本发明属于生物医药领域，涉及一种特异性禽源单链抗体的制备和应用，具体涉及一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法。
背景技术：
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属。从发现该病毒至今，世界各地均有流行，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。健康犬经消化道感染病毒后，病毒主要攻击两种细胞，一种是肠上皮细胞，一种是心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状，心肌炎以幼犬多见。
犬接触细小病毒后在3～14天内出现体症，平均发病时间为5～7天。临床症状包括：食欲下降、沉郁、发热、呕吐、腹泻、粪便带有犬细小病毒特有的腥臭味。犬细小病毒至今没有特效药物，但是可以通过止吐止拉等手段控制住病犬脱水情况，降低病犬负担来治疗。
理论上诊断本病的方法很多，适合临床医生的有以下四种：1.流行病学诊断本病不分年龄，均可感染，主要是幼犬。直接接触或间接接触感染，主要通过消化道感染。2.症状学诊断特征症状是呕吐、拉稀、拉血。具体根据早中期的症状来诊断。3.血常规检查白细胞总数明显减少，多数犬(92％)在9×109/L以下，少数犬(15％)在2×109/L以下。如果继发细菌感染，白细胞总数可增高。4.试纸快速诊断法用北京军事医学科学院实验动物中心研制的犬细小病毒快速诊断试纸诊断本病，经济简便、快速适用，有极高的准确率。
由于禽源抗体多样性主要是通过基因重组实现，扩增抗体可变区基因只需设计一对引物就可达到目的，不同于哺乳动物通过体细胞突变来增加抗体多样性，需要设计多对引物实现可变区基因的扩增。这在抗体可变区基因的获得上优于哺乳动物抗体库的构建，保证了抗体库的多样性。从这方面来说，禽源单链抗体噬菌体筛选技术更具优势。
技术实现要素：
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，以便用于犬细小病毒病的检测与治疗。
技术方案：一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，包括以下步骤：
(1)犬细小病毒样粒子的免疫
(11)选取生产状态良好的60～70日龄未开产母鸡5只；
(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；
(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为200～1000μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；
(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立
(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；
(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；
(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；
(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，
引物HF-Sif I:
5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；
引物HR-Linker:
5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；
引物LF-Linker:
5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；
引物LR-Not I:
5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；
(25)建立噬菌体抗体库
(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；
(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4-DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；
(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养12-16小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入-80℃存储备用；
(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；
(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(301)将3mL步骤(2)得到的噬菌体抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养，该2×YT培养基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；
(302)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(301)中的培养基的细菌浓度，待步骤(301)中的培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(303)将步骤(302)中的培养基离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀，其中，离心时的离心力为5000×g；
(304)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(303)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养过夜；
(305)用2mL浓度为10μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育12～16小时备用；
(306)将步骤(304)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(307)将步骤(306)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(308)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(307)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(309)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(308)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(310)将步骤(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(311)再将步骤(310)中的第一免疫管中的封闭液倒去，再用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(312)将步骤(309)得到的混合液加入步骤(311)的第一免疫管内，37℃静置温育2h；
(313)弃去步骤(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第一免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(314)向步骤(313)中的第一免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中,其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(315)向步骤(314)中空的第一免疫管加入4mL对数期TG1菌液洗涤，然后将第一免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液加入步骤(314)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得一级抗体库，然后取0.01ml的一级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(316)将2mL步骤(315)得到的一级抗体库加入到250mL的2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(317)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(316)培养基中的细菌浓度，待步骤(316)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(318)将步骤(317)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(319)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(318)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养12～16小时；
(320)用2mL浓度为5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育12～16小时备用；
(321)将步骤(319)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一经过灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(322)将步骤(321)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(323)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(322)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(324)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(323)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(325)将步骤(320)得到的第二免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(326)将步骤(325)中的第二免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(327)将步骤(324)得到的混合液加入步骤(327)得到的第二免疫管内，37℃静置温育2h；
