本申请是原申请的分案申请，原申请的申请日为：2013.11.08；申请号为：201310554389.X；发明创造名称为：被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。技术领域本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。
背景技术：
早在19世纪90年代，美国肿瘤医生Coley发现将细菌粗提取物应用于900名长期肿瘤患者,有40％患者肿瘤能自行消退,当时人们认为是细菌粗提取物中的脂多糖起到活性作用，并未引起足够重视。后来，用卡介苗(BacillusCalmette-Guerin,BCG)进行的小鼠体内实验发现，用DNA酶处理过的BCG不具有抗肿瘤作用，说明细菌DNA才是介导这种抗肿瘤效应的物质[Tokunaga,T.,etal.,AntitumoractivityofdeoxyribonucleicacidfractionfromMycobacteriumbovisBCG.I.Isolation,physicochemicalcharacterization,andantitumoractivity.JNatlCancerInst,1984.72(4):955-62]。随后，研究者证实细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用[Yamamoto,S.,etal.,DNAfrombacteria,butnotfromvertebrates,inducesinterferons,activatesnaturalkillercellsandinhibitstumorgrowth.MicrobiolImmunol,1992.36(9):983-97]。Pisetsky课题组报道了纯化的细菌DNA(bDNA)和poly-(dG,dC)可以诱导B细胞增殖并分泌抗体，而哺乳动物的DNA不能[Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,andD.S.Pisetsky,StimulationofinvitromurinelymphocyteproliferationbybacterialDNA.JImmunol,1991.147(6):1759-64]。随后，研究者发现poly-(dG,dC)中胞嘧啶的甲基化会导致丝裂原活性丧失[Messina,J.P.,G.S.Gilkeson,andD.S.Pisetsky,TheinfluenceofDNAstructureontheinvitrostimulationofmurinelymphocytesbynaturalandsyntheticpolynucleotideantigens.CellImmunol,1993.147(1):148-57]。但是当时的研究者并没有把CpG的甲基化与细菌和哺乳动物DNA的不同免疫活性联系起来，他们只是猜测甲基化破坏了bDNA的高级结构。通过用合成的寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)进行的实验研究，发现细菌DNA具有免疫刺激作用是由于其中含有具有特异性侧翼序列的非甲基化CpG核苷酸基序[Yamamoto,T.,etal.,LipofectionofsyntheticoligodeoxyribonucleotidehavingapalindromicsequenceofAACGTTtomurinesplenocytesenhancesinterferonproductionandnaturalkilleractivity.MicrobiolImmunol,1994.38(10):831-6]。与细菌DNA不同，哺乳动物和其他脊椎动物DNA分子中CpG基序出现的频率很低，并且60％～90％的CpG基序中胞嘧啶的第五碳原子发生甲基化，因此，哺乳动物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用[Barton,G.M.,J.C.Kagan,andR.Medzhitov,IntracellularlocalizationofToll-likereceptor9preventsrecognitionofselfDNAbutfacilitatesaccesstoviralDNA.NatureImmunology,2006.7(1):49-56]。ArthurM.Krieg等人通过分析合成的不同序列CpGODN的免疫刺激活性，初步得出免疫刺激性CpGODN结构的基本规律：序列必须含有非甲基化的CpG基序；CpG基序的基本结构为5'-X1X2CGY1Y2-3'，其中X1代表一个嘌呤，X2代表一个嘌呤或者一个胸腺嘧啶，Y1和Y2代表嘧啶。在一个CpGODN中可以有一个或者多个CpG基序，CpG基序两侧特异的嘌呤和嘧啶，以及CpG基序间相隔碱基的不同都会影响CpG基序的免疫刺激类型和强度[Krieg,A.M.,etal.,CpGmotifsinbacterialDNAtriggerdirectB-cellactivation.Nature,1995.374(6522):546-9；Krieg,A.M.,CpGmotifsinbacterialDNAandtheirimmuneeffects.AnnualReviewofImmunology,2002.20:709-760；Krieg,A.M.,G.Hartmann,andA.K.Yi,MechanismofactionofCpGDNA.ImmunobiologyofBacterialCpg-DNA,2000.247:1-21]。