蓝莓miR156基因及其克隆产物和应用的制作方法

本发明涉及一种基因及其克隆产物和应用，具体涉及蓝莓miR156基因及其克隆产物和该克隆产物在改良和培育优质蓝莓品种中的应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：蓝莓是花青苷含量最丰富的果实之一，而且花青苷的种类组成也很丰富。蓝莓花青苷至少在以下3方面发挥着重要的作用：(1)蓝莓花青苷的种类、分布和多少决定果实的色泽，而果实色泽是衡量果实品质的一个重要指标；(2)蓝莓花青苷是天然的可食用色素，它可以替代合成的染料，增强食品的安全性；(3)蓝莓花青苷对人类健康有诸多益处，它具有促进视红素再合成、清除自由基、延缓衰老及抗癌等多种生理活性功能，被联合国粮农组织列为人类五大保健食品之一。可见挖掘蓝莓果实花青苷合成调控因子，通过分子与遗传手段针对性的培育或者改良蓝莓品种不仅具有重要的经济意义，而且在食品安全和人类健康方面具有重要的社会意义。miRNA(microRNA，微RNA)是长20-24nt的内源非编码RNA，miRNA基因的初级转录本被剪切后生成miRNA的前体(pre-miRNA)，植物pre-miRNA长度约为55-930nt，具有茎-环二级结构；pre-miRNA再次剪切后，最终产生成熟miRNA，成熟的miRNA序列在“茎”的其中一条臂(3'臂或5'臂)上。大多数miRNA以U开始，且成熟miRNA在进化上具有保守性，如拟南芥与水稻的miRNA同源性很强。植物miRNA主要通过切割靶标基因、抑制翻译或介导染色质修饰从而对基因的时空表达进行调控，进而影响植物形态建成、生长发育、信号转导以及适应胁迫等生理过程。在植物中miRNA的靶标很多是转录因子，也可能是酶基因和激素受体基因，通常认为miRNA在基因调控网络中占有核心的位置。在植物中已鉴定了大量的miRNAs，miRBase数据库2014年6月释放的数据(Release21)表明植物中已有8476条成熟miRNAs，涵盖73种植物，然而尚未见到关于蓝莓miRNA的鉴定与功能方面的报道。miR156是植物中一种重要的保守miRNA，目前在45种植物中发现627个miR156。根据产生成熟miRNA的数量可以将miR156基因分为两种类型：一种类型是只产生一个成熟的miRNA，研究表明这种类型的miR156在拟南芥花青苷合成、开花与衰老、侧枝的发育、叶毛的发育，在水稻叶片发育，在番茄子房与果实发育、次生壁的合成，在马铃薯块茎的形成等方面发挥着重要的作用；另一种类型是产生两个成熟的miRNA(miRNA156-5p、miRNA156-3p)，目前已经在7个物种中发现了47个可以产生两个成熟的miRNA的miR156基因，然而尚未见到关于这种类型miR156基因的功能的报道。技术实现要素：本发明的目的在于通过对蓝莓miR156基因进行预测、确定，进一步研究其功能，从而在miRNA水平上挖掘蓝莓生长发育调控因子，为利用分子和遗传等手段针对性的改良和培育优质蓝莓品种提供依据和思路。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种蓝莓miR156基因的克隆产物，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNO:2。本发明的有益之处在于：通过对蓝莓miR156基因进行预测、确定，并进一步研究其功能，从而在miRNA水平上挖掘蓝莓生长发育调控因子，为利用分子和遗传等手段针对性的改良和培育优质蓝莓品种提供了依据和思路。附图说明图1是克隆蓝莓miR156基因得到的三种不同长度的产物的凝胶电泳图；图2(a)是野生型拟南芥植株(最左边一盆)与蓝莓miR156转基因拟南芥植株(右边三盆)的对比图；图2(b)是野生型拟南芥抽苔时叶片生长图；图2(c)是蓝莓miR156转基因拟南芥抽苔时叶片生长图；图2(d)是野生型拟南芥植株与蓝莓miR156转基因拟南芥植株抽苔时叶片数对比图；图3(a)是野生型拟南芥植株(最左边两盆)与蓝莓miR156转基因拟南芥植株(最右边一盆)花后形态对比图；图3(b)是图3(a)的局部放大图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一、从蓝莓中提取基因组1、蓝莓叶片取材双手戴PE手套，剪取蓝莓叶片放入袋中，迅速冻入液氮里，然后将冻好的叶片放在研钵中研碎，将粉末放入管中，放入-80℃备用。2、用CTAB法提DNA(1)在离心管中加入100mg叶片粉末，加入300ulCTAB于离心管中并摇晃，要快。(2)把离心管放入65℃水浴锅中15min，每5min摇晃一次，把沉底的组织摇晃均匀。(3)向离心管中加入300ul氯仿，混合，放入常温环境10min。将蛋白质等物质变性。(4)将离心管放入离心机中，10000rpm离心15min。