一种基于他克林结构的硫化氢供体化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种基于他克林结构的硫化氢供体化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种发病隐匿、进行性发展的复杂神经系统退行性疾病，主要病理特征为神经元丢失、突触损伤及胆碱能系统受损等，严重影响患者的学习记忆及运动能力。目前临床上治疗AD的药物主要是基于胆碱能假说而研究开发出来的乙酰胆碱脂酶抑制剂(AChEIs)。该类药物的作用机制是通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)，提高患者脑内乙酰胆碱(ACh)水平，从而提高患者的记忆和认知能力，明显改善患者神经精神症状。

他克林是第一个被美国FDA批准上市的乙酰胆碱脂酶抑制剂，它可以透过血脑屏障，进入大脑抑制AChE，阻碍突触间隙中ACh神经递质的降解，提高ACh水平，从而改善患者的学习记忆能力。但他克林严重的肝毒副作用限制了它的临床应用。

在有关AD的各种病理假说中，炎症反应学说也为人们普遍接受：认为中枢系统神经炎症是诱导AD发生的重要因素且是参与其发展的重要环节；同时持续的炎症还会加重突触可塑性损伤，使AD患者病情加重。大量研究发现AD患者脑中促炎症细胞因子过多，其参与AD神经变性过程，损伤大脑神经元，促使神经元大量丢失，进而出现神经退行性病变。抗炎药物就是基于炎症学说研发出来的AD临床治疗的另一种药物，但其只能延缓疾病的发展。

无论是他克林还是抗炎药物，其作用机制都是单一的，在AD治疗中都只是针对单个靶点作用，治疗效果不显著。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种基于他克林结构的硫化氢供体化合物，既能克服他克林使用过程中的肝脏毒性，又具有乙酰胆碱酯酶抑制作用和抗炎性作用。

本发明的目的之二是提供上述基于他克林结构的硫化氢供体化合物的制备方法，步骤简单。

本发明的目的之三是提供上述基于他克林结构的硫化氢供体化合物的应用。

为实现上述目的，本发明的一种基于他克林结构的硫化氢供体化合物，其具有下述式III所示的结构，

本发明提供的基于他克林结构的硫化氢供体化合物的制备方法，包括以下步骤：1)将二烯丙基二硫加入搅拌中的乙醚甲醇混合溶液中，然后加入溶于乙醚中的3-巯基丙酸，再加入氢氧化钠溶液，N₂保护下室温搅拌24h，制得硫化氢供体4,5-二硫代-7-辛烯酸；

2)冰浴条件下将邻氨基苯甲酸分批加入到三氯氧磷及环己酮混合液中，110℃回流3h，发生环化反应制得式I化合物；

3)将式I化合物溶于正戊醇中，再加入丙二胺，145℃回流18h，发生亲核取代反应制得式II化合物；

4)冰浴条件下将硫化氢供体4,5-二硫代-7-辛烯酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于无水二氯甲烷中，然后加入1-羟基苯并三氮唑(HOBT)，搅拌1h后再依次加入式II化合物和三乙胺，继续冰浴搅拌30min，然后撤去冰浴室温反应12h，发生酸胺缩合再经柱层析制得式III化合物。

上述步骤1)至4)的反应路线及式I、II、III化合物的结构为：

步骤2)中，所述的邻氨基苯甲酸通过以下步骤制得：将邻硝基苯甲酸溶于1mol/L的稀盐酸溶液中，氢氧化钠调节pH至4.0～4.5，室温下分批加入经盐酸活化的铁粉，50℃搅拌2h制得。

步骤4)中，所述的柱层析的条件为二氯甲烷：甲醇＝20:1，体积比。

本发明提供一种药物组合物，以基于他克林结构的硫化氢供体化合物或其药学上可接受的盐为活性成分。所述药学上可接受的盐是指任何药用盐。本发明提供的化合物含有碱的部分，药用盐可以通过游离碱形式的式III化合物与化学计算得到的适当酸在水或者有机溶剂中制备。通常情况下，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇为优选溶剂。其中药用盐可以是：无机酸成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐；或有机酸成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、乳酸盐、水杨酸、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐和对甲苯磺酸盐。

本发明还提供一种药物制剂，包括(1)作为活性成分的基于他克林结构的硫化氢供体化合物或其药学上可接受的盐，(2)药学上可接受的添加剂或载体。所述药物制剂的剂型有固体口服制剂，包括片剂、肠溶片、分散片、口崩片、咀嚼片、胶囊或颗粒剂等；液体口服制剂，包括口服溶液剂；注射剂，包括注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明的基于他克林结构的硫化氢供体化合物或其药学上可接受的盐可用于制备治疗、改善或预防阿尔茨海默病及其相关的神经退行性疾病的药物。

