phe。在这些或其他实施方案中，环状重排体在位置424处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为asp。在这些或其他实施方案中，环状重排体在位置427处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选为glu。在这些或其它实施方案中，环状重排体在位置428处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为glu。在这些或其它实施方案中，环状异构体在位置432处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为tyr、his、trp、asp或glu。在一些实施方案中，所述酶在氨基酸424与427之间包含2-5个氨基酸的插入，诸如序列gly-pro-ser。在一些实施方案中，具有1-2'糖基化活性的ugt包含seqidno：9(mbugt1-2)的氨基酸序列，或与seqidno:9具有至少约50％同一性，至少约60％同一性，至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约85％同一性，或至少约90％同一性，或至少约95％同一性，或至少96％、97％、98％或99％同一性，并且在reba的c19或甜菊单苷的c13的一个或多个处具有1-2'糖基化活性的酶。在一些实施方案中，具有1-2’糖基化活性的ugt酶是osugt1-2的环状重排体，其中切割位点对应于osugt1-2的位置196。本文公开了命名为mbugt1、2-2(seqidno：45)的示例性环状重排体。所述环状重排体在野生型酶的位置16、422、430和434的一个或多个位置处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，所述环状重排体在位置16处具有氨基酸取代，且此种取代可以是芳族氨基酸，诸如trp。在这些或其它实施方案中，环状重排体在位置422处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为glu。在这些或其他实施方案中，环状重排体在位置430处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为glu。在这些或其他实施方案中，环状重排体在位置434处具有氨基酸取代，且取代的氨基酸任选地为his。在一些实施方案中，所述酶在天然n-末端与c-末端氨基酸之间不含任何连接序列，并且可任选地删除天然n末端met。在一些实施方案中，具有1-2’糖基化活性的ugt包含seqidno：45的氨基酸序列，或与seqidno:45具有至少约50％同一性，至少约60％同一性，至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约85％同一性，或至少约90％同一性，或至少约95％同一性，或至少96％、97％、98％或99％同一性，并且在reba的c19或甜菊单苷的c13的一个或多个处具有1-2’糖基化活性的酶。在一些实施方案中，具有1-3’糖基化活性的ugt酶是在rebd的c19或甜菊苷的c13处具有相同或增加的糖基化活性的srugt76g1或其衍生物。在一些实施方案中，具有1-3’糖基化活性的ugt酶是srugt76g1的衍生物，其在seqidno：3的位置77、78、81、82、93、94、155、192、200、202、205、283、284、379和397的一个或多个位置处包含氨基酸取代(参见表13)。在一些实施方案中，所述衍生物在位置l200(根据野生型酶编号的)具有氨基酸取代，并且其任选地为ala或gly。在这些实施方案中，所述衍生物还可在284位(例如，ala)和/或379(例如，gly)和/或192(例如，ala)处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置2处插入或取代ala，以降低细胞中的周转率。在一些实施方案中，ugt酶与seqidno:3具有至少约80％同一性，至少约85％同一性，至少约90％同一性，或至少约95％、96％、97％、98％或99％同一性，条件是对应于seqidno：3的位置200的氨基酸是ala或gly。如表13中所示，l200a或l200g的取代在c19和c13处均提供了活性的极大提高。对ugt76g1的另外的修改包括在位置22、25、145、154、256和282的一个或多个位置处的修饰，诸如q22g、q22h、i25f、i25w、t145a、t145g、t145p、h154r、l256p、l256w、l256t、l256g、l256a、l256r、l256e、s281g和s282n中的一种或多种修饰。这些修饰公开于wo2014/122227(其通过引用并入本文)中。在一些实施方案中，这些对ugt76g1的另外修饰与位置77、78、81、82、83、93、94、155、192、200、202、205、283、284、378、379和397处的修饰组合表现出出优异的性质。在一些实施方案中，具有1-3’糖基化活性的ugt酶是srugt76g1的环状重排体，其中切割位点对应于srugt76g1的氨基酸170至290(例如，190-210、196-200或260-280)。在一些实施方案中，切割位点对应于野生型酶的位置196或264。环状重排体(例如，mbugt1-3)相对于野生型序列的对应位置可具有1个至30个，或1个至20个，或1个至10个，或1个至5个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，具有1-3’糖基化活性的ugt包含seqidno：10(mbugt1-3)的氨基酸序列，或包含与seqidno:10具有至少约50％同一性，至少约60％同一性，至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约85％同一性，或至少约90％同一性，或至少约95％同一性，或至少96％、97％、98％或99％同一性，并且在rebd的c19或甜菊苷的c13的一个或多个处具有1-3’糖基化活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在位置2处取代或插入ala以降低细胞中的周转率。在各种实施方案中，本发明的宿主细胞或方法还涉及将甜菊醇转化成甜菊单苷的ugt酶。在一些实施方案中，将甜菊醇转化成甜菊单苷的ugt酶是srugt85c2或其衍生物。在一些实施方案中，相对于seqidno：1，该酶含有1个至约50个，或1个至约20个，或1个至约10个氨基酸取代、缺失和/或插入。例如，所述衍生物可与seqidno：1具有至少约65％同一性，或至少约70％同一性，或至少约80％同一性，或与seqidno:1具有至少90％同一性，或与seqidno:1具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性，同时保持用于将甜菊醇转化成甜菊糖醇(例如，在体外或体内)的相同或相似的活性。示例性氨基酸修饰示于表11中。在一些实施方案中，将甜菊醇转化成甜菊单苷的酶是在野生型酶的位置215处具有氨基酸取代的srugt85c2的衍生物。在一些实施方案中，对应于野生型酶的位置215的位置处的氨基酸是苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸(野生型氨基酸是脯氨酸)。在一些实施方案中，所述位置215处的氨基酸是苏氨酸。在这些或其它实施方案中，srugt85c2的衍生物在位置308、311、316、349和/或414(根据野生型酶编号的)的一个或多个处具有突变。在一些实施方案中，位置308处的氨基酸是苏氨酸，和/或位置311处的氨基酸是谷氨酰胺，和/或位置316处的氨基酸是丙氨酸，和/或位置349处氨基酸是谷氨酸，和/或位置414处的氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，在第二位置处插入或取代ala，以限制细胞中的周转率。在各种实施方案中，宿主细胞或方法还涉及将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的ugt酶，其在一些实施方案中为srugt74g1或其衍生物。在一些实施方案中，相对于seqidno：2，该酶含有1个至约50个，或1个至约20个，或1个至10个氨基酸取代、缺失和/或插入。例如，所述衍生物可与seqidno：2具有至少80％同一性，与seqidno：2具有至少90％同一性，或与seqidno：2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性，同时保持用于将甜菊双糖苷转化成甜菊苷(例如，在体外或体内)的相同或相似的活性。在一些实施方案中，将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的ugt酶是srugt74g1的环状重排体(例如，mbugtc19)。在一些实施方案中，所述环状重排体具有对应于srugt74g1的位置180至280位(例如，250至270)内的氨基酸的切割位点。环状基团可在原始n-末端与c-末端之间具有1至10个氨基酸的连接序列(例如，gsg)。相对于野生型序列的对应位置，所述环状重排体可具有1个至30个，或1个至20个，或1个至10个，或1个至5个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，srugt74g1环状重排体包含seqidno：8(mbugtc19)或seqidno：46(mbugtc19-2)的氨基酸序列，或包含与seqidno:8或46具有至少约50％同一性，至少约60％同一性，至少约70％同一性，至少约80％同一性，至少约85％同一性，或至少约90％同一性，或至少约95％同一性，或至少96％、97％、98％或99％同一性，并且具有将甜菊双糖苷转化成甜菊苷的活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞通过包含贝壳杉烯合酶(ks)、贝壳杉烯氧化酶(ko)和贝壳杉烯酸羟化酶(kah)的一种或多种途径模块产生甜菊醇底物，所述宿主细胞还包含细胞色素p450还原酶(cpr)用于再生ko和kah酶的一种或多种。在一些实施方案中，所述kah是甜叶菊、拟南芥、葡萄、蒺藜苜蓿(medicagotrunculata)的kah或其衍生物(例如，与野生型序列具有至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少97％序列同一性)。在一些实施方案中，所述kah是拟南芥kah(atkah)或其衍生物。所述atkah可以具有增加贝壳杉烯酸羟化酶活性的速率或以其它方式提高酶的生产率或表达的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，包括例如经工程化以在大肠杆菌中功能表达的n末端。在一些实施方案中，atkah在seqidno：29的亲本序列的一个或多个位置(例如，2至10个位置)处具有氨基酸取代，如表6中所示，所述氨基酸取代增加了甜菊醇或贝壳杉烯酸的产生。示例性取代包括对应于以下seqidno：29的位置的取代：25(例如，a25l)、79(例如，s79t)、119(例如，t119c)、137(例如，i137l)、142(例如，i142v)、155(例如，r155k)、180(例如，m180l)、193(例如，e193g)、196(e.g.c196a)、197(例如，d197e)、226(a226e)、235(例如，l235q)、238(例如，i238m)、245(f245l、f245v)、272(例如，l272i)、285(例如，i285r)、287(例如，c287s)、325(例如，c325i、c325m)、330(例如，f330l)、334(例如，d334e)、339(例如，s339t)、352(例如，s352e)、373(例如，e373d)、397(例如，i397f)、470(例如，v470l)、499(例如，q499v)、506(例如，l506m)、507(例如，l507i、l507t、l507v)。在一些实施方案中，atkah酶是在位置331处具有氨基酸取代(相对于野生型序列)的衍生物，其在一些实施方案中在较高温度(例如，高于22℃)下提高酶的生产率。在一些实施方案中，位置331处的氨基酸为ile。实现p450酶srko的功能性表达的n末端修饰在图9中进行了说明。可进行这些修饰或类似的修饰以实现kah包括atkah的功能性表达。例如，可删除跨膜区域的全部或部分，诸如从4个氨基酸至约39个氨基酸，或在一些实施方案中，从约6个氨基酸至约25个氨基酸，或约4个至约20个氨基酸，或约29个氨基酸，或约39个氨基酸。缺失优选取自跨膜区域的n末端部分。该部分用约4个至约20个氨基酸残基(诸如约4个至约12个残基(例如，8个氨基酸残基))的增溶标签替代。所述标签主要由疏水性氨基酸构成，其任选地选自ala、leu、ile、val和phe。用于功能性表达的示例性序列是n-末端标签：malllavf(seqidno：47)。在一些实施方案中，atkah具有14个氨基酸的截短，添加了n-末端标签(例如，seqidno：29)，任选地具有取代c331i(基于野生型酶的位置命名法)。用于p450酶的替代n-末端标签序列描述于2015年8月21日提交的临时申请第62/208,166号中，所述标签用于本发明的某些实施方案。例如，可从选自waaa、ypfn、yhcb、yhbm、yhhm、zipa、ycgg、djla、sohb、lpxk、f11o、mota、htpx、pgac、ygdd、hemr和ycls的大肠杆菌基因中衍生出跨膜结构域(或“n末端锚”)。这些基因通过生物信息学预测以及实验验证被鉴定为内膜、细胞质c末端蛋白。本发明可使用作为大肠杆菌野生型跨膜结构域的衍生物的n-末端锚定序列，即，相对于野生型序列具有一种或多种突变。在示例性实施方案中，膜锚定序列的长度为约8个至约75个氨基酸。例如，膜锚定物的长度可以为约15个至约50个，或约15个至约40个，或约15个至约30个，或约20个至约40个，或约20个至约30个氨基酸。在一些实施方案中，贝壳杉烯合酶(ks)来自甜叶菊、玉米(zeamays)、毛果杨(populustrichocarpa)、拟南芥、嗜气管欧文氏菌(erwinatracheiphila)或其衍生物(例如，与野生型序列具有至少80％，或至少90％，或至少95％或至少97％序列同一性)。另外，细胞可表达来自甜叶菊、棒状链霉菌(streptomycesclavuligerus)、日本慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、玉米、拟南芥、嗜气管欧文氏菌的柯巴基二磷酸合酶(cpps)或其衍生物(例如，与野生型序列具有至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少97％序列同一性)。在一些实施方案中，宿主细胞表达双功能cpps和ks酶，其可任选地选自扁桃拟茎点霉(phomopsisamygdali)、小立碗藓、藤仓赤霉菌(gibberellafujikuroi)的酶或其衍生物。此类衍生物通常可与亲本序列具有至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少96％、97％、98％或99％同一性(例如,参见表1)。在一些实施方案中，细胞表达嗜气管欧文氏菌cpps和ks酶或其衍生物。在一些实施方案中，宿主细胞表达来自甜叶菊(srko)、拟南芥、藤仓赤霉菌的贝壳杉烯氧经酶或其衍生物，所述贝壳杉烯氧经酶或其衍生物在n-末端任选被修饰以在大肠杆菌中表达(如上所述并如图9所示)。在一些实施方案中，cpr是甜叶菊(srcpr)、拟南芥或藤仓赤霉菌的酶或其衍生物，其任选地在n末端被修饰以在大肠杆菌中表达。srko可以具有一种或多种提高其活性的氨基酸修饰。在美国临时申请第62/040,284(其通过引用整体并入本文)中公开了示例性修饰。