(5)转移上清液到新的离心管中，注意不要吸入杂质。(6)向离心管中加250ul异丙醇，摇匀，于-20℃放置30min。(7)再次将离心管放入离心机中，10000rpm离心15min。(8)将上清液倒掉，用纸巾吸水。(9)加入500ul70％的乙醇洗两次，然后10000rpm离心5min。(10)倒掉上清液，干燥。3、用RNA酶处理DNA(1)取6ulRNA酶，用700ul去离子水稀释后取350ul加到一个离心管中，向离心管中加入350ulDNA。(2)另取两个离心管放入65℃水浴中加热5min。(3)将离心管中的溶液平均分到两个温热后的离心管中，每个离心管内有350ulDNA溶液。(4)向每个离心管内加入350ul氯仿，12000rpm离心10min。(5)抽取上清液加到另一离心管内，此时再换一个离心管，将氯仿溶液混有的少量上清液吸出，12000rpm离心10min。取上清液加入到前一离心管中。(6)向每个离心管中加600ul异丙醇和60ulNaAc，放在-20℃静置过夜。(7)12000rpm离心10min，去掉废液。(8)用乙醇反复清洗3次，晾干。二、预测蓝莓基因组中含有miR156基因基于EST的比较基因组学方法是识别保守miRNAs的一种重要方法，尤其是在基因组信息较少的物种中展开保守miRNAs的鉴定具有一定的优势。蓝莓的基因组信息较少，NCBI数据库释放的数据表明越橘属共有22402条ESTs，3276条核酸序列，1820条蛋白序列。miR156基因是植物中最保守的miRNA之一，目前在45种植物中发现627个miR156基因，且成熟miR156的序列相同或者及其相似。因此，我们利用基于EST的比较基因组学方法来预测蓝莓基因组中含有miR156基因。详细过程：1、从miRBase数据库中下载植物中所有的成熟miR156的序列。2、用这些成熟miR156的序列，在NCBI数据库中对越橘属EST进行BLAST搜索与比对，挑选能够与成熟miR156序列匹配的且为非编码蛋白的EST。3、用mFOLD对该EST的序列进行二级结构预测，二级结构需满足以下几个条件：(1)成熟miRNA的序列必需在二级结构的臂上；(2)成熟miRNA的序列与miRNA*最大错配为3；(3)MEE与MEEI的值要符合miRNA的标准；(4)前体序列具有一定的进化保守性。经过这个筛选流程，我们预测在NCBI数据库中Accessionnumber为JK653142的EST可能为miR156基因转录本。三、证明蓝莓miR156基因的真实性1、克隆蓝莓基因组序列为了证明我们预测的miR156基因的真实性，也为了确定该基因能够产生成熟miR156的有效片段，我们分别克隆了3段不同长度的包涵miR156前体序列的基因片段，分别将3段基因片段命名为Pre-miR156F、Pre-miR156M和Pre-miR156S。克隆的过程：(1)PCR引物设计miR156F-F：GCggatccTTCTACAGCTCTCCCAC。miR156F-R：GGgagctcTGAAAGTTTACAAAGTGCGA。miR156M-F：GCggatccTGTTAAGGGCAGCAGCAG。miR156M-R：GGgagctcGGAAGAAGGTGATTGAAGC。miR156S-F：GCggatccGGTAGCTAGGAATAGGAGGG。miR156S-R：GGgagctcGAGAGGGAGAGAGAATATGG。(2)PCR扩增PCR扩增体系：成分加样量蓝莓DNA模板1μldNTPMixture1.6μl10×ExTaqBuffer2μl上游引物0.8μl下游引物0.8μlExTaq酶0.2μl无菌水13.6μlPCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。克隆的结果：我们对克隆得到的三种不同长度的产物进行了凝胶电泳，电泳结果见图1。由图1我们可以看出：Pre-miR156F的长度为800bp～900bp，Pre-miR156M的长度为400bp～500bp，Pre-miR156S的长度为200bp～300bp。同时，我们对克隆得到的三种不同长度的产物进行了测序，其中，Pre-miR156F的核苷酸序列为SEQIDNO:1。Pre-miR156M的核苷酸序列为SEQIDNO:2。Pre-miR156S的核苷酸序列为SEQIDNO:3。2、将克隆产物转入到植物中(1)连接连接体系：成分加样量克隆回收的PCR产物3.5μlPGM-T0.5ul10XT4DNAligationbuffer0.5ulT4-ligase0.5ul连接条件：16℃过夜，75℃终止。(2)转化LB固体配置：成分用量胰蛋白胨10g/L氯化钠10g/L酵母提取物5g/L琼脂10g/L转化步骤：(a)把感受态放在冰上，将5ul连接后的产物(即上一步的产物)加入到50ul感受态中，混匀，放在冰上30-40min。