本发明将他克林与硫化氢供体结构片断采用合理药物设计思想进行拼合，一方面保持了他克林的乙酰胆碱酯酶抑制活性；另一方面通过硫化氢供体基团抑制中枢神经炎症作用进一步提高或改善学习记忆能力。另外神经炎症的改善也能促进突触可塑性损伤的修复，同时通过对毒性基团的修饰并利用硫化氢的保肝作用降低了肝脏毒性。

本发明的制备方法简单，反应条件温和，能耗低，可进行工业化生产。本发明的基于他克林结构的硫化氢供体化合物或其药学上可接受的盐为临床提供了新一代多功能、多靶点作用、高效低毒的抗阿尔茨海默病药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是小鼠避暗实验结果图(^##P<0.01，^###P<0.001vs AD模型组)；

图2是小鼠旷场实验结果图(^#P<0.05，^##P<0.01vs AD模型组)；

图3是小鼠海马及血清中乙酰胆碱酯酶活性图(^#P<0.05，^##P<0.01vs AD模型组)；

图4是小鼠突触可塑性相关蛋白表达水平图(^#P<0.05vs AD模型组)；

图5是小鼠海马中H₂S含量图(^#P<0.05，^##P<0.01vs AD模型组)；

图6是小鼠海马中促炎症因子表达水平(^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs AD模型组)；

图7是小鼠肝脏HE染色切片图；

图8是小鼠血清中肝功能相关转氨酶含量图(^***P<0.01vs正常组)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1基于他克林结构的硫化氢供体化合物(式III化合物)的制备

1、主要试剂

邻硝基苯甲酸、二烯丙基二硫、3-巯基丙酸、三氯氧磷购自山东西亚化学工业有限公司，环己酮、丙二胺、EDC·HCl购自国药集团化学试剂有限公司，HOBT购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所有试剂皆为分析纯。

2、实验仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，ME104电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，YRT-3熔点测定仪(天津市天大天发科技有限公司)，SHZ-D(III)旋转水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，ESI-MS高分辨质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)，PX-400核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)。

3、合成步骤

3.1邻氨基苯甲酸的制备

将邻硝基苯甲酸(10.00g，59.90mmol)溶于1mol/L的稀盐酸溶液中，氢氧化钠调节pH至4.0～4.5，室温下分批加入经盐酸活化的铁粉(16.70g，299.50mmol)，50℃机械搅拌2h，溶液变为棕黑色。趁热过滤并水洗滤饼两次，合并滤液，滤液用稀盐酸调节pH至4.0～5.0，有白色晶体析出，抽滤干燥得白色针状晶体(7.10g，86.0％)，熔点144℃～146℃。

3.2 4,5-二硫代-7-辛烯酸的制备

将二烯丙基二硫(2.40g，13.60mmol)加入搅拌中的乙醚(10.00mL)甲醇(20.00mL)混合溶液中，再加入溶于5mL乙醚中的3-巯基丙酸(0.49g，4.60mmol)，再加入2mol/L的氢氧化钠溶液(2.30mL)，N₂保护下室温搅拌24h，乙醚萃取，先用1mol/L的HCl洗涤，再用蒸馏水洗涤3次，每次10mL。乙醚用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得无色透明油状物(0.75g，92.0％)，TLC(silica，二氯甲烷：乙酸乙酯，3:2)。¹H NMR(400MHz,d_δ-CDCl₃)δ5.93-5.81(m,1H),5.28-5.12(m,2H),3.36(d,J＝7.3Hz,2H),2.95(dd,J＝11.0,3.9Hz,2H),2.85-2.79(m,2H)；¹³C NMR(101MHz,d_δ-DMSO)δ173.19,134.05,119.13,41.45,34.30,33.69。

3.3式I结构化合物的制备

冰浴条件下将邻氨基苯甲酸(5.00g，36.50mmol)分批加入到三氯氧磷(30.00mL)及环己酮(4.30g，43.80mmol)混合液中，加毕，110℃回流反应3h后将反应液缓慢加入冰中，搅拌条件下用2mol/L氢氧化钠溶液调节至碱性，有固体析出，抽滤干燥得淡黄色片状固体(4.60g，56.3％)，TLC(正己烷：乙酸乙酯，2:1)。¹H NMR(400MHz,d_δ-CDCl₃)δ8.17(d,J＝8.3Hz,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,1H),7.71-7.64(m,1H),7.58-7.51(m,1H),3.14(t,J＝6.0Hz,2H),3.03(t,J＝6.1Hz,2H),2.02-1.91(m,4H)。