例如，srko可在以下位置(相对于seqidno：22)处包含一种或多种氨基酸修饰：位置47(例如，l47i))、59(例如，y59h)、60(例如，m60k)、63(例如，t63a)、67(例如，a67e)、76(例如，k76r)、80(例如，t80c)、82(例如，m82v)、85(例如，v85l、v85i)、86(例如，s86n)、100(例如，q100s)、106(例如，n106k)、112(例如，k112t)、116(a116r)、119(例如，t119s)、123(例如，m123t、m123q、m123f、m123t)、127(例如，d127g)、129(例如，y129f)、140(例如，a140r)、149(例如，k149r)、150(例如，h150f)、171(例如，n171d)、180(例如，l180f)、183(例如，i183v)、208(例如，d208e)、232(例如，d232e)、267(例如，s267a)、272(例如，h272q)、284(例如，s284c)、286(例如，i286l)、294(例如，q294k)、299(例如，q299e)、310(例如，i310t、i310v)、371(例如，r371k、r371i)、375(例如，v375t、v375i、v375l)、378(例如，i378v)、382(例如，h382y)、388(例如，v388q、v388m)、393(例如，h393d)、400(例如，l400i)、413(例如，v413k、v413d)、434(例如，f434l)、442(例如，g442a)、450(例如，s450a)、454(例如，l454m)、460(例如，g460a)、464(例如，m464l)、475(例如，m475g)、487(例如，t487n)、492(例如，p492k)和497(例如，i497l)。在一些实施方案中，srko含有n-末端跨膜结构域的约20个氨基酸的截短，并添加了n-末端标签序列(如上所述)。srko可在第二位置处含有ala以降低细胞中的酶周转率。在一些实施方案中，p450还原酶伴侣包括甜叶菊(sr)cpr、甜叶菊(sr)cpr1、拟南芥(at)cpr、东北红豆杉(taxuscuspidata)(tc)cpr、青蒿(artemisiaannua)(aa)cpr、拟南芥(at)cpr1、拟南芥(at)cpr2拟南芥(at)r2、甜叶菊(sr)cpr2、甜叶菊(sr)cpr3或香叶天竺葵(pelargoniumgraveolens)(pg)cpr。在一些实施方案中，可对这些p450中的任一种进行衍生，例如，以引入1个至约20个突变或约1个至约10个突变。在pct/us15/46369(其公开内容通过引用并入本文)中对这些cpr蛋白质进行了进一步描述。在一些实施方案中，宿主细胞是含有单种cpr酶(例如，srcpr)的大肠杆菌，其是染色体整合的，并且例如支持srko和atkah酶。在一些实施方案中，宿主细胞表达牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(ggpps)，其任选地是加拿大红豆杉(taxuscanadensis)、大冷杉(abiesgrandis)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、甜叶菊、藤仓赤霉菌、小家鼠(musmusculus)、假微型海链藻(thalassiosirapseudonana)、生黑孢链霉菌(streptomycesmelanosporofaciens)、棒状链霉菌(streptomycesclavuligerus)、嗜酸热硫化叶菌(sulfulubusacidocaldarius)、聚球藻属某种(synechococcussp.)(例如，ja-3-3ab)、拟南芥、海洋细菌443(marinebacterium443)、海云台副球菌(paracoccushaeundaensis)、绿硫细菌tls(chlorobiumtepidumtls)、集胞藻属某种(synechocystissp.)(pcc6803)、海栖热袍菌hb8(thermotogamaritimahb8)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、嗜热栖热菌hb27(thermusthermophillushb27)、热泉热棒菌jcm11548(pyrobaculumcalidifontisjcm11548)的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的或其衍生物。参见表1。此类衍生物通常可与亲本序列具有至少约60％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少96％、97％、98％或99％同一性(例如，参见表1)。在一些实施方案中，ggpps是加拿大红豆杉的ggpps或其衍生物。在一些实施方案中，红豆杉ggpps是n-末端截短的序列(例如，n-末端70至110个，诸如约98个氨基酸被截短)。截短的序列相对于对应野生型序列还可包含约1个至约10个，诸如约1个至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入。示例性截短的序列在本文中被公开为seqidno：12。在一些实施方案中，ggpps来自谷氨酸棒状杆菌或其衍生物，其可在高于22℃的温度下在生产率方面提供有利方面。在一些实施方案中，宿主细胞表达产生异戊基焦磷酸(ipp)和二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)的途径。在一些实施方案中，途径是甲基赤藓糖醇磷酸酯(mep)途径和/或甲羟戊酸(mva)途径。mep(2-c-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸)途径，也称为mep/doxp(2-c-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸/l-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸)途径或非甲羟戊酸途径或不依赖于甲羟戊酸的途径是指将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化成ipp和dmapp的途径。该途径通常涉及以下酶的作用：1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶(dxs)、1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(ispc)、4-二磷酸胞苷基-2-c-甲基-d-赤藓糖醇合酶(ispd)、4-二磷酸胞苷基-2-c-甲基-d-赤藓糖醇激酶(ispe)、2c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合成酶(ispf)、1-羟基-2-甲基-2-(e)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(ispg)和异戊烯基二磷酸异构酶(isph)。mep途径以及构成mep途径的基因和酶描述于us8,512,988(其通过引用整体并入本文)中。例如，构成mep途径的基因包括dxs、ispc、ispd、ispe、ispf、ispg、isph、idi和ispa。在一些实施方案中，至少部分地通过mep途径的代谢通量产生甜菊醇，并且其中所述宿主细胞具有dxs、ispd、ispf和/或idi基因的至少一个额外拷贝。如us8,512,988中所公开的，代谢物吲哚的水平可用作通过mep途径在大肠杆菌中高效产生萜类化合物产物的替代标志物。mva途径是指将乙酰辅酶a转化成ipp的生物合成途径。甲羟戊酸途径通常包括催化以下步骤的酶：(a)将两分子乙酰辅酶a缩合成乙酰乙酰辅酶a(例如，通过乙酰乙酰辅酶a硫解酶的作用)；(b)使乙酰乙酰辅酶a与乙酰辅酶a缩合以形成羟甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)(例如，通过hmg-coa合成酶(hmgs)的作用)；(c)将hmg-coa转化成甲羟戊酸(例如，通过hmg-coa还原酶(hmgr)的作用)；(d)将甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸(例如，通过甲羟戊酸激酶(mk)的作用)；(e)将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸(例如，通过磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)的作用)；和(f)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯基焦磷酸(例如，通过甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mpd)的作用)。mva途径以及构成mep途径的基因和酶描述于us7,667,017(其通过引用整体并入本文)中。宿主细胞可以是原核的或真核的。例如，宿主细胞可以是选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(bacillussubtillus)或恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)的细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)或耶氏酵母属(yarrowia)的种，包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)和解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)。宿主细胞可以是具有dxs、idi、ispd和ispf的复制或过表达，从而增加ipp和dmapp的产量的大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞是具有增加udp-葡萄糖的产生(例如，增加udp-葡萄糖底物的可用性)的一种或多种遗传修饰的大肠杆菌。为了提高udp-葡萄糖用于甜菊醇糖基化的可用性，可引入一系列基因敲除和基因插入，以增加至udp-葡萄糖的碳通量，并减少途径中远离udp-葡萄糖(例如，糖原合成和碳存储)的通量。例如，遗传修饰可以增加蔗糖进入细胞，并通过蔗糖磷酸化酶的活性将其分裂成果糖和葡萄糖。随后的一系列敲除可改变初级代谢，以便仅使用果糖作为碳源来促成生物质的合成，留下葡萄糖专门用于udp-葡萄糖生物合成。制定该策略的大肠杆菌菌株的示例性修饰列于表7中。在pct/ep2011/061891(其通过引用整体并入本文)中进一步描述了修饰。在一些实施方案中，一种或多种遗传修饰包括δgale、δgalt、δgalk、δgalm、δusha、δagp、δpgm、大肠杆菌galu的复制和枯草芽孢杆菌ugpa、basp的表达。在示例性实施方案中，宿主细胞是包含以下异源表达的基因的大肠杆菌：加拿大红豆杉ggpps或其衍生物、暗球腔菌属某种(phaeosphaeriasp.)的psck或其衍生物、甜叶菊ko或其衍生物、拟南芥kah或其衍生物，甜叶菊cpr或其衍生物(并且其为由宿主细胞表达的唯一cpr酶)、甜叶菊ugt85c2或其衍生物、甜叶菊ugt74g1或其衍生物、甜叶菊ugt76g1或其衍生物以及mbugt1-2或其衍生物。本文公开了这些酶的各种衍生物。在一些实施方案中，大肠杆菌含有kah-ko的多顺反子表达模块，并含有染色体整合的单拷贝srcpr(或衍生物)。在一些实施方案中，如上所述修饰大肠杆菌以增加udp-葡萄糖的可用性。在一些实施方案中，大肠杆菌具有dxs、idi、ispd和ispf基因的额外拷贝。在一些实施方案中，一种或多种表达的蛋白质在位置2处含有丙氨酸，以在体内提供额外的稳定性。在其它实施方案中，宿主细胞是包含以下异源表达基因的大肠杆菌：谷氨酸棒状杆菌ggpps或其衍生物；嗜气管欧文氏菌cpps和ks或其之一或两者的衍生物；甜叶菊ko或其衍生物；拟南芥kah或其衍生物；甜叶菊cpr或其衍生物；甜叶菊ugt85c2或mbugtc13或其衍生物；甜叶菊ugt74g1或其衍生物(或mbugtc19、mbugtc19-2或其衍生物)；甜叶菊ugt76g1或其衍生物(或mbugt1-3或其衍生物)；以及osugt1-2、srugt91d2或其衍生物，或mbugt1-2或mbugt1,1-2或其衍生物。本文公开了这些酶的各种衍生物。在一些实施方案中，大肠杆菌含有kah-ko的多顺反子表达模块，并含有染色体整合的单拷贝srcpr。在一些实施方案中，如上所述修饰大肠杆菌以增加udp-葡萄糖的可用性。在一些实施方案中，大肠杆菌具有dxs、idi、ispd和ispf基因中的一种或多种(或全部)的额外拷贝。在一些实施方案中，一种或多种表达的蛋白质在位置2含有丙氨酸，以在体内提供额外的稳定性。在一些实施方案中，大肠杆菌在高于约24℃的温度(诸如约27℃或更高，或约30℃或更高，或约32℃或更高，或约34℃或更高，或约37℃)下提供提高的rebm或rebd生产率。在一些实施方案中，所述方法还包括从培养基中回收所需的甜菊醇糖苷(例如，rebm或rebd)。在一些实施方案中，在培养基中以至少约10mg/l，或至少约100mg/l，或至少约200mg/l，或至少约500mg/l，或至少约1g/l，或至少约10g/l的浓度产生所需的甜菊醇糖苷(例如，rebm或rebd)。任选地，本发明的方法还包括从起始组合物中分离出目标甜菊醇糖苷。目标甜菊醇糖苷可通过任何合适的方法分离，诸如，例如结晶，通过膜的、离心、萃取的分离、色谱分离或此类方法的组合。可以混合含有不同糖苷级分的级分以制备定义的产物。或者，rebm和rebd例如可以从分离的培养物制备和纯化，并以预定比例混合。另一方面，本发明提供了用于在大肠杆菌中产生具有至少4个糖基化的甜菊醇糖苷的方法。根据本发明，大肠杆菌细胞包含多种ugt酶，其可包括本文所述的一种或多种酶，其一起进行至少4个，至少5个，或至少6个(包括7个或8个)顺序糖基化反应。如本文所公开的，糖基化底物和低级糖基化产物在大肠杆菌细胞中充分累积，以允许下游反应以可接受的速率进行，其中绝大部分糖基化产物最终在细胞外累积(最有可能通过膜转运蛋白的作用)。可从培养基组分中纯化出甜菊醇糖苷。因此，在一些实施方案中，所述方法包括从大肠杆菌细胞分离生长培养基，例如使用分批、连续或半连续生物反应器方法，并从生长培养基中分离所需的糖基化产物(例如，rebm)。在其它方面，本发明提供了在大肠杆菌中产生甜菊醇糖苷(包括rebd、rebm、rebe、rebi和其它糖基化产物)的方法。通常，所需的甜菊醇苷具有至少2个糖基化，诸如2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个糖基化。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷是rebm或rebd。虽然许多已知在宿主细胞中产生甜菊醇的酶是植物酶，其通常具有在20-24℃范围内的最佳温度，但是在较高的温度下，大肠杆菌生长速率和代谢是最佳的。本公开通过使酶在高于24℃的温度(诸如24℃至37℃，或27℃至37℃，或30℃至37℃)下获得提高的生产率，使得能够在大肠杆菌中以高产率产生甜菊醇糖苷。虽然大肠杆菌中的商业生物合成通常受到过表达的酶和/或外来酶在其下是稳定的的温度限制，但在一些实施方案中，本公开允许将培养物保持在较高温度，从而产生较高的产率和较高的总体生产率。在一些实施方案中，培养在约30℃或更高，或约31℃或更高，或约32℃或更高，或约33℃或更高，或约34℃或更高，或约35℃以上，或约36℃以上，或约37℃下进行。宿主细胞和方法还适用于甜菊醇糖苷的商业产生，即，细胞和方法可以以商业规模进行生产。在一些实施方案中，培养物的大小为至少约100l，至少约200l，至少约500l，至少约1,000l或至少约10,000l。在一个实施方案中，可以以分批培养、连续培养或半连续培养的方式进行培养。在一些方面，本发明提供了制备包含甜菊醇糖苷成分(其在一些实施方案中为rebm或rebd)的产品的方法。