技术领域本发明属于植物分子生物学、植物基因工程和生物技术领域，涉及一种植物休眠解除响应和抗逆的基因，尤其涉及一种牡丹PsRD22基因及其应用。
背景技术：
牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是中国特有的传统名花，也是世界著名花卉，叶形秀丽，花大色艳，有“花中之王”之美誉。牡丹属芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，共有8个原种，分为革质花盘亚组和肉质花盘亚组，均原产于中国。中国既是世界牡丹野生种的原产地和分布中心，也是世界牡丹园艺品种的栽培中心(王莲英，袁涛，《中国牡丹与芍药》，北京金盾出版社，1999)。牡丹产业的发展需要科学理论和技术的支撑和指导。牡丹催花是牡丹产业化的关键技术之一，并且日趋完善。牡丹催花技术是通过人为创造条件使牡丹在自然非开花时节开花的技术。自唐朝开始，就有人尝试牡丹的低温催花。经过1000多年的不断总结与发展，人们已经总结出一套传统的牡丹低温催花技术。但是由于对牡丹花芽内休眠解除机理的认识不足，往往不能彻底打破花芽内休眠，致使花蕾发育不良，造成开花不正常、有花无叶、花小叶小、花期短甚至催花失败(赵海军，张万堂，郑国生等.牡丹深休眠特性和解除方法.山东林业科技，2000，5：44-46)。对牡丹休眠解除过程中关键基因的分析可以从本质上了解牡丹的休眠解除机理，为推进牡丹催花产业奠定基础。干旱应答蛋白RD22(Dehydration-responsiveprotein)是一种被广泛用于检测植物对逆境胁迫响应的标记。最近，RD22被发现在植物休眠过程中也起重要作用。RD22基因是由Yamaguchi-Shinozaki等利用差异显示技术首先从干旱处理的拟南芥中克隆出的9个脱水诱导蛋白基因，命名为RD基因。RD基因家族有很多成员，从干旱、低温、盐胁迫处理的拟南芥中就发现大量的RD基因。使用ABA诱导可检测RD22基因的mRNA，表明RD22基因mRNA的转录可由内源ABA诱导。Northernblotting分析结果表明，RD22基因的表达受盐和水分胁迫诱导，而与冷和热胁迫无关(KazakoYS,MasahiroK,SatomiU,etal.Molecularcloningandcharacterizationof9cDNAsforgenesthatareresponsivetodesiccationinArabidopsisthaliana:sequenceanalysisofonecDNAclonethatencodesaputativetransmembranechannelprotein[J].PlantCellPhysiol,1992,33(3):217-224)。RD22蛋白是包含BURP结构域蛋白家族成员。BURP结构域是由Hattori等界定的氨基酸序列基序。BURP蛋白家族的命名来源于4个具有代表性的成员BNM2、USPs、RD22、PG1蛋白的首字母。目前，发现该结构域仅存在于植物蛋白中，含BURP结构域的蛋白质的氨基酸序列有4个共同特征：N端有一个约20个氨基酸的疏水区，多为信号肽；短保守片段或其他短片段；对于某些BURP-domain类蛋白，还有各自不同的重复序列；C-末端为BuRP结构域。牡丹的遗传背景比较薄弱，对RD22的深入了解可以丰富该物种的生物信息学资源，拓展牡丹分子生物学研究领域，对研究牡丹在特殊生境中的遗传机制有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种牡丹花芽低温休眠解除响应和抗逆基因PsRD22及其编码的蛋白。一方面，本发明在建立了上海地区牡丹“洛阳红”花芽低温休眠解除技术平台的基础上，对该过程的转录组进行了动态分析，通过差异表达基因挖掘，分离了一个在花芽低温休眠解除中持续高表达且具有广泛抗逆性的基因PsRD22，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，长度为1140bp，其所编码的PsRD22蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，由379个氨基酸残基组成，分子量为40522道尔顿。具体地，以4年生牡丹“洛阳红”为试验材料，经历0-63天低温处理观测其芽萌动成花情况；以未低温处理的为起始对照，隔7天取样，共10个样本，通过高通量RNA-seq技术建立了花芽低温休眠解除的动态转录组；通过差异表达基因聚类分析，获得了持续高表达的基因PsRD22；通过序列分析及同源性比对发现该基因具有广泛的抗逆性；烟草瞬时转化发现PsRD22主要定位于胞质中，并且在保卫细胞中有较强的荧光信号，参与调控气孔的开闭，从而证实了所获得的基因。