(328)弃去步骤(327)中第二免疫管中的混合液，用含有0.3v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第二免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(329)向步骤(328)中的第二免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(330)向步骤(329)中空的第二免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第二免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(329)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得二级抗体库，然后取0.01ml的二级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(331)将2mL步骤(330)得到的二级抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(332)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(331)培养基中的细菌浓度，待步骤(331)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(333)将步骤(332)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(334)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(333)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养12～16小时；
(335)用2mL浓度为2.5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第三免疫管，4℃孵育12～16小时备用；
(336)将步骤(334)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(337)将步骤(336)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(338)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(337)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(339)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(338)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(340)将步骤(335)得到的第三免疫管从4℃取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后每管加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(341)将步骤(340)中的第三免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(342)将步骤(339)得到的混合液加入步骤(341)的第三免疫管内，37℃静置温育2h；
(343)弃去步骤(342)中第三免疫管中的混合液，用含有0.5v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第三免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(344)向步骤(343)中的第三免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(345)向步骤(344)中空的第三免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第三免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(344)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得三级抗体库，然后取0.01ml的三级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(346)向三级抗体库中加入8ml体积浓度为50％的甘油水溶液，分装后-80℃冻存；
(347)从第三轮淘选结束后的SOB固体培养基上随机挑取10个单克隆，分别于5mL 2×YT培养基中培养12～16小时，通过噬菌体酶联免疫吸附试验选取一株特异性抗犬细小病毒单链抗体细菌株并获得基因，其中该2×YT培养基中含有5uL氨苄霉素；
(348)将步骤(347)获得的特异性抗犬细小病毒单链抗体基因和pET-30a载体经酶切3～4小时得到酶切产物，
(349)通过T4连接酶将步骤(348)得到的酶切产物连接在一起构成重组质粒，并将此重组质粒转化入100μL BL21感受态细胞；
(350)向步骤(349)中的感受态细胞中加入900μL无菌LB培养基，混匀后于恒温摇床上37℃，160rpm复苏45分钟；
(351)将步骤(350)得到的产物以3000×g离心后，弃去900μL上清，余下100μL混合物重悬沉淀；
(352)将步骤(351)得到的100μL混合液均匀涂布于LB固体培养基平板，37℃恒温倒置过夜培养；
(353)次日从步骤(352)固体培养基平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，于恒温摇床上37℃，220rpm振荡培养12～14h得到菌液；
(354)以1:100转接步骤(353)中菌液于150mL LB培养基中，37℃，220rpm,振荡培养至菌液的OD600为0.6～0.8；
(355)向步骤(354)的培养基中加入0.5ml为100mmol/mL IPTG，37℃，220rpm振荡培养5～6h；
(356)将步骤(355)培养基中的菌液以12000×g,4℃离心10分钟，收集菌体沉淀；
(357)使用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(356)得到的菌体沉淀两次后，再用10mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀得到混合液；
(358)将步骤(357)得到的混合液置于冰上使用超声破碎仪裂解菌体至菌液澄清；
(359)将步骤(358)得到的澄清的菌液以12000×g，4℃离心10分钟，收集上清并用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体。
有益效果：本发明公开的一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法具有以下有益效果：
1、本发明制备的禽源单链抗体能有效结合犬细小病毒样粒子并能中和犬细小病毒；
2、禽源单链抗体制备相对简单，抗体产量大，制备成本相对低。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
具体实施例1
一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，包括以下步骤：
(1)犬细小病毒样粒子的免疫
(11)选取生产状态良好的60日龄未开产母鸡5只；
(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；
(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为200μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；
(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立
(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；
(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；
(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；
(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，
引物HF-Sif I:
5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；
引物HR-Linker:
5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；
引物LF-Linker:
5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；
引物LR-Not I:
5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；
(25)建立噬菌体抗体库
(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；
(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4-DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；
(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养12小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入-80℃存储备用；
(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；
(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(301)将3mL步骤(2)得到的噬菌体抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养，该2×YT培养基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；
(302)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(301)中的培养基的细菌浓度，待步骤(301)中的培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(303)将步骤(302)中的培养基离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀，其中，离心时的离心力为5000×g；
(304)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(303)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养过夜；
(305)用2mL浓度为10μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育12小时备用；