该方法包括培养本文所述的产生甜菊醇糖苷的菌株，回收甜菊醇糖苷，并将甜菊醇糖苷加入产品，诸如食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味剂或其它产品中。根据本发明制备的纯化的甜菊醇糖苷可用于多种产品，包括但不限于食品、饮料、结构剂(例如，淀粉、纤维、树胶、脂肪和脂肪模拟物，以及乳化剂)、药物组合物、烟草产品、营养组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。可用于与rebm组合使用的调味剂的非限制性实例包括石灰、柠檬、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦杏仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖和香草香料。其它食品成分的非限制性实例包括调味剂、酸化剂和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、组织形成剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。根据本发明获得的高度纯化的目标甜菊醇糖苷可作为高强度天然甜味剂掺入食品、饮料、药物组合物、化妆品、口香糖、桌面产品(tabletopproducts)、谷物、乳制品、牙膏和其它口腔组合物中等。根据本发明获得的高度纯化的目标甜菊醇糖苷可与各种生理活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常分为诸如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养制品、黄酮类化合物、异硫氰酸酯、酚类、植物甾醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元、益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素；和矿物质的种类。功能性成分也可基于它们的健康益处(诸如心血管、降胆固醇和抗炎)来进行分类。根据本发明获得的高度纯化的目标甜菊醇糖苷可以作为高强度甜味剂施用，以产生具有改善的味道特性的零卡路里、低热量或糖尿病饮料和食品。其也可用于饮料、食品、药品和其中不能使用糖的其它产品。另外，高度纯化的目标甜菊醇糖苷，特别是rebm可用作甜味剂，不仅可用于饮料、食品和其他专门用于人消费的产品，还可用于具有改善的特性的动物饲料和草料中。其中高度纯化的目标甜菊醇糖苷可用作甜味化合物的产品的实例包括但不限于酒精饮料诸如伏特加酒、葡萄酒、啤酒、酒和清酒等；天然果汁、提神饮料；碳酸软饮料；饮食饮料；零卡路里饮料；低热量饮料和食物；酸奶饮料；速溶果汁；速溶咖啡；粉状类型的速溶饮料；罐头产品；糖浆；发酵大豆酱；酱油；醋；敷料；蛋黄酱；番茄酱；咖喱；汤；即时肉汤；粉末酱油；粉末醋；饼干类型；米饼干；脆饼；面包；巧克力糖；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；保鲜水果和蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；花酱；奶粉；冰淇淋；冰糕；包装在瓶子里的蔬菜和水果；煮熟的豆类罐头；在甜酱中煮沸的肉和食物；农业蔬菜食品；海鲜；火腿；香肠；鱼肉火腿；鱼肉香肠；鱼酱；炸鱼制品；干海产品；冷冻食品；腌海藻；腌肉；烟草；药用产品等等。原则上其可以有无限的应用。在诸如食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品和口香糖等制品的制造中，可使用常规方法诸如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透，渗滤，喷淋、雾化、泡制以及其它方法。实施例甜菊醇糖苷是植物甜叶菊(通常称为甜菊)的天然成分。其味道特征谱相对于其它甜菊醇糖苷的味道特征谱显著改善的甜菊醇糖苷莱鲍迪苷m(rebm)(图1)是替代目前使用的甜菊醇糖苷诸如莱鲍迪苷a的理想候选物，但由于其在甜菊植物中的低水平(<0.01％)而未能实现该希望。甜菊醇是形成甜菊醇糖苷如rebm(1)的核心化学结构的二萜化合物。萜类化合物生物合成已在原核(例如，大肠杆菌)和真核(例如，酵母)细胞中被工程化，以用于异源产生复杂的萜类化合物分子(2,3)。与酵母mva途径相比，大肠杆菌mep途径在化学计量上更优并且有较少副产物积累(4,5)。已经描述了新型代谢工程方法，多变量模块代谢工程(mmme)和能够过量产生萜类化合物前体的平台大肠杆菌菌株(4,6)。mmme通过将代谢网络重新定义为不同模块的集合来促进调控和途径瓶颈的评估和消除(7)。通过将具有相似周转率的酶分成亚组或模块，并且随后通过调整浓度/活动来平衡不同亚组的周转率，可以最大化途径周转率对资源支出的比率。在大肠杆菌中应用mmme通路工程以用于贝壳杉烯的生物合成，所述贝壳杉烯为甜菊醇和甜菊醇糖苷的未官能化的萜烯主链前体。然后，将下游cyp450介导的氧化化学工程化以证明二萜化合物主链甜菊醇可在大肠杆菌中生物合成。另外，在大肠杆菌中将甜菊醇转化成甜菊醇糖苷的糖基化化学被设计来开发用于产生糖基化天然产物的技术平台。另外，大肠杆菌被工程化来产生提高的udp-葡萄糖水平以支持高水平的甜菊醇糖苷产生。这项工作从可再生资源为微生物系统中的rebm(和本文所述的其它甜菊醇糖苷)提供了经济的，商业上可行的来源。实施例1：甜菊醇和甜菊醇糖苷的生物合成甜菊醇糖苷是二萜化合物的衍生物，并且其早期生物合成途径与赤霉酸生物合成共享共同的中间体(8)。将总体上线性的途径模块化为四个部分：(1)从源自葡萄糖的中心碳代谢物中形成起始前体ipp和dmapp，(2)产生第一专用中间体贝壳杉烯；(3)关键中间体甜菊醇的生物合成；和(4)各种甜菊醇糖苷的形成。将另一个模块(5)独立地工程化以支持udp-葡萄糖(甜菊醇的糖基化所必需的第二底物)的增加的产生。五个模块示于图2中。在植物中，常见的类异戊二烯前体ipp和dmapp的形成可从两个生物合成途径：甲羟戊酸(mva)途径或甲基赤藓糖醇-磷酸(mep)途径(9)获得。甜菊醇二萜化合物生物合成的第一步是将ipp和dmapp转化成牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(ggpp)。ggpp是所有二萜化合物分子的四亚基前体。然后，通过cpp合酶(cpps)催化ggpp至柯巴基二磷酸(cpp)的质子化引发的环化。随后通过由贝壳杉烯合酶(ks)催化的电离依赖性环化从cpp产生贝壳杉烯。已从甜叶菊的天然生物合成途径中鉴定和表征了这些酶。除此之外，还有就ggpp转化为贝壳杉烯而言从基础植物(basalplant)(小立碗藓)和真菌物种(例如，藤仓赤霉菌和暗球腔菌属某种)表征的双功能酶(10,11)。然后，通过贝壳杉烯氧化酶(ko)(一种p450单加氧酶)在三步反应中将贝壳杉烯氧化成贝壳杉烯酸。在酵母中表达全长kocdna，并证明其可以将贝壳杉烯转化成贝壳杉烯酸(12)。所述途径中的下一步是通过贝壳杉烯酸13-羟化酶(kah)对贝壳杉烯酸的羟基化。将kah(一种细胞色素p450)在酵母中表达，并将贝壳杉烯酸转化成甜菊醇(13)。通过利用组装的核心甜菊醇分子，一系列的六个糖基化将6个葡萄糖部分附接至甜菊核心。负责这些活性的糖基转移酶酶(ec2.4.1.17)催化了udp-葡萄糖的葡萄糖组分转移至疏水性小分子，在该情况下是甜菊醇分子(14)。o-糖基化在甜菊醇的c13和c19位置处发生(图1)，随后在这两种o-葡糖基上进行1-2’糖基化和1-3’糖基化，总共导致6次糖基化。糖基化的顺序可能相当复杂，其中各种中间产物在c13或c19糖基化以及1-2’或1-3’糖基化的顺序上形成给定的变化(图3)。鉴于中间产物汇集物在甜叶菊中积累，产生rebm的潜在途径是甜菊醇>甜菊单苷>甜菊双糖苷>甜菊苷>莱鲍迪苷a>莱鲍迪苷d>莱鲍迪苷m。然而，这并不排除微生物生物合成系统中的替代途径(图3)。对甜菊醇糖苷的生物化学途径的详细了解和表征以及通过异源生物合成途径工程化对上游类异戊二烯途径工程化以对ipp和dmapp重定路线的进展，为在方便的基于微生物的生物过程中定向、可持续地产生经纯化的和高品质甜菊醇糖苷提供基础。目前基于植物的产生和纯化方案对降低成本提出了重大挑战。本文所述的使用在微生物宿主中重建的植物途径的微生物途径为改进现有工艺和产生在自然界中具有极低丰度的优质甜菊醇糖苷提供了优良机会。(a)工程化大肠杆菌中的贝壳杉烯生物合成贝壳杉烯是甜菊醇和植物生长激素赤霉酸的环状二萜化合物前体。贝壳杉烯的生物合成由从通用萜类化合物前体ipp和dmapp开始的三个步骤组成。从ipp和dmapp开始的三步反应由酶gpps、cps和ks或双功能cpps/ks酶催化。直至贝壳杉烯的总体途径被分为两个模块(图2)。已有来自不同生物体的几种酶，其特征在于将ipp和dmapp转化成ggpp(15-18)和将ggpp转化成贝壳杉烯(9-12，18)和将贝壳杉烯转化成甜菊醇(12，19-24)(表1)。在高等植物(诸如甜叶菊)中，ggpp至贝壳杉烯的生物合成是作为由称为柯巴基焦磷酸合酶(cpps)和贝壳杉烯合酶(ks)的酶介导的两步反应进行的。在基础植物(小立碗藓)和真菌(例如，藤仓赤霉菌和暗球腔菌属某种)物种中，通过在这些生物体中表征的双功能酶进行ggpp至贝壳杉烯的生物合成。类似地，存在被克隆并被表征为转化ipp和dmapp以产生ggpp的多种酶。因此，朝向工程化贝壳杉烯生物合成的第一步是酶的选择。选择来自不同物种的酶以测试贝壳杉烯的生物合成(表1)。关于紫杉二烯生物合成的mmme优化的研究表明，tcgpps的动力学能够支持～1g/l的紫杉二烯且从而其它二萜化合物的产生。为了鉴定最佳的贝壳杉烯合酶直向同源物，选择tcgpps作为上游候选酶。然后选择操作子，其含有ks-cps-ggpps(kcg)或双功能psck-ggpps(ckg)以测试上游途径工程化的菌株中的途径。为了调节下游贝壳杉烯途径的表达，将ks-cpps-ggpps(kcg)和ck-ggpps(ckg)操纵子克隆至具有不同拷贝数和启动子强度的质粒系统(p5trc、p10trc、p20trc和p5t7)。另外，将每个贝壳杉烯操纵子的一个拷贝在与不同的上游途径表达水平联合的不同的启动子强度下整合至大肠杆菌染色体中。选择具有不同上游和下游表达的菌株以调节途径并测试各种组合的产生率。将这些菌株进行小规模(2ml)hungate管发酵，以表征表型特征和贝壳杉烯产生率。如图4所示，观察到贝壳杉烯的复杂的非线性积累。有趣的是，来自植物物种的ks(srcpps、srks和ppck)显示出类似的特征谱(图4a，b)，而用真菌酶(gfck和psck)构建的途径显示出非常相似的产物积累模式(图4c，d)。有趣的是，与植物酶途径相比，整合真菌酶的途径的低拷贝表达显示相对高的产生率。产物滴度(～140mg/l)的全局最大值来自只具有植物酶的构建体(图4a，利用甜叶菊基因(上游在trc启动子之下且下游在质粒p20trc中)构建的菌株)。然而，完全染色体整合的真菌途径酶(psck)(图4d，具有上游trc和下游t7-psckg的菌株)产生～100mg/l的贝壳杉烯。比较这两种菌株的下游组分的表达，与相同上游途径ch1trcmep强度下的p20trcsrkcg(35a.u.)相比，ch1t7psckg途径少23倍(1.5a.u.)(4)。多步/多模块通道的关键性能驱动者是通量的最佳平衡。此处在用ch1trcmep和ch1t7psckg构建的菌株中，由于非常低的下游表达，我们实现了高达100mg/l的贝壳杉烯产量。这表明psck酶可以在平衡的途径表达下支持高通量。另外，本研究还提供了有关不同途径平衡下的二萜化合物产物特征谱的复杂非线性行为的见解(图5和图6，表2)。关于不同通量调节下的途径的产物选择性的此类复杂行为清楚地表明了多变量模块途径优化的能力。在最佳平衡条件下，菌株可在产物特征谱中显示高选择性(图6d，菌株47)。另外，多变量模块搜索允许选择最佳变体贝壳杉烯酶(psck)，以进一步工程化高产菌株。当将该最佳菌株(即，菌株47)在生物反应器系统中生长时，我们能够在基本培养基或工艺改进的情况下产生能够产生1.6g/l贝壳杉烯的菌株(图7)。mmme还提供了对途径的进一步优化的见解，并帮助使用类似方法鉴定ggpps酶的最佳变体(表1)。此外，如在对产紫杉二烯菌株的途径工程中观察到的，贝壳杉烯产生也与抑制性分子吲哚的产生呈负相关(图8)。(b)在大肠杆菌中工程化甜菊醇生物合成甜菊醇的生物合成涉及由细胞色素p450酶介导的两个关键氧化反应(图3)。p450是参与成千上万种天然产物的代谢途径的重要氧化酶(25)。直到最近，科学界认为，当与天然真核宿主(例如植物或酵母)相比时，细菌宿主诸如大肠杆菌不是用于进行该重要天然产物化学的理想系统。然而，在大肠杆菌中优化紫杉醇生物化学的同时，出现了对负责p450酶的生物化学的机械结构-功能关系的理解，这与它们在大肠杆菌中的应用相关。n末端膜区的优化工程以及cyp450和辅因子p450还原酶(cpr)的最佳组合的构建是功能表达的关键。开发了用于功能性表达cyp450酶和体内氧化复杂天然萜类化合物天然产物诸如紫杉二烯、瓦伦烯、柠檬烯或贝壳杉烯的几种酶/途径优化技术。甜菊醇生物合成由两种不同的cyp450酶(贝壳杉烯氧化酶(ko)和贝壳杉烯酸羟化酶(kah))与cyp450还原酶(cpr)一起介导。鉴定几种候选基因/酶，并将其注释为用于甜菊醇生物合成中的氧化和羟基化反应的p450酶(表1)。用于羧化和羟基化的酶ko和kah的功能性表达需要蛋白质重新设计和工程化。我们开始重新设计和克隆srko酶，以改善大在肠杆菌中的功能性表达。在彻底的生物信息学分析之后，构建了几种n末端截短和修饰的ko酶(图9a)。产生了将srko和辅因子细胞色素p450还原酶酶(srcpr)作为融合蛋白(“接头”构建体)或作为多顺反子模块(“操纵子”构建体)(图9b)整合在pet45d表达载体中的构建体。使用sds-page分析评估在大肠杆菌中的这些构建体中的蛋白质的产生和相对溶解度(图9c)。然后将这些构建体转移到我们的生产载体p5trc中以测试该途径的体内功能活性。将这些构建体转化入产生贝壳杉烯的菌株3、9和11(表2)中以测试贝壳杉烯至贝壳杉烯酸的转化(表3)。设计的嵌合酶具有功能活性，但酶的不完全反应性导致了贝壳杉烯醇和贝壳杉烯醛的产生。在所有各种n-末端截短的ko构建体中，与4个和20个氨基酸截短的构建体相比，ko的39aa截短更具有功能活性。另外，表达为操纵子的srko和srcpr显示出与从srko和srcpr构建的融合酶相似的活性。在此初步工作之后，我们进一步将srko酶优化作为三基因kah-ko-cpr模块的一部分，见下文，并且在该构建体中，最佳srko构建体具有从n末端截短的20个氨基酸残基，从而导致贝壳杉烯完全转化为贝壳杉烯酸(见下文)。在上述srko菌株的初步筛选中，发现用于随后转化为贝壳杉烯酸的底物汇集物的可用性是重要的。当高底物(贝壳杉烯)汇集物是可获得(菌株9)时，氧化途径将贝壳杉烯转化成～60mg/l的氧合贝壳杉烯化合物。关于拟南芥ko酶的酶促活性的以前的体外研究证明该酶产生贝壳杉烯的醇、二醇和醛衍生物(12)。对于紫杉醇p450酶观察到类似的产物多样性，然而，在该工作中，整个途径的重新平衡改变了产物特征谱，并只产生了羟基化紫杉烷。因此，开始菌株工程化研究以重新平衡kop450模块和上游模块。为了重新平衡模块，将ko途径转移至高贝壳杉烯产生性染色体整合的菌株(菌株47)中，并测试ko途径的活性和产生率(图10)。还设计、合成和测试了来自不同生物体的直向同源ko酶(表1)，以鉴定最佳变体酶。与贝壳杉烯途径一样，进行多变量途径优化，以在不同的通量平衡下鉴定最佳变体酶及它们的非线性产物特征谱和产物分布(图11)。随后通过在野生型背景中设计和测试点突变体的集合来提高srko活性(表4)。在成功地产生贝壳杉烯酸后，将生物合成途径中的最终酶促步骤(通过酶kah对贝壳杉烯酸的c13碳处的羟基化，得到甜菊醇)纳入并进行测试(图1和图2)。关于srko和srcpr的多顺反子表达的研究证明，此类酶可表达为独立组分并保持功能活性。确定ko和kah两者是否可对单个srcpr酶具有功能活性。为了限制质粒的数量并平衡ko和kah的表达，将单拷贝srcpr染色体整合至贝壳杉烯工程化的菌株中。