一种膜醭毕赤酵母菌株其生物菌剂的制备方法及其应用与流程

本发明属于农业技术领域，本发明公开了一种膜蹼毕赤酵母菌株其生物菌剂的制备方法及其应用。

背景技术：

目前好氧发酵堆肥生产商品有机肥仍是我国农业废弃物(主指畜禽粪便)最主要的处置利用方式，其设施简便、处理量大、周期短、生产成本相对较低，畜禽粪等农业废弃物经无害化高温发酵堆腐后，含水率大幅度降低、有害病原微生物基本杀灭，运输和施用都较为方便，但有机肥产品质量需要符合《NY 525-2012有机肥料》标准，而采用的畜禽粪等原料在堆肥过程中会挥发产生大量氨气及其他恶臭气体，使得废弃物处置场地及工人实际工作环境很差，对周边环境造成不良影响，处理后的物料氮素损失较大，影响有机肥产品品质进一步提升；目前，国内对农业废弃物(主指畜禽粪便)的处置中产生的氨挥发及恶臭问题仍以调酸及通风、抽滤吸附等措施为主，但其氮素损失及臭气污染环境问题依然存在，因此开发微生物菌剂用于的农业废弃物处置保氮除臭技术受到业内广泛关注。

含氮量较高的物质在堆肥过程中常伴有氮损失，这不仅会造成营养元素的流失，还会导致周边环境的污染。目前针对堆肥氮素损失控制的微生物菌剂的开发与研制还较少见。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种用于农业废弃物处置与利用中保氮除臭的膜蹼毕赤酵母，本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。本发明提供的膜蹼毕赤酵母及其微生物菌剂，繁殖适应性强，能减少农业废弃物处置中氮的挥发或损失，农业废弃物堆肥物料中总氮有所增加，且能促进物料保氮除臭；改善农业废弃物处理及利用效果。

本发明第一目的在于提供一种用于农业废弃物处置与利用中保氮除臭的膜蹼毕赤酵母菌株和含有该膜蹼毕赤酵母的微生物菌剂，及其在农业废弃物处置上的应用及其微生物菌剂。

本发明第二目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第三目的在于提供上述膜蹼毕赤酵母菌株及其微生物菌剂在农业废弃物处置堆肥过程中的应用。

培养和纤维形态特征：麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞卵形、椭圆形、腊肠形，大小为(5.7-11.3)×(3.6-4.4)μm，有沉淀形成，芽殖。麦芽汁琼脂斜而25℃培养一个月，菌落表面细皱，粗糙暗淡，灰白色，无光泽，边缘树根状。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，产生假菌丝。

理化特征如表1所示：

表1

菌株生理特征：见鉴定证书。

rRNA基因D1D2区序列测定结果如下：

AAATCGTGCCAATTTTTTTGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTTTGTGGAGCACGGTGTCCAAGTCCC

TTGGAACAGGGCGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGTCGTGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTT

GTTTGGGAATGCAGCTCCAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTA

CTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGC

CCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGC

GGGAGAATGGGTGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGCGCCAGATACCGCGTGCGGGGACCGAGGACTGC

GGCTTCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTT

其具体技术方案为：

一种膜醭毕赤酵母菌，菌株已于2016年1月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.12112；分类命名为Pichia membranifaciens。

进一步，所述膜蹼毕赤酵母菌的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述膜蹼毕赤酵母菌在农业废弃物处置堆肥过程中的应用。

一种利用本发明所述膜蹼毕赤酵母菌制备的微生物菌剂，所述微生物菌剂为或固体菌剂，由膜蹼毕赤酵母菌和及其培养物组成；其活性成分为膜蹼毕赤酵母酵菌体和它的胞外代谢产物。

优选地，所述微生物菌剂其内含有的膜蹼毕赤酵母菌的活菌数大于5.0×10⁷cfu/g或5.0×10⁷cfu/ml。

本发明所述微生物菌剂在农业废弃物处置堆肥过程中的应用。

一种本发明所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)保藏物膜蹼毕赤酵母菌接种到糖蜜和葡萄糖固体斜面，实施斜面活化培养；

(2)液体培养基扩培，获取种子液；

(3)将扩培后的对数期种子液，按照2％的接种量接种至发酵扩大固体培养基质或培养液中，充分搅拌混匀后，在28℃培养2-3d，培养结束后用于堆肥试验及生产应用。

优选地，采用所述对数期种子液固体培养基质，选择半发酵腐熟的酒糟、菇渣及麦麸，并加入10％的麸皮和1％的酵母膏，调节含水率至40％-50％，在28℃培养5-7d，培养结束后用于堆肥试验及生产应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的膜蹼毕赤酵母及其微生物菌剂，繁殖适应性强，能减少农业废弃物处置中氮的挥发或损失，处置场地周边的环境有所改善，农业废弃物堆肥物料产品中总氮有所增加，且能促进物料保氮除臭；改善农业废弃物处理及利用效果。