人体免疫系统能够发现病原体感染，并对感染进行归类以产生不同的细胞效应，关键的结构是免疫细胞(如T细胞，B细胞)上具有的特异的、高亲和力的抗原受体，称为模式识别受体(pattern-recognitionreceptor,PRR)。PRR能与病原体上面的抗原相结合，这些抗原被统称为病原体相关模式分子(pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP)。含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸就是PAMP之一。迄今为止，人们共发现了四种类型的CpGODN：D型(或A型)，K型(或B型)，C型和P型，每种类型都有独特的结构和生物功能特点。它们被分布在细胞内质网上的TLR9识别，而表达TLR9的,小鼠体内主要是单核细胞、巨噬细胞、mDC细胞、pDC细胞和B细胞，人体内主要是后两种[Klinman,D.M.,Currie,D.,Gursel,I.&Verthelyi,D.UseofCpGoligodeoxynucleotidesasimmuneadjuvants.ImmunologicalReviews199,201-216(2004)]。因此CpG寡聚脱氧核苷酸能直接刺激这些细胞,并间接激活T细胞、自然杀伤细胞，诱导以Th1型为主的免疫应答，而最新的研究的表明它可以直接抑制mMDSC细胞[Y.Shirota,H.Shirota,D.M.Klinman,Journalofimmunology2012,188,1592-1599]，被公认为一种新型的高效低毒的免疫佐剂或者免疫治疗药物，在治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病、及癌症肿瘤中有着强大的潜在应用价值，正受到越来越多科学家的关注。目前对CpG寡聚脱氧核苷酸的骨架全硫代或者部分硫代修饰，能够部分解决CpG寡聚脱氧核苷酸被核酸酶水解的问题，但依然存在生物利用度不高的问题，因此本发明对CpG寡聚脱氧核苷酸进行小分子修饰以解决这一问题，特别是口服给药的生物利用度。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途。本发明的结构修饰的CPGODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能。第一方面，本发明涉及一种被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸，所述修饰分子选择下式中的一种：优选地，所述寡聚脱氧核苷酸含有1-5个CpG单元，其链长为10-30nt。优选地，所述修饰分子修饰的位点是寡聚脱氧核苷酸的5’-末端、3’-末端或者中间位置。优选地，所述寡聚脱氧核苷酸含有如下序列中的一种：组别序列(5’-3’)CpG1826tccatgacgttcctgacgttCpG-H1826tccatgtcgttcctgtcgttCpG-7tgacgttccgttCpG-H7TgtcgttccgttCpG-8atgacgttgcgttCpG-H8atgtcgttgcgttCpG-13tccatgacgttcctgacgttcctgacgttCpG-H13tccatgtcgttcctgtcgttcctgtcgttCpG7909(2606)tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt在临床应用中，鼠敏感的CpG1826、CpG-7、CpG-8、CpG-13，按照已知的理论可以转换成人敏感的序列CpG-H1826、CpG-H7、CpG-H8、CpG-H13。优选地，所述寡聚脱氧核苷酸的骨架为全硫代修饰、部分硫代修饰或者无硫代修饰。第二方面，本发明涉及一种如前述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为免疫增强剂的应用。第三方面，本发明还涉及一种如前述的被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸作为治疗肿瘤的口服或者吸入制剂的应用。本发明具有如下的有益效果：本发明涉及一种经结构修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)，由特定组合的肽段、特定链长的脂肪酸、或类脂结构修饰具有免疫调节功能的CpGODN而得。这种结构修饰的CPGODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能，可以作为口服免疫增强和免疫治疗药物，提高生物体对抗原的免疫应答，应用于过敏性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌症等。