(306)将步骤(304)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(307)将步骤(306)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(308)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(307)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(309)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(308)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(310)将步骤(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(311)再将步骤(310)中的第一免疫管中的封闭液倒去，再用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(312)将步骤(309)得到的混合液加入步骤(311)的第一免疫管内，37℃静置温育2h；
(313)弃去步骤(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第一免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(314)向步骤(313)中的第一免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中,其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(315)向步骤(314)中空的第一免疫管加入4mL对数期TG1菌液洗涤，然后将第一免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液加入步骤(314)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得一级抗体库，然后取0.01ml的一级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(316)将2mL步骤(315)得到的一级抗体库加入到250mL的2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(317)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(316)培养基中的细菌浓度，待步骤(316)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(318)将步骤(317)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(319)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(318)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养12小时；
(320)用2mL浓度为5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育12小时备用；
(321)将步骤(319)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一经过灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(322)将步骤(321)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(323)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(322)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(324)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(323)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(325)将步骤(320)得到的第二免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(326)将步骤(325)中的第二免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(327)将步骤(324)得到的混合液加入步骤(327)得到的第二免疫管内，37℃静置温育2h；
(328)弃去步骤(327)中第二免疫管中的混合液，用含有0.3v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第二免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(329)向步骤(328)中的第二免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(330)向步骤(329)中空的第二免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第二免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(329)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得二级抗体库，然后取0.01ml的二级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(331)将2mL步骤(330)得到的二级抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(332)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(331)培养基中的细菌浓度，待步骤(331)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(333)将步骤(332)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(334)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(333)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养12小时；
(335)用2mL浓度为2.5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第三免疫管，4℃孵育12小时备用；
(336)将步骤(334)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(337)将步骤(336)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(338)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(337)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(339)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(338)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(340)将步骤(335)得到的第三免疫管从4℃取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后每管加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(341)将步骤(340)中的第三免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(342)将步骤(339)得到的混合液加入步骤(341)的第三免疫管内，37℃静置温育2h；
(343)弃去步骤(342)中第三免疫管中的混合液，用含有0.5v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第三免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(344)向步骤(343)中的第三免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(345)向步骤(344)中空的第三免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第三免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(344)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得三级抗体库，然后取0.01ml的三级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(346)向三级抗体库中加入8ml体积浓度为50％的甘油水溶液，分装后-80℃冻存；
(347)从第三轮淘选结束后的SOB固体培养基上随机挑取10个单克隆，分别于5mL 2×YT培养基中培养12小时，通过噬菌体酶联免疫吸附试验选取一株特异性抗犬细小病毒单链抗体细菌株并获得基因，其中该2×YT培养基中含有5uL氨苄霉素；
(348)将步骤(347)获得的特异性抗犬细小病毒单链抗体基因和pET-30a载体经酶切3小时得到酶切产物，
(349)通过T4连接酶将步骤(348)得到的酶切产物连接在一起构成重组质粒，并将此重组质粒转化入100μL BL21(DE3)感受态细胞；
(350)向步骤(349)中的感受态细胞中加入900μL无菌LB培养基，混匀后于恒温摇床上37℃，160rpm复苏45分钟；
(351)将步骤(350)得到的产物以3000×g离心后，弃去900μL上清，余下100μL混合物重悬沉淀；
(352)将步骤(351)得到的100μL混合液均匀涂布于LB固体培养基平板，37℃恒温倒置过夜培养；
(353)次日从步骤(352)固体培养基平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，于恒温摇床上37℃，220rpm振荡培养12h得到菌液；
(354)以1:100转接步骤(353)中菌液于150mL LB培养基中，37℃，220rpm,振荡培养至菌液的OD600为0.6；
(355)向步骤(354)的培养基中加入0.5ml为100mmol/mL IPTG，37℃，220rpm振荡培养5h；
(356)将步骤(355)培养基中的菌液以12000×g,4℃离心10分钟，收集菌体沉淀；