进一步，本发明还提供了以下各项：1)包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的被分离的DNA分子；2)具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链；3)编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸链；4)与SEQIDNo.1所示核苷酸序列互补的多核苷酸链；5)与编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列互补的多核苷酸链；6)包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链的重组表达载体；7)包含上述8)所述的重组表达载体的宿主细胞。在牡丹PsRD22基因的制备过程中，本发明根据PsRD22全长cDNA序列设计其上下游的扩增引物为：FGSP5′-atggagcttcatctcctgccct-3′(SEQIDNo.3)；RGSP5′-gttgttggcccagacaatgtga-3′(SEQIDNo.4)。本发明还在植物(如拟南芥)中过量表达PsRD22基因，发现其所编码的蛋白质能够显著提高其对干旱胁迫的耐性，可用于改良植物的抗逆性。具体地，通过Gateway技术将PsRD22的编码区(不含终止子)重组至植物表达载体pK7FWG2,0，利用花粉管侵染法获得过表达的转基因拟南芥；与拟南芥Col野生型相比，过表达PsRD22的转基因植株具有显著的抗旱性，因而可用于抗逆种质改造。另一方面，本发明还根据PsRD22基因的cDNA序列设计了该基因的表达分子标记GYRD，长度为96bp，其序列如SEQIDNo.5所示，该分子标记可用以检测低温休眠解除过程中PsRD22的表达量，表征休眠解除进程，通过该基因的表达可判断牡丹花芽低温休眠解除的需冷量是否足够，可用于分子辅助低温催化牡丹技术。本发明设计的PsRD22表达分子标记GYRD的扩增引物序列如下：GYRD-F5′-caaacccgaatctccagaagctga-3′(SEQIDNo.6)；GYRD-R5′-gaagttgcgcagtacttgtcctca-3′(SEQIDNo.7)。与低温催化牡丹的现有技术相比，本发明发现了一种在花芽低温休眠解除过程中持续高表达的基因PsRD22，且进一步设计了该基因的表达分子标记GYRD，首次实现了通过表达分子标记来辅助低温催化牡丹技术；同时通过实验证明了该基因所编码的蛋白能够限制提高植物对干旱胁迫的耐性，为牡丹抗逆育种提供了优秀的候选基因。附图说明图1是RD22家族蛋白质序列多重比对图：其中，1号框为信号肽区，2号框为CH重复区，3号框为TXV结构基序，4号框为BURP结构域；图2是RD22家族蛋白质进化树重建：RD22蛋白可以明显聚为2大类，即木本植物组和草本植物组，PsRD22与葡萄的RD22-C蛋白关系最近，同属于木本植物亚类；图3是PsRD22的表达模式分析结果：PsRD22在茎、叶、花和休眠解除过程的花芽中表达较高，在茎尖和休眠芽中度表达，在根中几乎不表达；图4是PsRD22在烟草叶片瞬时表达的定位结果(箭头指示)：PsRD22定位于细胞质中，在气孔附近有较强的信号，标尺50μm；图5是PsRD22在拟南芥中稳定表达的定位结果：PsRD22定位于细胞质中(A，标尺50μm)，在气孔结构的保卫细胞中有较强的荧光信号(B，标尺10μm)；图6是PsRD22转基因植株耐旱性实验：停至浇水10天后，野生型和转基因苗均没有显著的表型差异；停水18天后，野生型已极度枯萎，而转基因系萎蔫程度较弱；然后进行复水，再正常培养10天后，野生型已几乎干枯死亡，而转基因植株恢复生长并且保持较强的生长能力。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式并不限于此。实施例中的牡丹品种为中原品种“洛阳红”，引物制作和测序均由上海生工生物工程有限公司完成。