将ko和kah构建为p5trc质粒下的多顺反子表达。在发酵四天并用乙酸乙酯萃取后，在所有菌株的gc-ms分析中检测到可检测水平的甜菊醇(表5)。在获得该有希望的初步结果后，通过体内表达具有cpr辅因子酶的多顺反子操纵子中的ko和kah候选物两者的不同工程化形式，鉴定在大肠杆菌中组装成生物合成途径的最佳酶(图12)。atkah酶因点突变的运动获得进一步增强。使用合理的方法来设计atkah序列中的单点突变的集合，目的在于提高野生型酶的稳定性、溶解度或活性，以提高贝壳杉烯转化为甜菊醇。点突变和相对于野生型atkah的提高的相应倍数变化概述于表6中，并且在图13中显示。然后将这些点突变中的一些重组在atkah酶中，并且鉴定出能够将贝壳杉烯酸完全转化成甜菊醇的重组酶(图14)。当在具有最佳srko和srcpr的操纵子中表达时，证明了贝壳杉烯完全转化为甜菊醇(图15)，这进一步突出了小心平衡途径组分的重要性。(c)在大肠杆菌中工程化小分子糖基化为了支持将甜菊醇多糖基化为莱鲍迪苷m和所有中间甜菊醇糖苷，将一系列修饰引入背景大肠杆菌菌株，旨在增加可用的udp-葡萄糖的量。进行了一系列基因敲除和基因插入，目的在于增加至udp-葡萄糖的碳通量，并且减少不符合小分子糖基化的远离udp-葡萄糖的途径(即，糖原合成和碳储存)中的通量。该设计使得能够经由蔗糖磷酸化酶的活性将蔗糖输入细胞并将其分解成果糖和葡萄糖。随后的一系列敲除已改变了初级代谢，以便仅使用果糖作为碳源来促进生物质的合成，当使用蔗糖作为碳源来生长细胞时，留下葡萄糖专门用于udp-葡萄糖生物合成。然而，当在甘油或葡萄糖(作为碳源)上生长时，细胞仍然能够生长和提高udp-葡萄糖的可用性。应用于大肠杆菌菌株以制定该策略的具体修饰列于表7中。测试这些修饰以确定它们是否能够增强小分子的糖基化，并证实它们确实通过显示增强的工程化菌株对咖啡酸(在培养基中补充的)的体内糖基化来增强小分子的糖基化(图16)。在已构建了甜菊醇核心分子后，使用四种ugt(每种ugt能够具有不同的糖基化学物质(表8和9))的组合，用udp-葡萄糖糖基化核心。这些化学物质包括(1)甜菊醇的c13处的o-糖基化，(2)甜菊醇的c19处的o-糖基化，(3)c13或c19o-葡萄糖处的1-2’-糖基化，和(4)c13或c19o-葡萄糖处的1-3’-糖基化(关于掺入所有上述化学物质的实例，参见图1)。一旦c13和/或c19氧中的一个或两个被糖基化，则可经由1-2’或1-3’加成将另外的糖基化添加到o-葡萄糖中。如下所述，这些ugt已通过其结构域的改组获得根本性修饰，并通过点突变得以进一步增强，所述点突变目的在于增加通向rebm的期望的最终产物的通量。应用mmme方法以在所有可能的组合中快速组合四种ugt，并在产生甜菊醇的菌株背景中体内筛选所得的构建体(图17)。将以最佳多顺反子构型组装的改进的ugt在单个大肠杆菌菌株中与4个其它模块组合。我们培养菌株并证明在体内产生甜菊醇糖苷，从而产生莱鲍迪苷m(图18)。该菌株能够产生5.7mg/l的总甜菊醇糖苷，其包括100μg/l的rebm。通过产生所有可能的构建体并在各种启动子强度下在质粒中表达它们或整合至染色体中，获得了具有范围从1:1直至0:1(无rebd剩余)的rebd:rebm比率的甜菊醇糖苷产物谱。据我们所知，这是第一次将两种细胞色素p450单加氧酶在大肠杆菌中功能性表达，以用于产生双功能氧合萜类化合物分子诸如甜菊醇。另外，单一的cpr酶用作两种p450酶(ko和kah)的辅因子，以将贝壳杉烯转化成甜菊醇。这是在大肠杆菌系统中进行的p450介导的氧化化学的另一重大飞跃。此外，据我们所知，这是第一次将四种ugt组合在单个大肠杆菌菌株中，并证明能够进行萜类化合物核心分子的六个顺序糖基化以产生莱鲍迪苷m，更不用说中间体甜菊醇糖苷。这是ugt工程的重大跨越，并建立了可持续产生稀有甜菊醇糖苷的平台。实施例2：糖基转移酶酶的环状重排体的构建作用于酶的天然选择倾向于选择足够的生物功能稳定性和活性。该过程将酶转移至特定的进化路径下，这可使其不易与工业应用所需的稳定性和活性增益相容。作为实例，专门针对特定底物的酶相较于非专门化的酶在新底物的工程化方面倾向于更具挑战性。因此，通过交换结构域连接来‘摇匀’酶可能产生这样的酶，所述酶具有相同蛋白质折叠，但具有新型的折叠和折叠相互作用，这将使其新近适于选择和进化。换句话说，我们可能能够简单地通过改组序列，将酶从其原始进化路径移开而不引入任何氨基酸突变，来将蛋白质折叠‘跳跃’至进化空间中的另一点。ugt(udp-葡萄糖糖基转移酶)具有两个结构域，即更可变的n末端底物结合(糖受体)结构域和更保守的c末端udp-葡萄糖结合(糖供体)结构域。n末端结构域主要是酶底物特异性的决定因子，但一些特异性由c末端结构域控制。这些结构域中的每一个构成蛋白质的大约一半。鉴于该两结构域结构，我们假设将蛋白质切割成两半以产生新的n-和c-末端并将原始物连接在一起(例如，环状‘排列’)可‘改组’酶，并为工程改善的活性产生新的机会(因为所得的酶将不是选择压的结果)。作为一般程序的描述，设计改组的酶涉及以下步骤：(i)建立具有所需糖基化活性的已知ugt的同源性模型(图19)；(ii)使用同源性模型，估计n-末端与c-末端残基之间的距离；(iii)设计各种长度的接头以连接现有的n末端和c末端；(iv)选择酶中的位置以成为新的n末端和c末端；(v)合成所得的序列；(vi)在体内和体外表达并鉴定保留亲本活性的任何改组的酶；(vii)经由合理的工程化修改设计，通过改组的酶的新同源性模型通知；和(viii)重复步骤vii，直至达到所需的活性提高。当产生接头(步骤iii)时，鉴定最接近末端的n-末端和c-末端残基，但基于同源性模型中的结构预测其与蛋白质的其余部分直接相互作用(图20)。当选择新的n-末端和c-末端的切割位点(步骤iv)(图21)时，选择二级结构元件之间的环区域，所述环区域维持结构域结构，尽可能接近序列的中间，并且暴露于溶剂以及远离活性部位。设计、合成以及整合c13、c19、1-2’和1-3’糖基化活性(亲本酶分别为srugt85c2、srugt74g1、osugt1-2(q0dpb7_orysj)(28)和srugt76g1)的每一种的环状重排体。所有四种活动均导致了工作环状重排体。作为实例，表示第一轮环状重排体工程化的数据导致新型酶mbugt1-2，其显示与亲本酶osugt1-2等同的活性(图22)。对改组的酶的随后轮的细化已产生了与原始亲本序列相比具有增强的活性的酶，证明了该改组方法产生改进的酶的潜力(图23)。这些细化集中在对形成改组的酶的新的n和c末端的位置和特定残基的更精细等级的修饰，以及细化连接亲本n和c末端的接头的长度和氨基酸序列。对mbugt1-2酶的一系列点突变已导致对该新型序列的进一步改进(图24和25)，证实该方法已通过改组酶序列产生了进行显著改进的机会。然而，当在亲本osugt1-2背景中测试这些在mbugt1-2中赋予提高的活性的点突变时，发现它们对于活性是中性的或不利的(图26)。新型酶与亲本序列之间点突变的可转移性的缺乏证实了环状重排体是产生ugt酶改进的机会的有价值的一般方法。实施例3：不同糖基转移酶的嵌合融合物与通过环状重排体产生的酶的改组类似，通过交换已知ugt之间的n-末端小分子糖受体结合结构域或c-末端糖供体结合结构域，产生了改组糖基转移酶酶的替代方法。例如，产生了由srugt85c2的n末端结构域和srugt76g1的c-末端结构域组成的嵌合酶(图27)。这种方法背后的理由依赖于改组ugt酶的结构域的概念，只有这一次，我们在ugt之间增加改组结构域的细微差别。其意图是产生具有新型序列的非优化酶，其能够进一步远离由亲本酶占据的能量形貌中的点，并且朝向生产性菌株中的新的最佳酶构型。再次地，鉴于该酶本身不是天然选择的结果，由该嵌合方法产生的改组的酶应该具有增加的进化潜力/更大的从点突变积极获益(即，具有增加的活性)的潜力。此外，该方法可用于产生具有增强的折叠和/或稳定性的嵌合蛋白。简言之，这种方法采用四个广泛的步骤：(1)鉴定两个候选ugt；(2)选择用于在两个ugt之间形成嵌合体的交叉位置(即，选择连接两个序列的点)；(3)基于结构考虑，突变c末端结构域(核苷酸-碳水化合物结合结构域，例如udp-葡萄糖结合结构域)以增强与小分子底物或n-末端小分子结合结构域的相互作用；(4)产生嵌合构建体并测试其活性。这种方法是可概括的，且适用于增强潜在地任何ugt的功能性能。给定ugt的保守结构域结构，可以重组来自任何两个ugt的结构域。实施例4：修饰糖基转移酶酶以用于提高稀有糖苷的活性和生物合成尽管只有约20种甜菊醇糖苷以已被从甜叶菊植物中表征出来的足够量存在，但还有几种更可能的可生物合成产生的具有不同糖基化模式的甜菊醇糖苷。表10和图29、30、31和32概括了本节中描述的已知和潜在的甜菊醇糖苷，其缩写为符号sg#。这些糖苷中的一些天然存在，并且其它糖苷使用催化本文所述的四种糖基化化学(即，c13-o-糖基化、c19-o-糖基化、1,2'-糖基化和1,3'糖基化)的ugt来生物合成是可能的。使用合理的设计方法在srugt85c2序列(具有c13-o-糖基化活性)中设计单点、双重和三重点突变的集合，目的在于提高野生型酶的稳定性、溶解度或活性，以提高甜菊醇至甜菊单苷(sg1)，和/或c19-吡喃葡糖基甜菊醇(sg2)至甜茶苷(sg5)，和/或sg4至sg10，和/或sg7至sg11，和/或sg13至sg17，和/或sg19至sg29，和/或sg23至sg31的转化。表11中概括了点突变及相对于野生型srugt85c2提高的相应倍数变化，并在图32和33中显示。使用合理的设计方法在srugt74g1序列(具有c19-o-糖基化活性)中设计单点、双重和三重点突变的集合，目的在于提高野生型酶的稳定性、溶解度或活性，以提高甜菊醇至c19-吡喃葡糖基甜菊醇(sg2)，和/或甜菊单苷(sg1)至甜茶苷(sg5)，和/或甜菊双糖苷(sg3)至甜菊苷(sg8)，和/或sg6至莱鲍迪苷g(sg9)，和/或莱鲍迪苷b(sg12)至莱鲍迪苷a(sg16)，和/或sg18至sg28，和/或sg22至sg30的转化。使用合理的设计方法在mbugt1-2序列(具有1-2'糖基化活性)中设计单点、双重和三重点突变的集合，目的在于提高野生型酶的稳定性、溶解度或活性，以提高甜菊单苷(sg1)至甜菊双糖苷(sg3)，和/或c19-吡喃葡糖基甜菊醇(sg2)至sg4，和/或甜茶苷(sg5)至甜菊苷(sg8)，和/或甜茶苷(sg5)至sg10，和/或甜茶苷(sg5)至莱鲍迪苷e(sg14)，和/或sg6至莱鲍迪苷b(sg12)，和/或sg7至sg13，和/或和/或甜菊苷(sg8)至莱鲍迪苷e(sg14)，和/或sg10至莱鲍迪苷e(sg14)，和/或莱鲍迪苷g(sg9)至莱鲍迪苷a(sg16)，和/或莱鲍迪苷g(sg9)至sg21，和/或sg11至sg17，和/或sg11至sg20，和/或莱鲍迪苷b(sg12)至sg22，和/或sg13至sg23，和/或sg15至莱鲍迪苷i(sg26)，和/或sg15至sg27，和/或莱鲍迪苷a(sg16)至莱鲍迪苷d(sg24)，和/或莱鲍迪苷a(sg16)至sg30，和/或sg17至sg25，和/或sg17至sg31，和/或sg20至sg25，和/或sg21至莱鲍迪苷d(sg24)，和/或莱鲍迪苷d(sg24)至sg37，和/或sg25至sg39，和/或莱鲍迪苷i(sg26)至莱鲍迪苷m(sg32)，和/或莱鲍迪苷i(sg26)至sg38，和/或sg27至莱鲍迪苷m(sg32)，和/或sg27至sg40，和/或sg28至sg33，和/或sg29至sg35，和/或sg30至sg37，和/或sg31至sg39，和/或莱鲍迪苷m(sg32)至sg43，和/或莱鲍迪苷m(sg32)至sg44，和/或sg34至sg41，和/或sg36至sg42，和/或sg38至sg43，和/或sg40至sg44，和/或sg41至sg47，和/或sg42至sg48，和/或sg43至sg46，和/或sg44至sg46的转化。表12总结了相对于野生型mbugt1-2的点突变和相应的倍数变化改进，并且代表性反应示于图24和图25。使用合理的设计方法在srugt76g1序列(具有1-3'糖基化活性)中设计单点、双重、三重或四重点突变的集合，目的在于提高野生型酶的稳定性、溶解度或活性，以提高甜菊单苷(sg1)至sg6，和/或c19-吡喃葡糖基甜菊醇(sg2)至sg7，和/或甜菊双糖苷(sg3)至莱鲍迪苷b(sg12)，和/或sg4至sg13，和/或甜茶苷(sg5)至莱鲍迪苷g(sg9)，和/或甜茶苷(sg5)至sg11，和/或或甜茶苷(sg5)至sg15，和/或甜菊苷(sg8)至莱鲍迪苷a(sg16)，和/或甜菊苷(sg8)至sg20，和/或莱鲍迪苷g(sg9)至sg15，和/或sg10至sg17，和/或sg10至sg21，和/或sg11至sg15，和/或莱鲍迪苷b(sg12)至sg18，和/或sg13至sg19，和/或莱鲍迪苷e(sg14)至莱鲍迪苷d(sg24)，和/或莱鲍迪苷e(sg14)至sg25，和/或莱鲍迪苷e(sg14)至莱鲍迪苷m(sg32)，和/或莱鲍迪苷a(sg16)至莱鲍迪苷i(sg26)，和/或莱鲍迪苷a(sg16)至sg28，和/或sg17至sg27，和/或sg17至sg29，和/或sg20至莱鲍迪苷i(sg26)，和/或sg21至sg27，和/或莱鲍迪苷d(sg24)至莱鲍迪苷m(sg32)，和/或莱鲍迪苷d(sg24)至sg33，和/或sg25至莱鲍迪苷m(sg32)，和/或sg25至sg35，和/或莱鲍迪苷i(sg26)至sg34，和/或sg27至sg36，和/或sg28至sg34，和/或sg29至sg36，和/或sg30至sg38，和/或sg31至sg40，和/或莱鲍迪苷m(sg32)至sg41，和/或莱鲍迪苷m(sg32)至sg42，和/或sg33至sg41，和/或sg35至sg42，和/或sg37至sg43，和/或sg39至sg44，和/或sg41至sg45，和/或sg42至sg45，和/或sg43至sg48，和/或sg44至sg47的转化。点突变和相对于野生型srugt76g1的提高的相应倍数变化概括于表13中，且代表性反应示于图35和36中。实施例5：在高于22℃下提高产率和性能在高于22℃的温度下，酶在贝壳杉烯模块中的性能被测定为是次优的。鉴定先前的实施例中使用的ggpps(牻牛儿基牻牛儿基二磷酸)合酶酶和双功能柯巴基二磷酸(cpp)/贝壳杉烯合酶酶的一组替代酶。特别地，考虑了来自细菌来源的替代酶，推测这些酶在大肠杆菌中比植物和真菌酶更好地起作用。在可能的情况下考虑嗜热细菌的酶。对于cpp合酶和贝壳杉烯合酶活性，鉴定了根际中的细菌的基因，因为它们通常因它们的共生生活方式而为产贝壳杉烯的。图39显示替代ggpps酶的结果。几种酶在较高温度下显示出提高的性能，包括海洋细菌443、聚球藻属某种、海栖热袍菌、谷氨酸棒杆菌和热泉热棒菌。图40显示替代性cpps和ks酶的结果。嗜气管欧文氏菌(et)cpps和etks在较高的温度下显示出提高的活性。在22℃下在选择的菌株中测试各种甜菊醇糖苷(包括rebm)的产生。该菌株是具有含有fab46-mep、t7-pscks-anggpps、t7-atkah-srko-srcpr、t7-mbugt1,3-mbugt1,2-mbugtc13-mbugtc19的pbac单拷贝染色体的大肠杆菌k12。如图41中所示，rebm滴度为55.5mg/l，总甜菊醇糖苷滴定度为58.3mg/l，相当于94.4％rebm。rebm:rebd比率为64.5:1(按克计)。统计量滴度，总甜菊醇糖苷(mg/l)58.3mg/l滴度，莱鲍迪苷m(mg/l)55.5mg/l(总糖苷中的)rebm％94.4％rebm:rebd(g/g)64.5:1研究了甜菊醇糖苷的细胞内积累。如图42中所示，从细胞中分泌出大部分甜菊醇糖苷。图42以在细胞内对比细胞外积累的产物的百分比显示组合的细胞内和细胞外物质。这与具有显著较少的甜菊醇糖苷的产率的初步研究相反，所述初始研究主要看到细胞内积累。有可能最初的研究具有如此低的滴度，以使得积累的产物汇集物不足以将产物泵出细胞所需的主动运输机制。实际上，随着滴度增加，积累在细胞外的产物的比例越来越大，这表明一旦高于假定的泵活动的阈值浓度，剩下的产物就会被移出。