(357)使用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(356)得到的菌体沉淀两次后，再用10mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀得到混合液；
(358)将步骤(357)得到的混合液置于冰上使用超声破碎仪裂解菌体至菌液澄清；
(359)将步骤(358)得到的澄清的菌液以12000×g，4℃离心10分钟，收集上清并用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体。
具体实施例2
一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，包括以下步骤：
(1)犬细小病毒样粒子的免疫
(11)选取生产状态良好的70日龄未开产母鸡5只；
(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为1000μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；
(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为1000μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；
(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立
(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；
(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；
(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；
(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，
引物HF-Sif I:
5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；
引物HR-Linker:
5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；
引物LF-Linker:
5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；
引物LR-Not I:
5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；
(25)建立噬菌体抗体库
(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；
(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4-DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；
(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养16小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入-80℃存储备用；
(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；
(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(301)将3mL步骤(2)得到的噬菌体抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养，该2×YT培养基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；
(302)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(301)中的培养基的细菌浓度，待步骤(301)中的培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(303)将步骤(302)中的培养基离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀，其中，离心时的离心力为5000×g；
(304)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(303)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养过夜；
(305)用2mL浓度为10μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育16小时备用；
(306)将步骤(304)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(307)将步骤(306)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(308)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(307)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(309)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(308)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(310)将步骤(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(311)再将步骤(310)中的第一免疫管中的封闭液倒去，再用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(312)将步骤(309)得到的混合液加入步骤(311)的第一免疫管内，37℃静置温育2h；
(313)弃去步骤(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第一免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(314)向步骤(313)中的第一免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中,其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(315)向步骤(314)中空的第一免疫管加入4mL对数期TG1菌液洗涤，然后将第一免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液加入步骤(314)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得一级抗体库，然后取0.01ml的一级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(316)将2mL步骤(315)得到的一级抗体库加入到250mL的2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(317)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(316)培养基中的细菌浓度，待步骤(316)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(318)将步骤(317)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(319)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(318)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养16小时；
(320)用2mL浓度为5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育16小时备用；
(321)将步骤(319)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一经过灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(322)将步骤(321)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(323)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(322)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(324)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(323)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(325)将步骤(320)得到的第二免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(326)将步骤(325)中的第二免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(327)将步骤(324)得到的混合液加入步骤(327)得到的第二免疫管内，37℃静置温育2h；
(328)弃去步骤(327)中第二免疫管中的混合液，用含有0.3v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第二免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(329)向步骤(328)中的第二免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(330)向步骤(329)中空的第二免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第二免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(329)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得二级抗体库，然后取0.01ml的二级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(331)将2mL步骤(330)得到的二级抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(332)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(331)培养基中的细菌浓度，待步骤(331)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(333)将步骤(332)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(334)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(333)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养16小时；