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为不同反应条件的click反应PAGE图；图2为不同反应条件的click反应PAGE图和纯化过的偶联物PAGE图；图3为叠氮月桂酸和炔基修饰CpGODN的CuAAC反应图；图4为不同链长CpG的体外免疫刺激效果图；图5为四种二肽结构图；图6为CpG和四个二肽修饰的CpG初次免疫后第14天小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；图7为CpG和四个二肽修饰的CpG初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；图8为CpG和四个二肽修饰的CpG不时间点的小鼠血清抗体浓度及IgG2a/IgG1比值图；图9为不同剂量CpG、CpG-LP初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度图；图10为CpG、CpG-SA、CpG-LA初次免疫后第21天小鼠血清抗体浓度图；图11为CpG、CpG-SA、CpG-LA初次免疫后第28天小鼠血清抗体浓度图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。实施例1、叠氮和炔基浓度、催化剂、反应时间对CuAAC反应的影响选择一个二肽AF来进行反应条件的优化，优化出的方法可以推广到其它小分子与CpGODN的click反应。所有反应条件改变的前提都是反应在室温震荡下进行。表1不同浓度叠氮、炔基，不同比例催化剂和不同反应时间试验设计图1为不同反应条件的click反应PAGE图，(a)和(b)中，M代表20bpDNAmarker，lane1为未经修饰的CpGODN；按照表1的设计进行PAGE电泳；图1(a)中的反应条件是参照经典小分子click反应的条件[Rostovtsev,V.V.,etal.,Astepwisehuisgencycloadditionprocess:copper(I)-catalyzedregioselective\ligation\ofazidesandterminalalkynes.AngewChemIntEdEngl,2002.41(14):2596-9]，CpGODN5nmol(34μl)，AF50nmol(8.5μl)，CuSO40.005nmol(1μl)，sodiumascorbate0.5nmol(1μl)，三乙胺乙酸缓冲液300μl，lane3组反应加入了TBTA0.5nmol(6.75μl)，而lane2组没有加入TBTA，两组反应都反应24小时。反应体系中CpGODN的浓度是0.014mM。从PAGE结果来看，lane2，lane3和lane1相比位置没有明显差异，说明click反应没有进行，没有偶联物的产生。说明适用于小分子click反应的条件对于大分子来说行不通。提高炔基与叠氮在反应体系中浓度，同时将CuSO4的用量从原来CpGODN的1/100提高到CpGODN的20倍，TBTA和sodiumascorbate从原来CpGODN用量的1/10提高到CpGODN的40倍，并减少缓冲液的体积，这样反应体系中CpGODN的浓度为0.1mM。申请人考察了TBTA和反应时间对click反应的影响，得到了图1(b)。图1(b)中，lane2，lane4，lane6的反应体系中没有加入TBTA，而lane3，lane5，lane7的反应体系中加入TBTA；lane2与lane3反应时间为6小时，lane4与lane5反应时间为12小时，lane6与lane7反应时间为24小时。图1(b)中的六组反应基本都有两个条带，而且位置与lane1的未经修饰的CpGODN有明显差异，与图1(a)对比，申请人发现，当CpGODN和AF在反应体系中的浓度提高后，且催化剂与CpGODN的比例提高后，click反应发生，偶联产物出现，偶联产物在PAGE中的的条带高于未经修饰的CpGODN的条带。这个结果说明高浓度的CpGODN和多肽，高比例的催化剂，尽可能少的溶剂体积，对click反应的进行极为有利。图1(b)中lane3，lane5，lane7与lane2，lane4，lane6的条带相比明显清晰，这显示出TBTA对CpGODN的click反应是不可或缺的。而且lane2，lane3与lane4，lane5和lane6，lane7两组相比，条带更加清晰，12小时和24小时并没有显示出更高的转化率，所以申请人根据选择实验安排选择6小时或者过夜12h反应。PAGE过程：(1)制胶原料和用量：4.2g的尿素，1mlTBE缓冲液，4.44ml丙烯酰胺，40ulAP，4ulTBMB。注意制胶的时候不要有尿素析出。(2)将配好的胶液快速加入已准备好的玻璃板中,待1个小时左右，等胶凝好之后加入TBE缓冲液，加过缓冲液后，要保证缓冲液不会漏出来，之后上样。等胶凝固期间可配制样品。上完样品后打开电泳仪，开始跑胶，大约三四个小时后，即样品已经到胶体边缘的时候，停止电泳。将胶取下，放入表面皿，加入染色剂supergreen开始染色，大约染半个小时左右的时候，将胶取出，显影。实施例2、叠氮小分子与CpGODN的比例及反应缓冲液对CuAAC反应的影响确定了最佳反应时间，明确了TBTA的作用，优化了CpGODN与AF的浓度及催化剂的比例后，考察AF与CpGODN的不同比例及反应缓冲液对click反应的影响，并确定偶联产物的纯化方法。表2不同缓冲液，AF与CpGODN不同比例的试验设计图2为不同反应条件的click反应PAGE图和纯化过的偶联物PAGE图(a)和(b)中，M代表20bpDNAmarker，lane1为未经修饰的CpGODN；(a)按照表2的设计进行电泳；(b)纯化方法的PAGE验证，lane3为纯化过的CpG-AF；图2(a)中，lane2，lane3的反应体系中加入了2MpH7.0的三乙胺乙酸缓冲液，lane4，lane5的反应体系中没有缓冲液；lane3，lane5的反应体系中二肽与CpGODN的比例为50:1，而lane2，lane4的反应体系中AF与CpGODN的比例为10:1，其他反应条件均与前面筛选出来的条件一致。