3.4式II结构化合物的制备

将式I结构化合物(2.20g，10.00mmol)溶于正戊醇(30.00mL)中，再加入丙二胺(2.40g，30.0mmol)，回流反应18h，冷却至室温，二氯甲烷萃取，1mol/L氢氧化钠溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得淡黄色固体(1.20g，47.3％)，TLC(二氯甲烷：甲醇，10:1)。¹H NMR(400MHz,d_δ-CDCl₃)δ8.04(d,J＝8.7Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(t,J＝7.5Hz,1H),7.35(t,J＝7.7Hz,1H),3.72(t,J＝6.5Hz,2H),3.12-3.06(m,2H),2.97(t,J＝6.3Hz,2H),2.73-2.67(m,2H),1.90(dd,J＝9.5,6.3Hz,4H),1.84(dd,J＝12.7,6.3Hz,2H),1.36-1.18(m,2H)；MS(ESI)m/z＝256[M+1]⁺。

3.5式III结构化合物的制备

冰浴条件下将硫化氢供体4,5-二硫代-7-辛烯酸(53.40mg，0.30mmol)与EDC·HCl(55.80mg，0.36mmol)溶于无水二氯甲烷中搅拌30min，然后加入HOBT(48.60mg，0.36mmol)搅拌1h，再加入式II化合物(75.90mg，0.30mmol)搅拌10min，后加入三乙胺(121.20mg，1.20mmol)，继续冰浴搅拌30min后撤去冰浴室温反应12h。监测反应，二氯甲烷萃取，1mol/L HCl溶液洗后蒸馏水水洗三次，二氯甲烷先用无水硫酸钠干燥，减压浓缩、柱层析淡黄色澄清透明油状物(111.40mg，产率为89.3％)，TLC(二氯甲烷：甲醇，20:1)。¹H NMR(400MHz,d_δ-CDCl₃)δ8.37(d,J＝8.5Hz,1H),8.29(d,J＝8.7Hz,1H),8.01(t,J＝6.2Hz,1H),7.85(t,J＝7.3Hz,1H),7.71-7.61(m,1H),7.45(t,J＝8.2Hz,1H),5.95-5.72(m,1H),5.16(dd,J＝24.5,13.1Hz,2H),3.97(dd,J＝11.6,6.3Hz,2H),3.49-3.44(m,2H),3.33(t,J＝6.2Hz,2H),3.23(dd,J＝12.4,6.4Hz,2H),3.02(t,J＝7.0Hz,2H),2.81-2.73(m,4H),2.01-1.82(m,6H)；¹³C NMR(101MHz,d_δ-CDCl₃)δ172.85,155.95,151.24,138.98,133.28,132.04,120.74,125.18,124.15,118.67,116.13,111.64,43.62,42.04,35.72,35.65,34.35,30.86,28.73,24.40,22.17,20.84；MS(ESI)m/z＝416[M+1]⁺。

实施例2式III化合物对AD小鼠模型的神经保护作用

1、小鼠AD模型建造及给药

(1)实验动物

SPF级健康成年雄性昆明小鼠，90只，体重为25±6g，由徐州医科大学实验动物中心提供，饲养于SPF级动物房，许可证号：SYXK(苏)2010-0011。

(2)实验动物分组及给药方式

将90只小鼠随机平均分为6组：正常组(Control，其余各组给药时对其给予同体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液)，其余老鼠腹腔注射AlCl₃诱导AD模型(100mg/kg，隔日一次，连续50天)后分为AD模型组、他克林(THA)给药组(腹腔注射THA，15mmol/kg)、硫化氢供体4,5-二硫代-7-辛烯酸(ACS)给药组(腹腔注射ACS，15mmol/kg)、式III化合物(THS)低剂量给药组(腹腔注射THS(LD)，5mmol/kg)及式III化合物(THS)高剂量给药组(腹腔注射THS(HD)，15mmol/kg)。各给药组化合物均用0.5％羧甲基纤维素钠溶液溶解，且连续给药20天，每日一次。

(3)仪器

BA-200小鼠避暗仪(成都泰盟科技有限公司)，PowerPac系列垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)，Elx808IU吸收光酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，NanoDrop1000核酸浓度测定仪(美国Thermo Scientific公司)，Light Cycle 480荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)，KD-BM生物组织石蜡包埋机(金华科迪仪器设备有限公司)，RM2235轮转式切片机(德国Leica公司)，HI1210病理组织漂烘机(德国Leica公司)，F-4600荧光分光光度计(日立高新技术公司)。

2、小鼠AD样行为学实验研究

避暗实验：避暗仪记录进入暗室的时间，称为避暗潜伏期；在暗室中受到电击时避暗仪自动记录其进入暗室的次数，即错误次数。24h后再次进行同样的测试，记录5min内小鼠避暗潜伏期和错误次数。实验结果见图1，A图表示小鼠避暗潜伏期，B图表示小鼠进入暗室的错误次数。统计结果显示高剂量式III化合物可使潜伏期明显延长的同时使错误次数明显减少，说明从行为学角度判断其可改善AD小鼠的学习记忆能力。