(335)用2mL浓度为2.5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第三免疫管，4℃孵育16小时备用；
(336)将步骤(334)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(337)将步骤(336)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(338)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(337)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(339)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(338)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(340)将步骤(335)得到的第三免疫管从4℃取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后每管加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(341)将步骤(340)中的第三免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(342)将步骤(339)得到的混合液加入步骤(341)的第三免疫管内，37℃静置温育2h；
(343)弃去步骤(342)中第三免疫管中的混合液，用含有0.5v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第三免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(344)向步骤(343)中的第三免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(345)向步骤(344)中空的第三免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第三免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(344)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得三级抗体库，然后取0.01ml的三级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(346)向三级抗体库中加入8ml体积浓度为50％的甘油水溶液，分装后-80℃冻存；
(347)从第三轮淘选结束后的SOB固体培养基上随机挑取10个单克隆，分别于5mL 2×YT培养基中培养16小时，通过噬菌体酶联免疫吸附试验选取一株特异性抗犬细小病毒单链抗体细菌株并获得基因，其中该2×YT培养基中含有5uL氨苄霉素；
(348)将步骤(347)获得的特异性抗犬细小病毒单链抗体基因和pET-30a载体经酶切4小时得到酶切产物，
(349)通过T4连接酶将步骤(348)得到的酶切产物连接在一起构成重组质粒，并将此重组质粒转化入100μL BL21(DE3)感受态细胞；
(350)向步骤(349)中的感受态细胞中加入900μL无菌LB培养基，混匀后于恒温摇床上37℃，160rpm复苏45分钟；
(351)将步骤(350)得到的产物以3000×g离心后，弃去900μL上清，余下100μL混合物重悬沉淀；
(352)将步骤(351)得到的100μL混合液均匀涂布于LB固体培养基平板，37℃恒温倒置过夜培养；
(353)次日从步骤(352)的固体培养基平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，于恒温摇床上37℃，220rpm振荡培养14h得到菌液；
(354)以1:100转接步骤(353)中菌液于150mL LB培养基中，37℃，220rpm,振荡培养至菌液的OD600为0.8；
(355)向步骤(354)的培养基中加入0.5ml为100mmol/mL IPTG，37℃，220rpm振荡培养6h；
(356)将步骤(355)培养基中的菌液以12000×g,4℃离心10分钟，收集菌体沉淀；
(357)使用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(356)得到的菌体沉淀两次后，再用10mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀得到混合液；
(358)将步骤(357)得到的混合液置于冰上使用超声破碎仪裂解菌体至菌液澄清；
(359)将步骤(358)得到的澄清的菌液以12000×g，4℃离心10分钟，收集上清并用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体。
具体实施例3
一种制备抗犬细小病毒的禽源基因工程抗体的方法，包括以下步骤：
(1)犬细小病毒样粒子的免疫
(11)选取生产状态良好的65日龄未开产母鸡5只；
(12)将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对步骤(11)中的母鸡进行初次免疫，免疫剂量为500μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂；
(13)初次免疫14天后，对步骤(2)中的母鸡依次进行四次加强免疫，每次加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将犬细小病毒样粒子与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为500μg/kg，免疫佐剂为不完全弗氏佐剂；
(2)禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立
(21)待步骤(13)中的母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；
(22)使用总RNA提取试剂盒提取步骤(21)得到的脾脏组织的总RNA；
(23)对步骤(22)得到的脾脏组织总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA；
(24)使用两对特异性引物以脾脏组织cDNA为模板分别扩增轻链可变区和重链可变区，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段,其中，两对特异性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，
引物HF-Sif I:
5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；
引物HR-Linker:
5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；
引物LF-Linker:
5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；
引物LR-Not I:
5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；
(25)建立噬菌体抗体库
(251)将步骤(24)获得的禽源单链抗体片段分别用引物Sif I和引物Not I酶切，再将pCANTAB5E噬菌粒载体分别用引物Sif I和引物Not I酶切；
(252)将步骤(251)得到的酶切产物经胶回收后，使用T4-DNA连接酶将酶切禽源单链抗体片段与酶切pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起；
(253)将步骤(252)得到的连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于SOB固体培养基上，30℃，培养12-16小时，其中该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(254)将步骤(253)中SOB固体培养基上的菌落用5mL 2×YT培养基洗脱下来，加入等体积的50％灭菌甘油，放入-80℃存储备用；
(3)通过噬菌体展示技术对步骤(2)得到的单链抗体进行筛选，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体；
(4)基于步骤(3)得到的特异性抗犬细小病毒单链抗体通过原核表达获得禽源基因工程单链抗体。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(301)将3mL步骤(2)得到的噬菌体抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养，该2×YT培养基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；
(302)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(301)中的培养基的细菌浓度，待步骤(301)中的培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(303)将步骤(302)中的培养基离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀，其中，离心时的离心力为5000×g；
(304)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(303)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养过夜；
(305)用2mL浓度为10μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育14小时备用；
(306)将步骤(304)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(307)将步骤(306)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(308)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(307)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(309)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(308)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(310)将步骤(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(311)再将步骤(310)中的第一免疫管中的封闭液倒去，再用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(312)将步骤(309)得到的混合液加入步骤(311)的第一免疫管内，37℃静置温育2h；