四组实验综合比较，申请人看出lane3的反应效率最高，这说明缓冲液和高的AF与CpGODN比例对click反应有利。所以申请人选择50:1作为AF与CpGODN的反应比例，同时确定了CpGODN与AF的click反应需要三乙胺乙酸缓冲液。用丙酮沉淀法来纯化click产物。具体方法为：向反应体系中加入5倍反应体积的丙酮，充分涡旋混匀，放于-20℃冰箱中30分钟。4℃，10000rpm，离心20分钟，弃掉上清，再加入1ml丙酮，反复吹打，清洗析出的固体，然后4℃，10000rpm离心20分钟，再弃掉上清，干燥得到的固体，固体再用超纯水溶解，用3,500Da的透析袋4℃透析过夜，透析结束样品冻干。申请人将用此方法纯化图2(a)中lane3的反应组，并将得到的CpG-AF进行PAGE验证，得到图2(b)，lane2是纯化后的CpG-AF，lane1是未经修饰的CpGODN，可以看出lane2与lane1有明显的位置差异，而且反应产率很高，经过click反应得到的CpG-AF稳定，基本没有降解情况发生。实施例3、上述CuAAC反应条件应用于其他小分子以脂肪酸月桂酸为例，图3为叠氮月桂酸和炔基修饰CpGODN的CuAAC反应示意图；反应物储备液配置；①0.5mM炔基修饰CpGODN储备液：先将装有炔基修饰CpGODN粉末的离心管离心。每管含有CpGODN25nmol，加入50μl的超纯水，震荡使混合均匀，-20℃贮存。②0.02M叠氮月桂酸储备液:2.3mg叠氮月桂酸，加入353μlDMF，震荡溶解，密封4℃保存。③4mMTBTA储备液：称取4.2mgTBTA粉末，溶解于2mlDMF中，震荡使混合均匀，-20℃贮存。④0.5mMCuSO4储备液：称取12.5mgCuSO4·5H2O，溶解于1ml超纯水中，现用现配。⑤0.2MSodiumAscorbate储备液：称取16mg抗坏血酸钠粉末，溶解于400μl超纯水中，现用现配。⑥2M三乙胺乙酸缓冲液：混合2.78ml三乙胺和1.14ml乙酸，加入超纯水定容至10ml，调节pH至7.0，室温贮存。在0.5ml离心管中加入依次加入1μl储备液④、26μl储备液③、5μl储备液⑥、5μl储备液①、5μl储备液②、1μl储备液⑤，每加入一种新物质vortex，全部加完后密闭，恒温振荡器室温震荡反应过夜。实施例4、不同链长的CpG寡核苷酸序列体外免疫效果差异1.脾细胞的体外收集与培养：取8周Balb/c小鼠一只，脱颈法处死，75％酒精浸泡5分钟。解剖小鼠，打开腹腔，取出脾脏。将脾脏放于细胞筛上，加入PBS，研磨。吸管收集研磨后的液体，加入离心管，4度1400rpm离心5min。离心后，弃去上清液，加入5ml红细胞裂解液，重悬，4度1400转离心5分钟，弃去上清液，重复此步骤至管底细胞为白色。用1640培养基，重悬细胞，吸取10μl滴入细胞计数板，显微镜下细胞计数。加入到96孔板中。将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱内分别培养2h。2.样品溶液制备：用PBS配制浓度相同的如下表3所示的CpG的溶液；表33.细胞给药：取出样品溶液加入到96孔板中，每个样品三个复孔。恒温细胞培养箱中，37度，CO2浓度5％培养24小时后，4℃，1400rpm离心5mim，收集上清液用于ELISA测定。4.结果：通过上结果可以看出，不同链长的CpG刺激脾细胞分泌IL-6存在差异，与空白组相比，CpG1826,CpG-7,CpG-8,CpG-13,CpG2006刺激脾细胞分泌IL-6的表达有了显着性提高；图4为不同链长CpG的体外免疫刺激效果图。实施例5、不同骨架修饰的CpG寡核苷酸序列免疫效果的差异1.脾细胞的体外收集与培养：取8周Balb/c小鼠一只，脱颈法处死，75％酒精浸泡5分钟。解剖小鼠，打开腹腔，取出脾脏。将脾脏放于细胞筛上，加入PBS，研磨。吸管收集研磨后的液体，加入离心管，4度1400rpm离心5min。离心后，弃去上清液，加入5ml红细胞裂解液，重悬，4度1400转离心5分钟，弃去上清液，重复此步骤至管底细胞为白色。用10ml1640培养基，重悬细胞，吸取10μl滴入细胞计数板，显微镜下细胞计数。加入96孔板中，将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱内分别培养2h。2.样品溶液制备：用PBS配制浓度相同的不同骨架修饰的CpG的溶液，包括全硫代修饰，部分硫代修饰，无硫代修饰的CpG.3.细胞给药：取出不同浓度的样品溶液5μl,加入到96孔板中，每个样品三个复孔。恒温细胞培养箱中，37度，CO2浓度5％培养24小时后，4℃，1400rpm离心5mim，收集上清液用于ELISA测定。4.结果：通过上结果可以看出，不同骨架修饰的CpG刺激脾细胞分泌IL-6存在差异，全硫代修饰组的刺激效果最好。但是与空白组相比，不同骨架修饰的CpG刺激脾细胞分泌IL-6的表达有了显着性提高。实施例6、小分子修饰的CpGODN的胃肠稳定性模拟胃消化液：称取20mgNaCl、100mg胃蛋白酶，加入7ml去离子水、73μl浓盐酸，再用盐酸调PH至1.2，加水定容至10ml，现用现配。模拟肠消化液:称取70mgKH2PO4溶于2.5ml去离子水，完全溶解后，加入100mg胰酶，调PH至7.5，加水定容至10ml。