旷场实验：将小鼠放在旷场箱中央方格内，观察小鼠5min内的水平(Cross)及垂直运动(Rear)，并记录运动次数。实验结果见图2，A图表示小鼠水平运动次数，B图表示小鼠垂直运动次数。统计结果显示高剂量式III化合物可使小鼠水平及垂直运动次数均增多，说明小鼠的空间探索能力及运动能力得到改善。

小鼠避暗实验和旷场实验结果表明，高剂量式III化合物(15mmol/kg)可改善AD小鼠AD样行为学变化。

3、小鼠体内乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

行为学实验完成后处死小鼠，断头取脑并取血。使用小鼠酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测小鼠血清及海马中AChE的活性，实验结果见图3，A图表示小鼠海马内AChE的活性，B图表示小鼠血清中AChE的活性。统计结果显示式III化合物THS(5mmol/kg)可抑制小鼠血清中乙酰胆碱酯酶的活性，式III化合物THS(15mmol/kg)可同时抑制小鼠血清及海马中乙酰胆碱酯酶的活性，从而恢复乙酰胆碱水平，改善中枢胆碱能系统功能障碍。

4、小鼠海马突触可塑性损伤研究

使用蛋白免疫印迹法(Western-blot)通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的小鼠海马组织样品中突触可塑性相关蛋白突触素-38(SYN-38)及突触后致密物-95(PSD-95)进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在小鼠海马中表达情况的信息。实验结果见图4，A图表示突触素-38(SYN-38)相对内参(β-actin)的含量表达，B图表示突触后致密物-95(PSD-95)相对内参(β-actin)的含量表达。统计结果显示，式III化合物THS(15mmol/kg)可提高AD模型小鼠海马中SYN-38及PSD-95的蛋白表达水平，改善AD模型小鼠海马突触可塑性损伤。

与AD组相比，ACS组可增加PSD-95的表达，THA及THS(HD)组可同时提高SYN-38及PSD-95的蛋白表达。结果表明硫化氢供体增加了突触相关蛋白PSD-95的表达；而他克林及高剂量THS都同时提高了突触重建关键蛋白SYN-38及PSD-95的表达，提示高剂量THS可以改善突触可塑性损伤。同时结果提示他克林在抑制乙酰胆碱酯酶，恢复乙酰胆碱水平的同时，对突触可塑性损伤也有修复作用。

5、小鼠海马中枢神经炎症研究

使用H₂S荧光探针NAP-1(Organic&Biomolecular Chemistry.2014,12,5115-5125.)检测小鼠海马中H₂S的含量，实验结果见图5，同时通过实时定量荧光PCR法(Q-PCR)测定小鼠海马中促炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，实验结果见图6，A图表示IL-1βmRNA的相对表达量，B图表示IL-6mRNA的相对表达量，C图表示TNF-αmRNA的相对表达量。统计结果显示，式III化合物THS(15mmol/kg)可通过增加AD小鼠体内H₂S水平来降低其海马中促炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平。

结果表明式III化合物THS(15mmol/kg)可通过释放外源性H₂S抑制中枢神经炎症。

实施例3式III化合物对AD小鼠肝脏组织影响的研究

1、小鼠肝脏组织形态学变化

处死小鼠，迅速取其肝脏切成若干个小立方体置于4％多聚甲醛中固定备用。取出备用组织经过脱水、石蜡包埋、切片及伊红-苏木素(HE)染色等步骤后通过显微镜观察肝脏的组织形态变化并拍照，结果见图7，(A)正常组；(B)溶剂组；(C)ACS组；(D)THS(LD)组；(E)THS(HD)组；(F)THA组。(HE×40)。实验结果显示，式III化合物THS对AD小鼠肝脏组织形态学无明显影响。

结果表明，式III化合物THS无肝毒副作用。

2、小鼠血清中肝功能相关转氨酶水平变化

使用小鼠酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量，实验结果见图8，A图表示小鼠血清中ALT的含量，B图表示小鼠血清中AST的含量。实验统计结果显示，式III化合物THS对AD小鼠肝功能相关转氨酶ALT及AST水平无明显影响。

结果表明式III化合物THS无肝毒副作用。

综上所述，式III化合物可通过抑制乙酰胆碱酯酶活性、抑制中枢神经炎症并且能够修复突触可塑性损伤，从而改善AD小鼠AD样变化；同时式III化合物未表现出明显肝毒性。本发明基于他克林结构的硫化氢供体化合物或其药用盐可作为抗阿尔茨海默病药物用于临床试验。