(313)弃去步骤(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第一免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(314)向步骤(313)中的第一免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中,其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(315)向步骤(314)中空的第一免疫管加入4mL对数期TG1菌液洗涤，然后将第一免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液加入步骤(314)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得一级抗体库，然后取0.01ml的一级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(316)将2mL步骤(315)得到的一级抗体库加入到250mL的2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(317)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(316)培养基中的细菌浓度，待步骤(316)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(318)将步骤(317)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(319)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(318)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养14小时；
(320)用2mL浓度为5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育14小时备用；
(321)将步骤(319)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一经过灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(322)将步骤(321)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(323)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(322)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(324)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(323)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(325)将步骤(320)得到的第二免疫管取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(326)将步骤(325)中的第二免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(327)将步骤(324)得到的混合液加入步骤(327)得到的第二免疫管内，37℃静置温育2h；
(328)弃去步骤(327)中第二免疫管中的混合液，用含有0.3v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第二免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(329)向步骤(328)中的第二免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(330)向步骤(329)中空的第二免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第二免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(329)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得二级抗体库，然后取0.01ml的二级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(331)将2mL步骤(330)得到的二级抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃,持续震荡培养；
(332)每隔一小时，用分光光度计测定步骤(331)培养基中的细菌浓度，待步骤(331)培养基中的菌液OD600为0.4～0.6时，然后向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100rpm轻摇感染0.5h之后，再37℃，220rpm振荡培养0.5h；
(333)将步骤(332)中的培养基5 000×g离心15分钟，去上清，得到细菌沉淀；
(334)用500mL的2×YT培养基悬浮步骤(333)得到的细菌沉淀，37℃，250rpm振荡培养14小时；
(335)用2mL浓度为2.5μg/mL的犬细小病毒样粒子包被免疫管得到第三免疫管，4℃孵育14小时备用；
(336)将步骤(334)中的培养基以5 000×g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该锥形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化钠混合水溶液，冰浴30分钟以沉淀噬菌体，其中：该混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化钠；
(337)将步骤(336)锥形瓶中的溶液以10 000×g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到细菌沉淀；
(338)用3mL 2×YT培养基重悬步骤(337)得到的细菌沉淀，然后以5 000×g离心15分钟，取2mL上清待用；
(339)将2mL 2wt％脱脂奶粉水溶液加入到步骤(338)得到的2mL上清中，室温去干扰化处理20分钟得到混合液；
(340)将步骤(335)得到的第三免疫管从4℃取出，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干，然后每管加入4mL封闭液37℃封闭2h；
(341)将步骤(340)中的第三免疫管中的封闭液倒去，用4mL磷酸盐缓冲液洗涤3次，甩干后备用；
(342)将步骤(339)得到的混合液加入步骤(341)的第三免疫管内，37℃静置温育2h；
(343)弃去步骤(342)中第三免疫管中的混合液，用含有0.5v/v％吐温20的磷酸盐缓冲液震荡洗涤10次第三免疫管，每次10分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，甩干备用；
(344)向步骤(343)中的第三免疫管加入2mL PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液，37℃，150rpm转动洗脱5分钟后，立即再加入2mL的PH为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，最后将混合液转移至灭菌的离心管中，其中PH为2.3的甘氨酸-盐酸缓冲液中的甘氨酸的摩尔浓度为0.2mol/L；
(345)向步骤(344)中空的第三免疫管加入4mL对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤，然后将第三免疫管中的对数期TG1大肠杆菌菌液洗涤液也加入步骤(344)中的离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，获得三级抗体库，然后取0.01ml的三级抗体库10-8稀释后放入SOB固体培养基计算库容，该SOB固体培养基中加入了2uL氨苄霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；
(346)向三级抗体库中加入8ml体积浓度为50％的甘油水溶液，分装后-80℃冻存；
(347)从第三轮淘选结束后的SOB固体培养基上随机挑取10个单克隆，分别于5mL 2×YT培养基中培养14小时，通过噬菌体酶联免疫吸附试验选取一株特异性抗犬细小病毒单链抗体细菌株并获得基因，其中该2×YT培养基中含有5uL氨苄霉素；
(348)将步骤(347)获得的特异性抗犬细小病毒单链抗体基因和pET-30a载体经酶切3.5小时得到酶切产物，
(349)通过T4连接酶将步骤(348)得到的酶切产物连接在一起构成重组质粒，并将此重组质粒转化入100μL BL21(DE3)感受态细胞；
(350)向步骤(349)中的感受态细胞中加入900μL无菌LB培养基，混匀后于恒温摇床上37℃，160rpm复苏45分钟；
(351)将步骤(350)得到的产物以3000×g离心后，弃去900μL上清，余下100μL混合物重悬沉淀；
(352)将步骤(351)得到的100μL混合液均匀涂布于LB固体培养基平板，37℃恒温倒置过夜培养；
(353)次日从步骤(352)的固体培养基平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，于恒温摇床上37℃，220rpm振荡培养13h得到菌液；
(354)以1:100转接步骤(353)中菌液于150mL LB培养基中，37℃，220rpm,振荡培养至菌液的OD600为0.7；
(355)向步骤(354)的培养基中加入0.5ml为100mmol/mL IPTG，37℃，220rpm振荡培养5.5h；
(356)将步骤(355)培养基中的菌液以12000×g,4℃离心10分钟，收集菌体沉淀；
(357)使用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(356)得到的菌体沉淀两次后，再用10mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀得到混合液；
(358)将步骤(357)得到的混合液置于冰上使用超声破碎仪裂解菌体至菌液澄清；
(359)将步骤(358)得到的澄清的菌液以12000×g，4℃离心10分钟，收集上清并用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗犬细小病毒单链抗体。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。