将小分子修饰的CpGODN加入到模拟胃消化液和肠消化液中，37℃恒温震荡分别0.5h和2h，跑胶显示均未见明显降解，小分子修饰的CpGODN具有良好的胃肠稳定性。实施例7、二肽修饰后CpGODN作为免疫增强剂的效果差异四种二肽结构见图5所示；免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μgOVA(溶于100μlPBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpGODN或CpG-dipeptide(未特别注明均是100μg)。血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色。保存至-20℃；ELISA检测小鼠血清抗体水平：申请人通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG2a，IgG1三种抗体的水平。结果：四种二肽修饰的CpGODN对小鼠血清特异性抗体的影响：CpG-LP剂量对小鼠血清特异性抗体水平的影响：综上所述，AF、LP修饰后的CpG具有更好的免疫增强效果，具体参见图6，7，8，9。实施例8、硬脂酸和月桂酸修饰后CpGODN作为免疫增强剂的效果差异免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μgOVA(溶于100μlPBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpGODN或CpG-FA(未特别注明均是100μg)。血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色；保存至-20℃。ELISA检测小鼠血清抗体水平：通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG1两种抗体的水平。硬脂酸和月桂酸修饰后的CpG具有更好的免疫增强效果，具体可见图10和图11。实施例9、比较胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰后CpGODN作为免疫增强剂的效果差异免疫方案：在第0天对小鼠进行初次免疫，第7天和14天加强免疫，每次免疫先对小鼠腹腔注射10μgOVA(溶于100μlPBS中)，然后灌胃口服一定剂量的CpGODN或修饰后的CpG。血样收集：在不同的时间点进行血样收集，用于免疫效果评价。特别指出在，第14天，第三次免疫之前，先收集血样，用来评价第二次免疫的免疫效果。取血的方法为眼眶后静脉丛取血。收集的血样通过室温离心(3000rpm，10min)，取上清，如仍然有血色，可重复离心过程，直到完全无血色。保存至-20℃；ELISA检测小鼠血清抗体水平：通过ELISA方法主要检测小鼠血清中IgG，IgG1两种抗体的水平。结果：胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpGODN相对于未修饰的CpGODN，小鼠血清抗体IgG、IgG1水平都不同程度地提高。实施例10、比较四个二肽修饰的CpGODN对肿瘤生长抑制作用的差异模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：二肽AF、LP修饰的CpGODN均有不同程度的抗肿瘤活性。实施例11、比较硬脂酸、月桂酸修饰的CpGODN对肿瘤生长抑制作用的差异模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：硬脂酸、月桂酸修饰的CpGODN的CpGODN均有不同程度的抗肿瘤活性。实施例12、比较胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpGODN对肿瘤生长抑制作用的差异模型建立：BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系4T1-PGL3培养于含10％FBS，1％双抗的RPMI1640培养基中，37℃，5％CO2，待单层细胞片层达到90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代。收集对数生长期的4T1细胞，PBS洗1次，细胞计数。BALB/c小鼠的左上侧乳腺皮下以5*105细胞/只种瘤。待肿瘤长到直径有5mm左右开始给药。肿瘤生长观察：观察肿瘤增长情况，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积(V＝)1/2*长*宽2。一个月后结束观察。结果：胆酸、胆固醇、甘氨酸胆酸酯盐、牛磺酸胆酸酯盐修饰的CpGODN均有不同程度的抗肿瘤活性。综上所述，本发明涉及的经结构修饰的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)，由特定组合的肽段、特定链长的脂肪酸、或类脂结构修饰具有免疫调节功能的CpGODN而得。这种结构修饰的CPGODN具有更好的口服生物利用度以及免疫调节功能，可以作为口服免疫增强和免疫治疗药物，提高生物体对抗原的免疫应答，应用于过敏性疾病、传染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌症等。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。