从大肠杆菌的菌株工程化视角和商业生产来看，这些数据是非常有希望，因为如果中间产物汇集物保持低于转运蛋白的kb，那么我们可以有效地将c-通量推至终产物，而不会向外部流失碳(例如，一旦将甜菊醇糖苷中间体泵出，其就不能再进一步被糖化成所需产物，诸如rebm)。生成ugt85c2的点突变体，并在22℃、30℃和34℃下进行测试。图43a、b显示在34℃下的甜菊单苷产量。图43c显示在22℃、30℃和34℃下利用选择的突变体的甜菊单苷的产量。几种突变在34℃下显示较高的甜菊糖苷产量，其中p215t是最高产生的突变。还在30℃和34℃下测试了74g1的环状重排体的活性。图44a、b显示甜菊醇至13c-c19-glu-甜菊醇(图44a)和甜菊双糖苷至13c甜菊苷(图44b)的转化。在22℃、26℃和30℃下筛选atkah中的突变的活性。c331i提供了显著的热稳定性，如图45中所示。在t14背景中制备了c331i。产生mbugt1,2合理重组，并在30℃和34℃下筛选其的reba至rebd(图46a)，以及甜菊单苷至13c甜菊双糖苷(图46b)的转化。这些研究导致经截短以在残基196处产生新的n末端，在s16w、h422e、r430e、r434h(mbugt1,2-2)处引入突变的环状重排体。在这些研究中，在所列温度下诱导产生这些酶的细胞的蛋白质产生4小时，对其进行萃取并在体外测定过夜。底物浓度为1mm。测试了在30℃和34℃下温度对贝壳杉烯底物的作用。图47显示在各种模块构建体中在30℃下的贝壳杉烯产生，且图48显示在各种模块构建体中在34℃下的贝壳杉烯产量。在30℃下，t7mep背景中的ch1.t7-psck-anggpps具有最高的贝壳杉烯滴度(～15mg/l)。在34℃下，t7mep背景中的ch1.t7-psck-anggpps显示出最高的贝壳杉烯滴度(～2mg/l)。为了研究atkah的耐热性，在30℃和34℃下测试atkah点突变体。条件是：r培养基+葡萄糖，96深孔板，在30℃或34℃下持续3天。菌株背景是p5trc-(8rp)t14atkah-o-(8rp)t20srko-o-flsrcpr。图49显示在整个atkah点突变文库中在30℃下的甜菊醇产量。图50显示在整个atkah点突变文库中在34℃下的甜菊醇产量。各种点突变显示相较于野生型的提高的耐热性，如通过30或34℃下的甜菊醇的较高滴度所示的。在30℃、33℃和37℃下测试mbugt1_2环状重排体的活性。图51(a)、(b)显示在30℃、34℃和37℃下的mbugt1_2环状重排体的活性。图(a)显示了reba至rebd的转化，而图(b)显示甜菊单苷至13c甜菊双糖苷的转化。对于两者，诱导环状重排体的表达，随后进行4小时的孵育期。如所示，当在30℃下和高于30℃下诱导时，eugt11失去其活性。相反地，前导环状重排体(leadcircularpermutant)在30℃下似乎最活跃。mbugt1_2196l在两种底物上保持最高的活性。图52显示ugt85c2突变体在30℃、34℃和37℃下将甜菊醇转化成13c甜菊单苷的活性。诱导表达，然后进行4小时的孵育期。如所显示的，85c2-wt和前导物在34℃和37℃下保持相当的活性，在30℃下保持最高活性。图53显示ugt76g1突变体在30℃、34℃和37℃下将rebd转化成13crebm的活性。诱导表达，然后进行4小时的孵育期。当在较高温度下诱导和测定时，76g1-l200a特别有活性，可能归因于较大量的蛋白质。图54显示ugt74g1环状重排体在30℃、34℃和37℃下将甜菊双糖苷转化成13c甜菊苷的活性。即使在37c下诱导和测定时，74g1-wt也保留了对甜菊双糖苷的活性。环状重排体74g1-259m和74g1-259l在较高温度下显示活性的显著下降。参考文献1.sharmam，thakralnk，&thakrals(2009)chemistryandinvivoprofileofent-kaureneglycosidesofsteviarebaudianabertoni：anoverview.naturalproductradiance8(2)：181-189.2changmcy&keaslingjd(2006)productionofisoprenoidpharmaceuticalsbyengineeredmicrobes.naturechemicalbiology2(12)：674-681.3.ajikumarpk，etal.(2008)terpenoids：opportunitiesforbiosynthesisofnaturalproductdrugsusingengineeredmicroorganisms.molecularpharmaceutics5(2)：167-190.4.ajikumarpk，etal.(2010)isoprenoidpathwayoptimizationfortaxolprecursoroverproductioninescherichiacoli.science330(6000)：70-74.5.dugard&stephanopoulosg(2011)relativepotentialofbiosyntheticpathwaysforbiofuelsandbio-basedproducts.naturebiotechnology29(12)：1074-1078.6.leonarde，etal.(2010)combiningmetabolicandproteinengineeringofaterpenoidbiosyntheticpathwayforoverproductionandselectivitycontrol.proceedingsofthenationalacademyofsciences107(31)：13654-13659.7.yadavvg，demeym，giawlimc，kumaranajikumarp，&stephanopoulosg(2012)thefutureofmetabolicengineeringandsyntheticbiology：towardsasystematicpractice.metabolicengineering.8.yadavsk&guleriap(2012)steviolglycosidesfromstevia：biosynthesispathwayreviewandtheirapplicationinfoodsandmedicine.criticalreviewsinfoodscienceandnutrition52(11)：988-998.9.richmanas，gijzenm，starrattan，yangz，&brandleje(1999)diterpenesynthesisinsteviarebaudiana：recruitmentandup-regulationofkeyenzymesfromthegibberellinbiosyntheticpathway.theplantjournal19(4)：411-421.10.hayashik，etal.(2006)identificationandfunctionalanalysisofbifunctionalent-kaurenesynthasefromthemossphyscomitrellapatens.febsletters580(26)：6175-6181.11.toyomasut，etal.(2000)cloningofafull-lengthcdnaencodingent-kaurenesynthasefromgibberellafujikuroi：functionalanalysisofabifunctionalditerpenecyclase.bioscience，biotechnology，andbiochemistry64(3)：660-664.12.helliwellca，poolea，peacockwj，&dennises(1999)arabidopsisent-kaureneoxidasecatalyzesthreestepsofgibberellinbiosynthesis.plantphysiology119(2)：507-510.13.brandlej&telmerp(2007)steviolglycosidebiosynthesis.phytochemistry68(14)：1855-1863.14.richmana，swansona，humphreyt，chapmanr，mcgarveyb，pocsr&brandlej.(2005)functionalgenomicsuncoversthreeglucosyltransferasesinvolvedinthesynthesisofthemajorsweetglucosidesofsteviarebaudiana.theplantjournal41(1)：56-67.15.hefnerj，ketchumreb，&croteaur(1998)cloningandfunctionalexpressionofacdnaencodinggeranylgeranyldiphosphatesynthasefromtaxuscanadensisandassessmentoftheroleofthisprenyltransferaseincellsinducedfortaxolproduction.archivesofbiochemistryandbiophysics360(1)：62-74.16.burkec&croteaur(2002)interactionwiththesmallsubunitofgeranyldiphosphatesynthasemodifiesthechainlengthspecificityofgeranylgeranyldiphosphatesynthasetoproducegeranyldiphosphate.journalofbiologicalchemistry277(5)：3141-3149.17.galaganje，etal.(2005)sequencingofaspergillusnidulansandcomparativeanalysiswitha.fumigatusanda.oryzae.nature438(7071)：1105-1115.18.kimsy，etal.(2009)cloningandheterologousexpressionofthecyclooctatinbiosyntheticgeneclusteraffordaditerpenecyclaseandtwop450hydroxylases.chemistry&biology16(7)：736-743.19.kawaideh，imair，sassat，&kamiyay(1997)ent-kaurenesynthasefromthefungusphaeosphaeriasp.l487.journalofbiologicalchemistry272(35)：21706-21712.20.humphreytv，richmanas，menassar，&brandleje(2006)spatialorganisationoffourenzymesfromsteviarebaudianathatareinvolvedinsteviolglycosidesynthesis.plantmolecularbiology61(1)：47-62.21.miyazakis，katsumatat，natsumem，&kawaideh(2011)thecyp701b1ofphyscomitrellapatensisanent-kaureneoxidasethatresistsinhibitionbyuniconazole-p.febsletters585(12)：1879-1883.22.mizutanim&ohtad(1998)twoisoformsofnadph：cytochromep450reductaseinarabidopsisthaliana：genestructure，heterologousexpressionininsectcells，anddifferentialregulation.plantphysiology116(1)：357-367.23.yamaguchis，nomurat，magomeh，kamiyay(2008)methodforproducingsteviolsynthetasegeneandsteviol.uspatentapplicationpublicationno.2008/0271205.24.kimkk，saway，&shibatah(1996)hydroxylationofent-kaurenoicacidtosteviolinsteviarebaudianabertoni-purificationandpartialcharacterizationoftheenzyme.archivesofbiochemistryandbiophysics332(2)：223-230.25.schulerma(1996)plantcytochromep450monooxygenases.criticalreviewsinplantsciences15(3)：235-284.26.heinemannu&hahnm.(1995)circularpermutationofpolypeptidechains：implicationsforproteinfoldingandstability.prog.biophys.molec.biol.64(2-3)：121-143.27.yuy，lutzs(2011)circularpermutation：adifferentwaytoengineerenzymestructureandfunction.trendsbiotechnol29(1)：18-25.28.houghton-larsenj，etal.recombinantproductionofsteviolglycosides.pctpublicationno.wo2013/022989.表1.使得能够生物合成甜菊醇的酶/基因序列的概述表2.经构建来评价用于贝壳杉烯生物合成的途径的菌株表3.测试上游和下游途径配置的组合的ko活性和贝壳杉烯酸生物合成。ch1＝1个染色体整合的拷贝，p5/p10/p20＝增加拷贝数的质粒，trc/t7＝增加转录强度的启动子。表4.srko的点突变体相对于亲本酶的体内活性的倍数变化。倍数增加描述了相对于具有野生型(未突变的)酶的亲本菌株，在该菌株中残留的贝壳杉烯的变化或所产生的贝壳杉烯酸的变化。表5.测试上游和下游途径配置的组合的ko/kah活性和甜菊醇生物合成。ch1＝1个染色体整合的拷贝，p5和p10＝增加拷贝数的质粒，trc/t7＝增加转录强度的启动子。表6.atkah的点突变体相对于亲本酶的活性的倍数变化。倍数增加描述了相对于具有野生型(未突变的)酶的亲本菌株，该菌株中残留的贝壳杉烯酸的变化，或产生的甜菊醇的变化。表7.修饰大肠杆菌菌株以改善udp-葡萄糖底物汇集物并支持甜菊醇糖苷的高滴度产生。表8.已知催化甜菊醇糖苷生物合成[至rebm]所需的反应的酶表9：用于甜菊醇糖苷(包括rebm)的生物合成的酶/基因序列的概述表10.甜菊醇糖苷结构的概述。