附图说明

图1是不同比例保氮除臭菌剂对猪粪蝇蛆养殖处理氨挥发的影响；

图2是蝇蛆养殖过程保氮菌剂对氨挥发的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

保氮除臭试验：喷洒保氮菌剂(膜蹼毕赤酵母菌株制备的微生物菌剂)试验设4个处理，即对照CK(自来水)、处理T1(稀释100倍菌剂)、处理T2(稀释10倍的菌剂)和处理T3(菌剂原液)，试验在养殖处理大棚中进行。每个处理池宽2.25m，长4米，处理间间隔2m；直接将等量猪粪400kg倒入池内摊平，猪粪物料用挤压粪及麦麸调整至含水率65％左右，上层铺撒2cm厚挤压粪，物料总厚度6-8cm，保氮菌剂施用量为1％(V/W)，均匀喷洒在物料表面，然后将蝇蛆幼虫按7.5‰(w/w)接种量均匀撒在各处理猪粪物料中。定时定点测定各处理的氨挥发量，每个处理测定3个点，测定时间为每天早上10：30至11点之间；在猪粪蝇蛆养殖后第四天和第五天各按保单菌剂试验设计再喷洒一次，并测定喷洒菌剂后各处理的氨挥发量，试验周期为6天。

实施例2

养殖物料中氨挥发量的测定方法：根据铵态氮测定原理，氨挥发的量可被固定体积的硼酸吸收液(内含特定甲基红与溴甲酚绿指示剂，为酒红色)吸收，氨被硼酸溶液吸收后，硼酸溶液由红色逐渐转为绿色，吸收氨的量越多吸收液的绿色越深，然后用标准酸滴定硼酸吸收液至酒红色，根据滴定所消耗的标准酸的用量即可计算出硼酸中吸收氨的总量。试验时定时定点在各蝇蛆养殖处理池中的养殖蝇蛆处理物料表面悬空放置3个特定的氨挥发收集容器(广口，内含250ml硼酸溶液，保证硼酸溶液足够量以避免氨吸收达到饱和，可密闭运输)，分别用固定体积的封闭容器(口大底小)倒扣在装有硼酸溶液的氨挥发收集容器的物料上，该容器不与氨挥发收集容器接触，而与养殖蝇蛆处理物料表面相密合。吸收氨气测定时间为1小时/天，吸收完成后取出吸收装置密闭保存，用作测定氨挥发量。在蝇蛆养殖的全过程中按蝇蛆生长的规律设定测定的频度。

猪粪蝇蛆脱水处理过程中保氮菌剂应用效果显示(图1)：整个蝇蛆养殖过程中，氨挥发量是一个从低到高再下降的过程，养殖4天时，氨挥发量到达最大值；保氮菌剂对于降低猪粪蝇蛆处理过程中的氨挥发量效果是显著的，喷施菌剂原液(T3)、稀释10倍(T2)和稀释100倍(T1)处理均比对照处理氨挥发量有所减少，呈现一定的变化规律，原液保氮效果最好，稀释10倍(T2)的次之，稀释100倍(T1)的再次之；喷施菌剂原液的T3处理单位时间单位面积氨挥发量总体下降明显，在峰值(4天)时比对照单位时间单位面积氨挥发量减少39.52％，在整个蝇蛆养殖处理6天周期内，氨挥发量明显减少，且变化平稳；整个猪粪蝇蛆脱水处理过程随着蝇蛆逐渐长大，几个处理猪粪中氨挥发量逐渐变化减小而趋于一致。

在猪粪蝇蛆养殖过程中第4天和第五天，分别进行了保氮菌剂喷撒前后不同处理的氨挥发量测试(图2)，在喷洒相同液体情况下，喷洒保氮菌剂均比不喷洒菌剂的氨挥发量有显著减少，喷洒水也有一定的减少氨挥发的效果；蝇蛆养殖第4天的各试验处理均比养殖第5天的氨挥发量大，而不同处理单位面积单位时间氨挥发量的排序为CK＞T1＞T2＞T3，说明保氮菌剂的保氮效果还是较为明显的，且菌剂浓度越高，氨挥发量越小，保氮效果越好。

实施例3氮损失情况

猪粪经蝇蛆养殖后堆肥过程中物料理化性质变化及保氮菌剂(膜蹼毕赤酵母菌株制备的微生物菌剂)保氮除臭试验氮损失情况如表2所示。

表2

由表1可得，在堆肥6天后，T3和T2处理氮损失比T0处理氮损失分别减少29.61％和4.79％，而T2T1处理氮损失较多，可能与初始氮含量较高相关。堆肥28天后，T3和T2处理氮损失比T0处理氮损失分别减少21.7％和4.79％，而49天后，T3和T2处理氮损失比T0处理氮损失分别减少14.18％和4.26％。说明保氮除臭菌剂对保氮具有一定的效果。而且堆肥时间越长，氮损失越多，由发芽指数试验可知，本堆肥在28天，堆肥已腐熟，因此，本物料在堆置28天后即应停止堆肥，否则过度发酵，造成堆肥物料碳氮损失。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。