实施例中的主要试剂为：柱式植物RNAout试剂盒购自北京天恩泽科技有限公司；DH5α感受态受体菌购自Solarbio公司；dNTPs、TaqDNA聚合酶、T4连接酶、无RNase的DNaseI、逆转录试剂盒、pMD19-T载体购自TAKARA(大连)；pENTER载体购自Invitrogen公司；PrimeScriptReverseTranscriptase试剂盒SYBRpremixExTaqTM购自Takara公司；pK7FWG2,0购自拟南芥种质中心；切胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；SilwetL-77、质粒回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；琼脂粉、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)等均购自Sigma公司；实施例中所有化学试剂均为进口或国产分析纯。实施例中的主要仪器为：RCR仪(Bio-RadMyCycler)；核酸电泳仪(Bio-Rad)；微量移液器(Eppendorf)；蛋白核酸定量分析仪Nanodrop2000(Thermo)；激光共聚焦显微镜(Zeiss)；LB液体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠分别溶解于蒸馏水中，定容至1000ml；高温灭菌(121℃，18min)后，4℃冷藏保存。LB固体培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、8g琼脂分别溶解于蒸馏水中，定容至1000ml；高温灭菌(121℃，18min)后，倒培养皿平板，4℃冷藏保存。YEB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠分别溶解于蒸馏水中，定容至1000ml；高温灭菌(121℃，18min)后，4℃冷藏保存。实施例1牡丹PsRD22基因的制备及分析方法在研钵中用液氮研磨牡丹花芽至粉末，利用植物RNAout试剂盒，按照要求进行RNA提取。用无RNase的双蒸水充分溶解总RNA。用DNaseI去除可能残留的DNA。用琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA质量，NanoDrop仪器检测RNA浓度及RNA的260纳米和280纳米光吸收值，根据OD260/OD280预测RNA纯度。确定RNA浓度不低于4ng/μL，总量高于20μg，OD260/280在1.8至2.2之间，完整性良好(28S:18S>1.0)，并且无蛋白质和DNA的污染。以获得的RNA为模版进行逆转录，得到cDNA后分装于-20℃冰箱保存备用。根据已获得的PsRD22全长cDNA序列，设计扩增引物：FGSP5′-CACCatggagcttcatctcctgccct-3′(SEQIDNo.3)；RGSP5′-gttgttggcccagacaatgtga-3′(SEQIDNo.4)；50μLPCR反应体系：10μL5×PrimerSTAR反应缓冲液、4μL2.5mmol/LdNTP混合液、1μL模板基因组DNA、2μL10μmol/LFGSP引物、2μL10μmol/LRGSP引物、0.5μL2.5U/μLTaqDNA聚合酶、30.5μLddH2O、石蜡油覆盖。PCR反应条件为：95℃变性2min；再以94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸2min，35次循环；72℃延伸7min。扩增产物经切胶回收后，取50ng与pENTER载体连接。冻融法转化大肠杆菌。取5μL连接产物转化DH5α感受态受体菌，涂板后37℃培养过夜。基于蓝-白筛选法，从LB平板挑取白色阳性克隆，提取质粒DNA后，送公司进行测序分析。用DNAMAN生物软件将PsRD22cDNA序列翻译成蛋白质序列，在SMART以及InterProScan数据库中对该蛋白进行结构域注释，RD22家族蛋白质序列的多重比对结果如图1所示：其中，1号框为信号肽区，2号框为CH重复区，3号框为TXV结构基序，4号框为BURP结构域；用MEGA6.0软件中的最大似然法构建了PsRD22和其他物种已知的RD22或者RD22-like蛋白的系统发生树，如图2所示，RD22蛋白可以明显聚为2大类，即木本植物组和草本植物组，PsRD22与葡萄的RD22-C蛋白关系最近，同属于木本植物亚类。实施例2实时荧光定量PCR检测PsRD22的表达模式取适量植物组织，在研钵中用液氮研磨至粉末，利用植物RNAout试剂盒按照要求进行RNA提取。去除残留DNA、跑胶及定量如实施例1所述。第一链cDNA的合成使用PrimeScriptReverseTranscriptase试剂盒(Takara)。