一种新的二萜类化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物领域，具体涉及从干燥猫爪草中分离得到的一种新的二萜类化合 物及其制备方法和医药用途。
【背景技术】
[0002] 猫爪草RanunculiTernatiRadix为毛茛科植物小毛茛Ranunculusternatus Thunb.的干燥块根。本品呈纺锤形，多5~6个簇生，形似猫爪，长3~10mm，直径2~3mm， 顶端有黄褐色残茎或茎痕。表面黄褐色或灰黄色，久存色泽变深，微有纵皱纹，并有点状须 根痕和残留须根。质坚实，断面类白色或黄白色，空心或实心，粉性。气微，味微甘。猫爪草 别名三散草（浙江）、猫爪儿草（河南）、猫爪子（河南）、鸭脚板（安徽）、金花草（广西）。 猫爪草性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效，临床用于治 疗肺结核、淋巴结结核、咽喉炎、疟疾等症。民间用猫爪草治疗淋巴结核，不论结核大小或是 否化脓均有较好的疗效。近年来因其有较好的抗肿瘤效果而成为研究热点。
[0003] 近年来针对猫爪草化学成分的研究较少，其主要含有黄酮类及苷类、生物碱、挥发 油、有机酸等化合物。
[0004] 据报道，猫爪草煎剂治疗淋巴结核180例，其有效率达100 %，临床治愈率73. 9 %; 其注射液对小鼠S180、S37癌株有抑制作用其煎剂对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄 球菌、四联球菌等均有显著抑制作用。另有报道猫爪草能诱生肿瘤坏死因子（TNF)。肿瘤坏 死因子是一组具有抗肿瘤、抗病毒、参与多种免疫调节过程的球蛋白，由于它能特异性地杀 死肿瘤细胞，而对正常组织细胞无不良影响，从而起到肿瘤免疫和肿瘤治疗的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从干燥猫爪草中分离得到的一种新的二萜类化合 物；
[0006] 本发明的另一目的在于提供该新化合物的制备方法；
[0007] 本发明的再一目的在于提供该化合物用于制备治疗肾癌药物的医药用途。
[0008] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0009] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0010]
[0011] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将干燥猫爪草粉碎，用 70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和 的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱10个柱体积，再用75%乙醇洗脱12 个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75% 乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体 积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤⑷中组分 2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱， 收集9~13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75 %。
[0014] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的 载体。
[0015] 所述的化合物（I)在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0016] 所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
[0017] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0018] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0019] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0020] 图1为化合物（I)结构式；
[0021] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0023] 实施例1 :化合物（I)分离制备及结构确证
[0024] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0025]制备方法：（a)将干燥猫爪草（8kg)粉碎，用75%乙醇热回流提取（25LX3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次）和水饱 和的正丁醇（6LX3次）萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（315g)和正 丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用纯净水溶解至2L，医用脱脂棉过滤，滤液用 AB-8型大孔树脂（1.5kg)分离，依次用10%乙醇（10L)和75% (12L)乙醇洗脱，收集75% 乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（155g) ;(c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸 膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为80:1 (10个柱体积）、40:1 (8个柱体积）、 20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积）和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分；（d)步骤（c)中组分3 (36g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积 比为25:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）和10:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2(12g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18 分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集9~13个柱体积洗脱液，洗脱液 减压浓缩得到纯的化合物（I) (25mg)。
[0026] 结构确证：无色油状物；HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z503. 2602，结合核磁特 征可得分子式为C26H4Q0s，不饱和度为7。核磁共振氢谱数据SH(ppm，DMS0-d6,600MHZ): H-1 (1. 17,m)，H-1 (2. 05,ddd，J= 13. 7,8. 7,1. 8)，H-2 (4. 22,m)，H-3 (1. 92,m)，H-3 (1. 29， m)，Η-4(2· 21，ddd，J= 14. 9,7· 2,3· 6)，Η-6(1· 49,m)，Η-6(1· 66,dt，J= 14. 0,2· 8)， Η-7(1·32,m)，Η-7(1· 14,m)，H-8(L46,m)，Η-10(1·70,d，J= 13.7)，Η-11(1· 13,m)， H-ll(1. 35,m)，Η-12(1· 94,m)，Η-14(6· 32,dd，J= 17. 6,10. 9)，Η-15(5· 11，d，J= 17. 6)，H-15(4. 96,d，J= 10. 8)，H-16(4. 95,s)，H-16(4. 84,s)，H-17(0. 81，d，J= 6. 8)， H-18 (6. 48,d，J= 7. 2)，H-19 (6. 43,s)，H-20 (0· 86,s)，H-2'（3. 45,s)，H-4'（2. 54,s)， H-2"（2.12,s);核磁共振碳谱数据δc(ppm，DMS0-d6,150MHz) :29. 7(CH2，1-C)，66.8(CH， 2-C)，29. 2 (CH2, 3-C)，27. 7 (CH，4-C)，49. 2 (C，5-C)，23. 2 (CH2, 6-C)，27. 0 (CH2, 7-C)， 36. 9 (CH，8-C)，36. 1 (C，9-C)，34. 7 (CH，10-C)，32. 3 (CH2,11-C)，26. 3 (CH2,12-C)，144. 4 (C， 13-C)，139. 4(CH，14-C)，111. 3(CH2,15-C)，114. 4(CH2,16-C)，15. 3(CH3,17-C)，97. 2(CH， 18-C)，101. 1 (CH，19-C)，25. 2(CH3,20-C)，171. 2(C，Γ-C)，50. 4(CH2,2' -C)，199. 7(C， 3' -C)，30.7(CH3,4' -C)，168.8(C，1"-C)，20.5(CH3,2"-C);碳原子标记参见图 1。红外 波谱表明该化合物含有羟基（3546cm1)和羰基（1735cm1)。4NMR谱显示四个甲基信号 (δH0. 81，d，J= 6· 8Hz，H-17 ;0· 86,s，H-20 ;2· 54,s，H-4' ；2· 12,s，H-2"），五个烯属质子 (δΗ6· 32,dd，J= 17. 6,10. 9Hz，Η-14 ;5· 11，d，J= 17. 6Hz和 4· 96,d，J= 10. 8Hz，H-15 ; 4. 95,s和 4. 84,s，H-16)，三个含氧质子信号（δH4. 22,m，H-2 ;6. 48,d，J= 7. 2Hz，H-18 ; 6.43,s，H-19)。13CNMR谱显示有26个信号，四个甲基，九个亚甲基，七个次甲基（三个含 氧，一个烯属次甲基），以及六个季碳（三个羰基碳，一个烯烃季碳）。HMBC谱中，H-19与相 应羰基碳（δC168. 8)的相关性表明C-19位连有一个乙酰氧基。HMBC谱中，烯属质子H2-15 与C-14 和C-13，H-14 与C-16 和C-12，H2-16 与C-12 的相关性表明C-14 和C-15,以及C-13 和C-16之间存在双键。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁 数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验 值基本一致（图2)。
[0027] 实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0028] 一、材料和仪器
[0029] 人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库（美国）。分析纯蔗糖购于国药集团化学 试剂公司。重水（D20)购于青岛腾龙微波科技有限公司。Tris、SDS、30%丙烯酰胺单体、 Tween20购于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。 Centriplus离心超滤管、AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管（100kD)、PVDF 膜购于Mi11ipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5XSDS-PAGE 蛋白质上样缓冲液、BeyoECL