序列表ugt序列＞srugt85c2gi|37993661|gb|aar06916.1|udp-糖基转移酶85c2[甜叶菊](seqidno：1)mdamattekkphvifipfpaqshikamlklaqllhhkglqitfvntdfihnqflessgphcldgapgfrfetipdgvshspeasipiresllrsietnfldrfidlvtklpdpptciisdgflsvftidaakklgipvmmywtlaacgfmgfyhihsliekgfaplkdasyltngyldtvidwvpgmegirlkdfpldwstdlndkvlmftteapqrshkvshhifhtfdelepsiiktlslrynhiytigplqllldqipeekkqtgitslhgyslvkeepecfqwlqskepnsvvyvnfgsttvmsledmtefgwglansnhyflwiirsnlvigenavlppeleehikkrgfiaswcsqekvlkhpsvggflthcgwgstieslsagvpnicwpyswdqltncryickewevglemgtkvkrdevkrlvqelmgegghkmrnkakdwkekariaiapngssslnidkmvkeitvlarn＞srugt74g1gi|37993669|gb|aar06920.1|udp-糖基转移酶74g1[甜叶菊](seqidno：2)maeqqkikksphvllipfplqghinpfiqfgkrliskgvkttlvttihtlnstlnhsnttttsieiqaisdgcdeggfmsagesyletfkqvgsksladlikklqsegttidaiiydsmtewvldvaiefgidggsfftqacvvnslyyhvhkglislplgetvsvpgfpvlqrwetplilqnheqiqspwsqmlfgqfanidqarwvftnsfykleeeviewtrkiwnlkvigptlpsmyldkrldddkdngpnlykanhhecmnwlddkpkesvvyvafgslvkhgpeqveeitralidsdvnflwvikhkeegklpenlseviktgkglivawckqldvlahesvgcfvthcgfnstleaislgvpvvampqfsdqttnaklldeilgvgvrvkadengivrrgnlascikmimeeergviirknavkwkdlakvavheggssdndivefvselika＞srugt76g1gi|37993653|gb|aar06912.1|udp-糖基转移酶76g1[甜叶菊](seqidno：3)menktettvrrrrriilfpvpfqghinpilqlanvlyskgfsitifhtnfnkpktsnyphftfrfildndpqderisnlpthgplagmripiinehgadelrrelellmlaseedeevsclitdalwyfaqsvadslnlrrlvlmtsslfnfhahvslpqfdelgyldpddktrleeqasgfpmlkvkdiksaysnwqilkeilgkmikqtkassgviwnsfkeleeseletvireipapsfliplpkhltasssslldhdrtvfqwldqqppssvlyvsfgstsevdekdfleiarglvdskqsflwvvrpgfvkgstwveplpdgflgergrivkwvpqqevlahgaigafwthsgwnstlesvcegvpmifsdfgldqplnarymsdvlkvgvylengwergeianairrvmvdeegeyirqnarvlkqkadvslmkggssyesleslvsyissl＞srugt91d1(seqidno：4)mynvtyhqnskamatsdsivddrkqlhvatfpwlafghilpflqlskliaekghkvsflsttrniqrlsshisplinvvqltlprvqelpedaeattdvhpediqylkkavdglqpevtrfleqhspdwiiydfthywlpsiaaslgisrayfcvitpwtiaylapssdamindsdgrttvedlttppkwfpfptkvcwrkhdlarmepyeapgisdgyrmgmvfkgsdcllfkcyhefgtqwlplletlhqvpvvpvgllppeipgdekdetwvsikkwldgkqkgsvvyvalgsealvsqtevvelalglelsglpfvwayrkpkgpaksdsvelpdgfvertrdrglvwtswapqlrilshesvcgflthcgsgsiveglmfghplimlpifcdqplnarlledkqvgieiprneedgcltkesvarslrsvvvenegeiykaanaralskiyndtkvekeyvsqpvdyleknaravaidhes＞srugt91d2(seqidno：5)matsdsivddrkqlhvatfpwlafghilpylqlskliaekghkvsplsttrniqrlsshisplinvvqltlprvqelpedaeattdvhpedipylkkasdglqpevtrfleqhspdwiiydythywlpsiaaslgisrahfsvttpwaiaymgpsadmingsdgrttvedlttppkwfpfptkvcwrkhdlarlvpykapgisdgyrmglvlkgsdcllskcyhefgtqwlplletlhqvpvvpvgllppevpgdekdetwvsikkwldgkqkgsvvyvalgsevlvsqtevvelalglelsglpfvwayrkpkgpaksdsvelpdgfvertrdrglvwtswapqlrilshesvcgflthcgsgsiveglmpghplimlpifgdqplnarlledkqvgieiprneedgcltkesvarslrsvvvekegeiykanarelskiyndtkvekeyvsqfvdylekntravaidhes＞srugt91d2e(seqidno：6)matsdsivddrkqlhvatfpwlafghilpylqlskliaekghkvsflsttrniqrlsshisplinvvqltlprvqelpedaeattdvhpedipylkkasdglqpevtrfleqhspdwiiydythywlpsiaaslgisrahfsvttpwaiaymgpsadamingsdgrttvedlttppkwfpfptkvcwrkhdlarlvpykapgisdgyrmglvlkgsdcllskcyhefgtqwlplletlhqvpvvpvgllppeipgdekdetwvsikkwldgkqkgsvvyvalgsevlvsqtevvelalglelsglpfvwayrkpkgpaksdsvelpdgfvertrdrglvwtswapqlrilshesvcgflthcgsgsiveglmfghplimlpifgdqplnarlledkqvgieiprneedgcltkesvarslrsvvvekegeiykanarelskiyndtkvekeyvsqfvdyleknaravaidhes＞osugt1-2(q0dpb7_orysj)seqidno：7mdsgysssyaaaagmhvvicpwlafghllpcldlaqrlasrghrvsfvstprnisrlppvrpalaplvafvalplprveglpdgaestndvphdrpdmvelhrrafdglaapfseflgtacadwvivdvfhhwaaaaaalehkvpcammllgsahmiasiadrrleraetespaaagqgrpaaaptfevarmklirtkgssgmslaerfsltlsrsslvvgrscvefepetvpllstlrgkpitflglmpplhegrredgedatvrwldaqpaksvvyvalgsevplgvekvhelalglelagtrflwalrkptgvsdadllpagfeertrgrgvvatrwvpqmsilahaavgaflthcgwnstieglmfghplimlpifgdqgpnarlieaknaglqvarndgdgsfdregvaaairavaveeesskvfqakakklqeivadmachieryidgfiqqlrsykdugt突变体和环状重排体＞mbugtc19(seqidno：8)maecmnwlddkpkesvvyvafgslvkhgpeqveeitralidsdvnflwvikhkeegklpenlseviktgkglivawckqldvlahesvgcfvthcgfnstleaislgvpvvampqfsdqttnaklldeilgvgvrvkadengivrrgnlasciimimeeergviirknavkwkdlakvavheggssdndivefvselikagsgeqqkikksphvllipfplqghinpfiqfgkrliskgvkttlvttihtlnstlnhsnttttsieiqaisdgcdeggfmsagesyletfkqvgsksladlikklqsegttidaiiydsmtewvldvaiefgidggsfftqacvvnslyyhvhkglislplgetvsvpgfpvlqrwetplilqnheqiqspwsqmlfgqfanidqarwvftnsfykleeeviewtrkiwnlkvigptlpsmyldkrldddkdngfnlykanhh＞mbugt1-2(seqidno：9)magssgmslaerfsltlsrsslvvgrscvefepetvpllstlrgkpitflglmpplh1egrredgedatvrwldaqpaksvvyvalgsevplgvekvhelalglelagtrflwalrkptgvsdadllpagfeertrgrgvvatrwvpqmsilahaavgaflthcgwnstieglmfghplimlpifgdqgpnarlieaknaglqvarndgdgsfdregvaaairavaveeesskvfqakakklqeivadmacheryidgfiqqlrsykddsgysssyaaaagmhvvicpwlafghllpcldlaqrlasrghrvsfvstprnisrlppvrpalaplvafvalplprveglpdgaestndvphdrpdmvelhrrafdglaapfseflgtacadwvivdvfhhwaaaaalehkvpcammllgsahmiasiadrrleraetespaaagqgrpaaaptfevarmklirtk＞mbugt1-3(seqidno：10)manwqilkeilgkmikqtkassgviwnsfkeleeseletvireipapsfliplpkhltasssslldhdrtvfqwldqqppssvlyvsfgstsevdekdfleiarglvdskqsflwvvrpgfvkgstwveplpdgflgergrivkwvpqqevlahgaigafwthsgwnstlesvcegvpmifsdfgldqplnarymsdvlkvgvylengwergeianairrvmvdeegeyirqnarvlkqkadvslmkggssyesleslvsyisslenktettvrrrrriilfpvpfqghinpilqlanvlyskgfsitifhtnfnkpktsnyphftfrfildndpqderisnlpthgplagmripiinehgadelrrelellmiaseedeevsclitdalwyfaqsvadslnlrrlvlmtsslfnfhahvslpqfdelgyldpddktrleeqasgfpmlkvkdiksays＞mbugt1，2-2(seqidno：45)matkgssgmslaerfwltlsrsslvvgrscvefepetvpllstlrgkpitflglmpplhegrredgedatvrwldaqpaksvvyvalgsevplgvekvhelalglelagtrflwalrkptgvsdadllpagfeertrgrgvvatrwvpqmsilahaavgaflthcgwnstieglmfghplimlpifgdqgpnarlieaknaglqvarndgdgsfdregvaaairavaveeesskvfqakakklqeivadmacheryidgfiqqlrsykddsgysssyaaaagmhvvicpwlafghllpcldlaqrlasrghrvsfvstprnisrlppvrpalaplvafvalplprveglpdgaestndvphdrpdmvelhrrafdglaapfseflgtacadwvivdvfhhwaaaaalehkvpcammllgsaemiasiaderlehaetespaaagqgrpaaaptfevarmklir＞mbugtc19-2(seqidno：46)manhhecmnwlddkpkesvvyvafgslvkhgpeqveeitralidsdvnflwvikhkeegklpenlseviktgkglivawckqldvlahesvgcfvthcgfnstleaislgvpvvampqfsdqttnaklldeilgvgvrvkadengivrrgnlascikmimeeergviirknavkwkdlakvavheggssdndivefvselikagsgeqqkikksphvllipfplqghinpfiqfgkrliskgvkttlvttihtlnstlnhsnttttsieiqaisdgcdeggfmsagesyletfkqvgsksladlikklqsegttidaiiydsmtewvldvaiefgidggsfftqacvvnslyyhvhkglislplgetvsvpgfpvlqrwetplilqnheqiqspwsqmlfgqfanidqarwvftnsfykleeeviewtrkiwnlkvigptlpsmyldkrldddkdngfnlyka＞mbugtc13(seqidno：51)madamattekkphvifipfpaqshikamlklaqllhhkglqitfvntdfihnqflessgphcldgapgfrfetipdgvshspeasipiresllrsietnfldrfidlvtklpdpptciisdgflsvftidaakklgipvmmywtlaacgfmgfyhihsliekgfaplkdasyltngyldtvidwvpgmegirlkdfpldwstdlndkvlmftteatqrshkvshhifhtfdelepsiiktlslrynhiytigplqllldqipeekkqtgitslhgyslvkeepecfqwlqskepnsvvyvnfgsttvmsledmtefgwglansnhyflwiirsnlvigenavlppeleehikkrgfiaswcsqekvlkhpsvggflthcgwgstieslsagvpmicwpyswdqltncryickewevglemgtkvkrdevkrlvqelmgegghkmrnkakdwkekariaiapngssslnidkmvkeitvlarn用于甜菊醇生物合成的酶＞tcggpps(seqidno：11)mytamaagtqslqlrtvasyqecnsmrscfkltpfksfhgvnfnvpslgaanceimghlklgslpykqcsvsskstktmaqlvdlaetekaegkdiefdfneymkskavavdaaldkaipleypekihesmrysllaggkrvrpalciaacelvggsqdlamptacamemihtmslihddlpcmdnddfrrgkptnhkvfgedtavlagdallsfafehiavatsktvpsdrtlrviselgktigsqglvggqvvditsegdanvdlktlewihihktavllecsvvsggilggatedeiarirryarcvgllfqvvddildvtksseelgktagkdlltdkatypklmglekakefaaelatrakeelssfdqikaapllgladyiafrqn＞在位置98处被截短的tcggpps，其中突变加以下划线(seqidno：12)madfneymkskavavdaaldkaipleypekihesmrysllaggkrvrpalciaacelvggsqdlamptacamemihtmslihddlpcmdnddfrrgkptnhkvfgedtavlagdallsfafehiavatsktvpsdrtlrvicelgktigsqglvggqvvditsegdanvdlktlewihihktavllecsvvsggilgdatedeiarirryarcvgllfqvvddildvtksseelgktagkdlltdkatypklmglekakefaaelatrakeelssfdqikvapligladyiafrqn＞agggppsgi|17352451|gb|aal17614.2|af425235_1牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶[大冷杉](seqidno：13)maysgmatsyhglhfmniatqecnlkrlsipsrrfhgvspslwasngfqghlkrelsansflvsssrysntiakftnlpekvkekviefdfkeylrskamavnealdravplryperiheamrysllaggkrvrpvlcisacelvggteevamptacamemihtmslihddlpcmdnddfrrgkptnhkvfgegtailagdallsfafehiavstsksvgtdrilrvvselgrtigsqglvggqvaditsegdasvdldtlewihihktavllecsvmcgaiisgasdneieriqryarsvgllfqvvddildvtksskelgktagkdlisdkatypklmglekakqfasdllirakedlscfdpmkaapllgladyiafrqn＞anggppsgi|259486923|tpe|cbf85177.1|tpa：保守的假定的蛋白[构巢曲霉fgsca4}(seqidno：14)msppldsaleplseyketafprtekdpsqykehdlvtpekeiqtgyfsprgshsshgshdssassnislddarmsdvnnspnvfhddpdtideklsmywkaanetvirepydyiagipgkeirrklleafnhwykvdeqscqaiattvgmahnaslliddiqdssklrrgvpcahevfgiaqtinsanyvyflaqnqlfrlrswpqaisvfneemvnlhrgqgmelfwrdnllppsmddylqmianktgglfrmivrllqtssrqvidveqlvdvlglyfqilddyknireekmaaqkgffedltegkfsfpichaigegaknrtallhmlrlktddmkikqeavcildnagsldytrevlygldrkarsllrefktpnpfmealldamlsslqach＞smggppsgi|260653869|abj|bai44337.1|牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶[生黑孢链霉菌]seqidno：15)mttptlspgrldadtvrksvdvvledfltakahttpqhhlpylsgllkdflsggkrirpllcvtgwqavgggedtepvfrvaaclemfhafalihddvmddsdtrrgrptihrtleaalcatdrrpeqierfgvsgavllgdlaltwsdellhsagltpvqfdavlpllsemrtevmlgqyldlqatgeltddveatltvnryktakytierplhvgaaiagagpeameaftayalplgeafqlrddllgvygdpestgksqlddlragknttlialalrgsdstqaarlrslignpllderdaatiqeifaattardaveqmiddrrtqalralddapftadavnalkqiarlatvrns＞mbggpps[海洋细菌443](seqidno：36)maenglldceqyleeamaehataqcppllaqalnyavfpggarvrpkickavalannssdvglanaaasaielihcaslvhddlpcfddatqrrgkpsvhakfgeriavltgdalivaafqtlathaihavrtervplvtaivargvgaphgicagqawecersvdlsryhraktgalfvaatcagaaaagvdpgpwvnlgasigeayqvaddikdaisdpetlgkptgidvkldrpsavrelgldgavtrlkqcleagldsmpacagqdllqkivraqasrfvpekiaqvaavd＞phggpps[海云台副球菌](seqidno：37)marrdvnpihatllqtrleeiaqgfgavsqplgaamshgalssgrrfrgmlmllaaeasggvcdtivdaacavemvhaaslifddlpcmddaglrrgrpathvahgesravlggialiteamallagargasgtvraqlvrilsrslgpqglcagqdldlhaakngagveqeqdlktgvlfiaglemlavikefdaeeqtqmidfgrqlgrvfqsyddlldvvgdqaalgkdtgrdaaapgprrgllavsdlqnvsrhyeasraqldamlrskrlqapeiaallervlpyaaravd＞ctggpps[绿硫细菌tls](seqidno：38)masspitqaqveskyrqyhakinealaacfpkekpatlydparyilegkgkrirpfltllaaeavsgksdnalgvalgievlhnftlmhddimdqadlrhgrptvhkqnnvnaailsgdmmiayayelalkaissrhaeiihifndaniticegqaldmeleqrkdvtiadyldmiskktgrlisaaleaggvagdgtpeqiaalvtfgekigrafqiqddyldimagdgksgkvpggdvingkktwlllrslelaegadrellqsifdnngtspdnvpavkaifekcgvlnetrakinedteaalaaldalpfeegrgylrgfanilmkrdfvd＞ssggpps[聚球藻属某种ja-3-3ab](seqidno：39)mavaqtfnldtylsqrqqqveealsaalvpayperiyeamrysllaggkrlrpilclaacelaggsveqamptacalemihtmslihddlpandnddfrrgkptnhkvfgediailagdallayafehiasqtrgvppqlvlqviarighavaatglvggqvvdlesegkaisletleyihshktgalleasvvsggilagadeellarlshyardiglafqivddildvtatseqlgktagkdqaaakatypsllgleasrqkaeeliqsakealrpygsqaepllaladfitrrqhvd＞ssggpps2[集胞藻属某种pcc6803](seqidno：40)mavaqqtrtdfdlaqylqvkkgvveaaldsslaiarpekiyeamrysllaggkrlrpilcitacelcggdealalptacalemihtmslihddlpsmdnddfrrgkptnhkvygediailagdgllayafeyvvthtpqadpqallqviarlgrtvgaaglvggqvldlesegrtditpetltfihthktgalleasvltgailagatgeqqqrlaryaqniglafqvvddilditatqeelgktagkdvkaqkatypsllgleasraqaqslidqaivalepfgpsaeplqaiaeyivarkyvd＞tmggpps[海栖热袍菌hb8](seqidno：41)makkekveerireilrpgwdllteeamlysatvggkrirpllvltlgedlgveeeklldvavavelfhtaslihddlppidnadfrrgkpschrtygediallagdglfflafsqiskignskifeefsetayklllgeamdveferrkmevsqemvermyafktgalfafcfsapfilkgkdhtkmkllgekfgvafqiyddlkdilgsfekvgkdlgkdtekvtlvkkvgiqkaremadkyyeevlkgieseglfrtlfllkelkqmveervd＞cgggpps[谷氨酸棒杆菌](seqidno：42)makdvslssfdahdldldkfpevvrdrltqfldaqeltiadigapvtdavahlrsfvlnggkrirplyawagflaaqghknsseklesvldaaaslefiqacalihddiidssdtrrgaptvhraveadhrannfegdpehfgvsvsilagdmalvwaedmlqdsglsaealartrdawrgmrteviggqlldiyleshanesveladsvnrfktaaytiarplhlgasiaggspqlidallhyghdigiafqlrddllgvfgdpaitgkpagddiregkrtvllalalqradkqspeaatairagvgkvtspediavitehiratgaeeeveqrisqltesglahlddvdipdevraqlralairsterrmvd＞ttggpps[嗜热栖热菌hb27](seqidno：43)mavpapeairqalqerllarldhpdplyrdllqdyprrggkmlrglltvysalahgapleagleaatalelfqnwvlvhddiedgseerrgrpalhrlhpmplalnagdamhaemwgllaeglarglfppevllefhevvrrtaygqhldllwtlggtfdlrpedyfrmvahkaayytavaplrlgallagktppaayeegglrlgtafqivddvlnleggeaygkeragdlyegkrtlillrfleeappeeraralallalpreakpeaevgwllerllasralawakaeakrlqaeglalleaafqdlpgkealdhlrgllaalverravd＞pcggpps[热泉热棒菌jcm11548](seqidno：44)madvvsrlhqkygaevekalvrylsiglaedfreavlyqvktggkrlrplltlaaaeavsgqwrpalpaaaivelihnysliyddiidrgdvrrglptvrkafgdnaailvgiwyreaieeavldtpkptlfakevaevikaidegerldilfeaagrsdpyfvqarwrevtlddyikmvslktgaliaaaakwgvlsvsddrglaeaawnfgmaagvafqiiddvldiygdpkkfgkeigkdikehkrgnavvavalshlgegerrrlleilarevveeadvreavalldsvgareealrlaaryreeaerhlakipnngtlkelldfivarey＞srcpps[甜叶菊](seqidno：16)mktgfispatvfhhrispattfrhhlspattnstgivalrdinfrckavskeysdllqkdeasftkwdddkvkdhldtnknlypndeikefvesvkamfgsmndgeinvsaydtawvalvqdvdgsgspqfpsslewiannqlsdgswgdhllfsahdriintlacvialtswnvhpskcekglnflrenickledenaehmpigfevtfpslidiakklnievpedtpaikeiyarrdikltkipmevlhkvpttllhslegmpdlewekllklqckdgsflfspsstafalmqtkdekclqyltnivtkfnggvpnvypvdlfehiwvvdrlqrlgiaryfkseikdcveyinkywtkngicwarnthvqdiddtamgfrvlrahgydvtpdvfrqfekdgkfvcfagqstqavtgmfnvyrasqmlfpgeriledakkfsynylkekqstnelldkwiiakdlpgevgyaldipwyaslprletryyleqyggeddvwigktlyrmgyvsnntylemakldynnyvavlqlewytiqqwyvdigiekfesdniksvlvsyylaaasifeperskeriawakttilvdkitsifdssqsskeditafidkfrnkssskkhsingepwhevmvalkktlhgfaldalmthsqdihpqlhqawemwltklqdgvdvtaelmvqminmtagrwvskellthpqyqrlstvtnsvchditklhnfkensttvdskvqelvqlvfsdtpddldqdmkqtfltvmktfyykawcdpntindhiskvfeivi＞srks[甜叶菊](seqidno：17)mnlslciasplltksnrpaalsaihtastshggqtnftnliidttkeriqkqfknveisvssydtawvamvpspnspkspcfpeclnwlinnqlndgswglvnhthnhnhpllkdslsstlacivalkrwnvgedqinkglsfiesnlasateksqpspigfdiifpglleyaknldinllskqtdfslmlhkreleqkrchsnemdgylayiseglgnlydwnmvkkyqmkngsvfnspsataaafinhqnpgclnylnslldkfgnavptvyphdlfirlsmvdtierlgishhfrveiknvldetyrcwverdeqifmdvvtcalafrllringyevspdplaeitnelalkdeyaaletyhashilyqedlssgkqilksadflkeiistdsnrlsklihkevenalkfpintglerintrrniqlynvdntrilkttyhssnisntdylrlavedfytcqsiyreelkglerwvvenkldqlkfarqktaycyfsvaatlsspelsdariswakngilttvvddffdiggtideltnliqcvekwnvdvdkdccsehvrilflalkdaicwigdeafkwqardvtshviqtwlelmnsmlreaiwtrdayvptlneymenayvsfalgpivkpaiyfvgpklseeivesseyhnlfklmstqgrllndihsfkrefkegklnavalhlsngesgkveeevveemmmmiknkrkelmklifeengsivprackdafwnmchvlnffyanddgftgntildtvkdiiynplvlvneneeqr＞gfcpps/ks[藤仓赤霉](seqidno：18)mpgkiengtpkdlktgndfvsaakslldrafkshhsyyglcstscqvydtawvamipktrdnvkqwlfpecfhyllktqaadgswgslpttqtagildtasavlallchaqeplqildvspdemglriehgvtslkrqlavwndvedtnhigvefiipallsmlekeldvpsfefpcrsilermhgeklghfdleqvygkpssllhsleaflgkldfdrlshhlyhgsmmaspsstaayligatkwddeaedylrhvmrngaghgnggisgtfptthfecswiiatllkvgftlkqidgdglrglstillealrdengvigfaprtadvddtakallalslvnqpvspdimikvfegkdhfttfgserdpsltsnlhvllsllkqsnlsqyhpqilkttlftcrwwwgsdhcvkdkwnlshlyptmllveaftevlhlidggelsslfdesfkckiglsifqavlriiltqdndgswrgyreqtcyailalvqarhvcffthmvdrlqscvdrgfswlkscsfhsqdltwtsktayevgfvaeayklaalqsaslevpaatighsvtsavpssdlekymrlvrktalfspldewglmasiiessffvpllqaqrveiyprdnikvdedkylsiipftwvgcnnrsrtfasnrwlydmmylsllgyqtdeymeavagpvfgdvsllhqtidkvidntmgnlarangtvhsgnghqhespnigqvedtltrftnsvlnhkdvlnssssdqdtlrrefrtfmhahitqiednsrfskqassdafsspeqsyfqwvnstggshvacaysfafsnclmsanllqgkdafpsgtqkylissvmrhatnmcrmyndfgsiardnaernvnsihfpeftlcngtsqnlderkerllkiatyeqgyldralealerqsrddagdragskdmrklkivklfcdvtdlydqlyvikdlsssmk＞ppcpps/ks[小立碗藓](seqidno：19)masstliqnrscgvtssmssfqifrgqplrfpgtrtpaavqclkkrrclrptesvlesspgsgsyrivtgpsginpssnghlqegslthrlpipmeksidnfqstlyvsdiwsetlqrtecllqvtenvqmnewieeirmyfrnmtlgeismspydtawvarvpaldgshgpqfhrslqwiidnqlpdgdwgepslflgydrvcntlacvialktwgvgaqnvergiqflqsniykmeeddanhmpigfeivfpammedakalgldlpydatilqqisaerekkmkkipmamvykypttllhsleglhrevdwnkllqlqsengsflyspastacalmytkdvkcfdylnqllikfdhacpnvypvdlferlwmvdrlqrlgisryfereirdclqyvyrywkdcgigwasnssvqdvddtamafrllrthgfdvkedcfrqffkdgeffcfagqssqavtgmfnlsrasqtlfpgesllkkartfsrnflrtkhennecfdkwiitkdlageveynltfpwyaslprlehrtyldqygiddiwigkslykmpavtnevflklakadfnmcqalhkkeleqvikwnascqfrdlefarqksvecyfagaatmfepemvqarlvwarccvlttvlddyfdhgtpveelrvfvqavrtwnpelinglpeqakilfmglyktvntiaeeafmaqkrdvhhhlkhywdklitsalkeaewaesgyvptfdeymevaeisvalepivcstlffaghrldedvldsydyhlvmhlvnrvgrilndiqgmkreasqgkissvqiymeehpsvpseamaiahlqelvdnsmqqltyevlrftavpksckrihlnmakimhafykdtdgfssltamtgfvkkvlfepvpe＞pscpps/ks[暗球腔菌属某种](seqidno：20)mfakfdmleeearalvrkvgnavdpiygfsttscqiydtawaamiskeehgdkvwlfpesfkyllekqgedgswerhprsktvgvlntaaaclallrhvknplqlqdiaaqdielriqrglrsleeqliawddvldtnhigvemivpalldylqaedenvdfefeshsllmqmykekmarfspeslyrarpssalhnlealigkldfdkvghhlyngsmmaspsstaaflmhaspwsheaeaylrhvfeagtgkgsggfpgtypttyfelnwvlstlmksgftlsdlecdelssiantiaegfecdhgvigfapravdvddtakglltltllgmdegvspapmiamfeakdhfltflgerdpsftsnchvllsllhrtdllqylpqirktttflceawwacdgqikdkwhlshlyptmlmvqafaeillksaegeplhdafdaatlsrvsicvfqaclrtllaqsqdgswhgqpeascyavltlaesgrlvllqalqpqiaaamekaadvmqagrwscsdhdcdwtsktayrvdlvaaayrlaamkassnltftvddnvskrsngfqqlvgrtdlfsgvpawelqasflesalfvpllrnhrldvfdrddikvskdhyldmipftwvgcnnrsrtyvstsflfdmmiismlgyqideffeaeaapafaqcigqlhqvvdkvvdevidevvdkvvgkvvgkvvgkvvdervdsptheaiaicnieaslrrfvdhvlhhqhvlhasqqeqdilwrelraflhahvvqmadnstlappgrtffdwvrttaadhvacaysfafaccitsatigqgqsmfatvnelylvqaaarhmttmcrmcndigsvdrdfieaninsvhfpefstlslvadkkkalarlaayeksclthtldqfenevlqsprvssaasgdfrtrkvavvrffadvtdfydqlyilrdlssslkhvgt＞etcpps[嗜气管欧文氏菌](seqidno：32)mahalaeniltelntllsdmddggyvgpsvydtaqllrfhpnppdragiyrwlikqqhedggwgspdfplhrqvptvaailalheaqpqpegaaaalaaaavylaqerdlyadtipddapigaelilpqlcrqaaalfphlayprygalyeaeaarlgkvesltavpsghpllhsweswgrsstevtpdvfgsigispsatavwlgracaenpaclpehatrylhnasratgvgidgvvpnvwpidvfepcwslyslhlaglfshpglstvvqniatniqailtplglgpalsfasdaddtaiaaavvqlsghsltcyplhqfekgdlfvtfpgernpslsttihavhalsllgttapdarayiensksadgvwknekwhaswlyptshavaalahgmpswrdndvlykileaqhlsggwgagaaptqeetayalfalhvmndrvnaplreklvsavararewllvryqsnqlpitplwigkelycpqrvvrvteltglwlalnwnpshsdvsdtrtetpgeri＞etks[嗜气管欧文氏菌](seqidno：33)matshddacqqvkvwgetlfgfldehaveavrggqfilrhirpelaaisartgrdpddearelafyqemallfwiddchdrgvmspddyavvegilvgrmpdaptpsvgcsflrhrlaqlashkhdysqlladtqaystalrngkrlasdpdrwsysehlrngvdsigyqnvfgclsllwgldmprwrtepafqnalsflcaigrlqndlhglandrtlgeadnlavqlerryptldaveflqteitgyermlrplletanfdpvwvrlmetmltvsdqyyatstlryriddtattapscdtrhasgavtgsgnete＞sfcpps[费氏中华根瘤菌](seqidno：34)manalseqilfelrhllsemsdggsvgpsvydtaralqfggnvtgrqdayawllaqqqadggwgsadfplfrhaptwaallalqradplpgaadavqaatrflerqadpyahavpedapigaelilpqlcgeaasllggvafprhpallplrqaclvklgavatlpsghpllhsweawgtwptaacpdddgsigispaataawrahavtqgstpqvgradayiqaasratrsgiegvvpnvwpinvfepcwslytlhlaglfahpaldeavrvivaqldarlgvrglgpalhfaadaddtavalcvlrlagrdpavdalrhfeigelfvtfpgernasvstnihaalhalrllgkpaagtsayveanrnphglwdnekwhvswlyptahavaalaqgkpqwrderalaallqaqrqdggwgagrastfeetayalfalhvmdgseeptgrrriaqavaralewmlarhaapalpqmplwigkelycpirvvrvaelaglwlalrwgprvpaegagaap＞sfks[费氏中华根瘤菌](seqidno：35)maipterglqqvlewgrsltgfadehaaeavrggqyilqrihpslrdtsartgrdpqdetlivafyrelallfwlddcndldliapeqlaaveqalgqgvpcalpgfegcavlraslaalaydrrdyaqllddtrcycaalraghaqaagaaerwsyaeylhngidsiayanvfcclsllwgldmatlrarpafrqvlrlisaigrlqndlhgrdkdrsageadnaailllerypampvveflndelaghtrmlhrvmaeerfpapwgplieamaairahyyqtstsryrsdaagggqhapa＞srkoaaq63464.1|对映-贝壳杉烯氧化酶cyp701a5[甜叶菊](seqidno：21)mdavtglltvpataitiggtavalavalifwylksytsarrsqsnhlprvpevpgvpllgnllqlkekkpymtftrwaatygpiysiktgatsmvvvssneiakealvtrfqsistrnlskalkvltadktmvamsdyddyhktvkrhiltavlgpnaqkkhrihrdimmdnistqlhefvknnpeqeevdlrkifqselfglamrqalgkdveslyvedlkitmnrdeifqvlvvdpmmgaidvdwrdffpylkwvpnkkfentiqqmyirreavmkslikehkkriasgeklnsyidyllseaqtltdqqllmslwepiiessdttmvttewamyelaknpklqdrlyrdiksvcgsekiteehlsqlpyitaifhetlrrhspvpiiplrhvhedtvlggyhvpagtelavniygcnmdknvwenpeewnperfmkenetidfqktmafgggkrvcagslqalltasigigrmvqefewklkdmtqeevntiglttqmlrplraiikpri＞t20-8rpsrko(seqidno：22)nalllavfavalavalifwylksytsarrsqsnhlprvpevpgvpllgnllqlkekkpymtftrwaatygpiysiktgatsmvvvssneiakealvtrfqsistrnlskalkvltadktmvamsdyddyhktvkrhiltavlgpnaqkkhrihrdimhdnistqlhefvknnpeqeevdlrkifqselfglamrqalgkdveslyvedlkitmnrdeifqvlvvdpmmgaidvdwrdffpylkwvpnkkfentiqqmyirreavmkslikehkkriasgeklnsyidyllseaqtltdqqlimslwepiiessdttmvttewamyelaknpklqdrlyrdiksvcgsekiteehlsqlpyitaifhetlrrhspvpiiplrhvhedtvlggyhvpagtelavniygcnmdknvwenpeewnperfmkenetidfqktmafgggkrvcagslqalltasigigrmvqefewklkdmtqeevntiglttqmlrplraiikpri＞atko[拟南芥](seqidno：23)mapfsmisillgfvissfififffkkllsfsrknmsevstlpsvpvvpgfpvignllqlkekkphktftrwseiygpiysikmgssslivlnstetakeamvtrfssistrklsnaltvltcdksmvatsdyddfhklvkrcllngllganaqkrkrhyrdalienvssklhahardhpqepvnfraifehelfgvalkqafgkdvesiyvkelgvtlskdeifkvlvhdmmegaidvdwrdffpylkwipnksfeariqqkhkrrlavmnaliqdrlkqngsesdddcylnflmseaktltkeqiailvwetiietadttlvttewaiyelakhpsvqdrlckeiqnvcggekfkeeqlsqvpylngvfhetlrkyspaplvpiryahedtqiggyhvpagseiainiygcnmdkkrwerpedwwperflddgkyetsdlhktmafgagkrvcagalqaslmagiaigrlvqefewklrdgeeenvdtygltsqklyplmaiinprrs＞ppko[小立碗藓](seqidno：24)makhiatqllqqwnealktmppgfrtagkilvweelasnkvlitialawvllfvartclrnkkrlppaipgglpvlgnllqltekkphrtftawskehgpiftikvgsvpqavvnnseiakevlvtkfasiskrqmpmalrvltrdktmvamsdygeehrmlkklvmtnligpttqnknrslrddaligmiegvlaelkasptspkvvnvrdyvqrslfpfalqqvfgyipdqvevlelgtcvstwdmfdalvvaplsavinvdwrdffpalrwipnrsvedlvrtvdfkrnsimkaliraqrmrlanlkepprcyadialteathltekqlemslwepiiesadttlvtsewamyeiaknpdcqdrlyreivsvagtermvteddlpnmpylgaiiketlrkytpvplipsrfveeditlggydipkgyqilvnlfaiandpavwsnpekwdpermlankkvdmgfrdfslmpfgagkrmcagitqamfiipmnvaalvqhcewrlspqeisninnkiedvvyltthklsplsceatprishrlp＞srkah1gi|189418962|gb|acd93722.1|对映-贝壳杉烯酸13-羟化酶[甜叶菊](seqidno：25)miqvltpillfliffvfwkvykhqktkinlppgsfgwpflgetlallragwdseperfvrerikkhgsplvfktslfgdrfavlcgpagnkflfcnenklvaswwpvpvrklfgkslltirgdeakwmrkmllsylgpdafathyavtmdvvtrrhidvhwrgkeevnvfqtvklyafelacrlfmnlddpnhiaklgslfniflkgiielpidvpgtrfysskkaaaairielkklikarklelkegkasssqdllshlltspdengmflteeeivdnillllfaghdtsalsitllmktlgehsdvydkvlkeqleisktkeaweslkwediqkmkyswsvicevmrlnppvigtyrealvdidyagytipkgwklhwsavstqrdeanfedvtrfdpsrfegagptpftfvpfgggprmclgkefarlevlaflhnivtnfkwdllipdekieydpmatpakglpirlhfhqv＞srkah2来自专利us20080064063的对映-贝壳杉烯酸13-羟化酶[甜叶菊](seqidno：26)mglfpledsyalvfeglaitlalyyllsfiyktskktctppkasgehpitghlnllsgssglphlalasladrcgpiftirlgirrvlvvsnweiakeiftthdlivsnrpkylaakilgfnyvsfsfapygpywvgirkiiatklmsssrlqklqfvrvfelensmksireswkekkdeegkvlvemkkwfwelnmnivlrtvagkqytgtvddadakriselfrewfhytgrfvvgdafpflgwldlggykktmelvasrldsmvskwldehrkkqanddkkedmdfmdimismteansplegygtdtiikttcmtlivsgvdttsivltwalslllnnrdtlkkaqeeldmcvgkgrqvnesdlvnliyleavlkealrlypaaflggprafledctvagyripkgtcllinmwklhrdpniwsdpcefkperfltpnqkdvdvigmdfelipfgagrrycpgtrlalqmlhivlatllqnfemstpndapvdmtasvgmtnakasplevllsprvkws＞atkahgi|332005993|gb|aed93376.1|细胞色素p450，家族714，亚家族a，多肽2[拟南芥](seqidno：27)meslvvhtvnaiwcivivgifsvgyhvygravveqwrmrrslklqgv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