实时荧光定量PCR体系为20μL，包含约100ng的cDNA、0.2μmol/L正反向引物和10μL的2×SYBRpremixExTaqTM(Takara)。扩增程序：95℃预变性30s，之后是40个循环的扩增(95℃5s，60℃40s)。每个扩增进行3次技术重复，并进行2次生物学重复。PsRD22的表达分子标记GYRD的引物序列如下：GYRD-F5′-caaacccgaatctccagaagctga-3′(SEQIDNo.6)；GYRD-R5′-gaagttgcgcagtacttgtcctca-3′(SEQIDNo.7)；以牡丹的β-actin基因作为内参，其正反向引物分别如下：β-actin-F5′-gagagattccgttgccctga-3′；β-actin-R5′-ctcaggaggagcaaccacc-3′；通过2-ΔΔCt计算相对表达量。图3的结果表明：PsRD22在茎、叶、花和休眠解除后的活动芽(低温处理28天)中表达较高，在茎尖和休眠芽中中度表达，在根中几乎不表达。同时在牡丹花芽低温休眠解除过程中，每隔7天对PsRD22的表达量做了分析，其结果如表1所示：RNA-seq法的给出了每百万测序片段中PsRD22出现的数量；定量PCR法以未处理的休眠芽(0天)的PsRD22的表达量为基准，给出了每隔7天后PsRD22的表达量的相对值。表1牡丹花芽低温休眠解除过程中PsRD22的表达分析实施例3牡丹PsRD22基因的亚细胞定位方法(1)PsRD22基因在烟草中的瞬时表达将PsRD22的编码区(不含终止子)克隆至pENTER载体(Invitrogen公司)，取1μL胶回收产物(约20ng)，1μLpENTER载体和0.5μL盐溶液，22℃反应2小时，转化后送公司测序。测序正确的质粒通过LR反应重组：1μL测序正确的质粒、1μL含有35S启动子和GFP的目标载体pK7FWG2、0.5μlLR重组酶，22℃反应2小时，获得重组质粒pK7FWG2-RD22。选取移苗后4-6周的健康烟草，用注射器针头在每个叶片背面扎4-6个小孔，用注射器将转入pK7FWG2-RD22质粒的农杆菌悬浮液注入叶片。注射完需暗培养8小时，再以16小时光照/8小时黑暗的模式培养48-96小时。取注射孔附近的叶片用共聚焦显微镜Zeiss710镜检，镜检的结果如图4所示：其中上行为气孔信号，下行为细胞质定位，每行的三张图片为同一样本在不同视场下的结果，从左到右分别为白光、绿色荧光和前两者的叠加，图中的箭头所指示的位置为强荧光信号处，PsRD22基因在气孔附近有较强的信号，表明PsRD22定位于细胞质中。(2)PsRD22基因在拟南芥中的亚细胞定位将上述pK7FWG2-RD22质粒通过农杆菌介导的花粉管浸泡法转入野生型拟南芥Col。具体如下：待拟南芥花序抽苔约1cm高时，剪去主花序，待植株发出侧生花序，并生长至花蕾未展开时，进行转化实验；接种含有表达载体的农杆菌克隆于5mLYEB液体培养基(含100μg/mL利福平，100μg/mL壮观霉素)中，28℃，200rpm，振荡培养过夜；按1:50的比例转接到200mLYEB液体培养基中，28℃，200rpm培养5h；5000rpm，离心15min，收集菌体；重悬于适量培养液(0.5×MS、5％蔗糖、0.03％SilwetL-77)中。将拟南芥培养钵表面用封口膜加固，将拟南芥花序浸入农杆菌菌液中浸泡1min；取出培养钵并侧置于托盘中，用保鲜膜覆盖，24h后取下保鲜膜，充足浇水并于培养室(22℃，16h(光照)/8h(黑暗))中继续培养，收获T1种子。经100μg/mL卡纳霉素筛选后获得T1代转基因植株，移入土中培养后随机挑取叶片用共聚焦显微镜Zeiss710镜检，镜检结果如图5所示，从图中可知PsRD22定位于细胞质中，在气孔结构的保卫细胞中有较强的荧光信号。实施例4：过表达PsRD22拟南芥的抗旱性分析将单拷贝插入转基因纯合的T2代拟南芥种子中，灭菌后播于含50μg/mLKan的1/2MS培养基平板上，放入4℃冰箱中3天，后放入光照培养箱中(22℃，16h(光照)/8h(黑暗))培养7-10天。选择经过Kan筛选后长势良好、真叶叶片及生长点呈深绿色且根部可以扎入培养基的植株，移栽入土中，同时移栽同时期的野生型Col。正常培养至生殖生长起始，然后停止浇水进行耐旱性实验：停止浇水10天后，野生型和转基因苗均没有显著的表型差异；停水18天后，野生型已极度枯萎，而转基因系萎蔫程度较弱；然后进行复水，再正常培养10天后，野生型拟南芥已几乎干枯死亡，而转基因拟南芥植株恢复生长并且保持较强的生长能力，如图6所示。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。