(b)90s计时，将混合的感受态放入水浴锅热激(42℃)之后立即放到冰上1-2min，然后加入500ul纯净的LB液体培养基，弹匀。(c)放入37℃摇匀箱，180-200rpm摇45min-1h。(d)离心，倒掉大部分上清，只留100ul，然后用枪头吸打开，再图板。(e)将培养皿放入37℃恒温箱，倒置放置12-16h。(f)取挑菌专用miliqwater20ul加入1.5ml离心管中，挑取单菌落于离心管中，吸打。(g)取4-5ml的LB液体培养基，加入10ml离心管中，加4-5ul氨苄，吸取20ul菌液加入其中，吸打，然后把枪头打进去，37℃摇混。(h)吸500ul菌液，吸打后再吸，然后加入500ul甘油(50％)，保菌。(3)将基因构建到双元载体上(a)将带有目的基因的大肠杆菌提质粒，酶切。(b)通过NEBcutter2.0对miR156前体序列进行分析,确定合适的限制性内切酶BamHISacI。酶切体系：成分加样量质粒10μlBamHI1.5ulSacI1.5ul10xBuffer10ulMiliqwater77ul酶切条件：37℃，4个小时。跑电泳检测，跑胶回收：(a)同时将双源载体PBI121用限制性内切酶BamHI与SacI酶进行双酶切，回收。(b)连接转化。(c)提质粒，PCR检测是否有目的基因。经过检测，我们发现Pre-miR156F、Pre-miR156M和Pre-miR156S均成功的构建到了pBI121目标载体上。(4)转入拟南芥中我们又将不同长度的产物(Pre-miR156F、Pre-miR156M、Pre-miR156S)分别转入到不同株拟南芥中，具体过程如下：利用拟南芥蘸花侵染法进行遗传转化1)转农杆菌(a)准备1ml、100ul、10ul的枪和枪头，1.5ml离心管，LB液体培养基，电转杯。(b)500ulLB中加0.5ul利福平。(c)50ul农杆菌感受态，3ul质粒，加入电转杯中电击。(d)加入500ul含0.5ul利福平的LB。(e)用枪头吸出加入到1.5ml离心管中，在28℃摇床摇2h。(f)5000rpm离心5min。(g)倒掉上清，用剩余LB将菌混匀，涂在KanRif板中，在28℃恒温箱中培养两天。2)培养农杆菌3)拟南芥蘸花浸染(a)在上述的KanRif板中挑单菌落，做菌落PCR，挑选阳性菌，加入5mlLB液体培养基(LB+kana25mg/L+利福平20mg/L)，在28℃条件下培养24-36小时。(b)将取1ml上述的农杆菌液，并以1：100的比例用LB液体培养基(LB+kana25mg/L+利福平20mg/L)进行稀释，在28℃条件下培养12-20小时直至OD600值为1左右。(c)离心，收集菌，并用200ml含有0.02％SilwetL-77的蔗糖溶液(5％)将菌悬浮，将拟南芥的花蕾全部浸到菌液中，2min计时，然后用黑塑料袋进行黑暗处理16-20小时，放入培养室中按照拟南芥的常规培养方法培养。4)收种将侵染后的苗培养至产生成熟的种子，收其种子，放入1.5ml离心管中，干燥处理。5)获得T2代种子(a)将野生型拟南芥的种子，野生型转miR156基因拟南芥的种子，miR156下调突变体转miR156基因拟南芥的种子加水在4℃春化3天。(b)配置筛选MS培养基，MS培养基配好灭好菌后加入50mg/ml的kana，1000倍稀释倒板。(c)将春化的种子点在板上，然后封上保鲜膜。(d)过几天后将长得壮硕的小苗移到土(草炭土：蛭石＝3:1)中(e)T1植株成熟后分株收种子，获得T2代种子，干燥处理。6)种出T2代幼苗观察表型通过观察我们发现：拟南芥确实出现了不同的表型，并且这种不同的表型是由三种克隆产物中的Pre-miR156M过表达导致的。拟南芥出现了不同的表型，这也证明了我们预测的miR156基因的真实性。3、其他此外，根据我们后续的分析发现，该蓝莓miR156基因可以产生两个成熟的miRNA，分别记为miRNA156-5P、miRNA156-3P，其中：miRNA156-5P的核苷酸序列为：UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC。miRNA156-3P的核苷酸序列为：GCUCUCUAUGCUUCUGUCAUCA。四、研究Pre-miR156M对植物的影响1、Pre-miR156M对植物叶片的影响图2(a)是野生型拟南芥植株(最左边一盆)与蓝莓miR156转基因拟南芥植株(右边三盆)的对比图。从图中我们可以看到：同一生长时期的野生型拟南芥植株与蓝莓miR156转基因拟南芥植株之间存在着很多的差异，其中叶片数量是一个典型的表型，蓝莓miR156转基因拟南芥叶片数量明显多于野生型拟南芥植株叶片数量。图2(b)和图2(c)分别是野生型拟南芥植株和蓝莓miR156转基因拟南芥植株抽苔时叶片生长图。从图中可以清晰的看到：野生型拟南芥植株只有16片叶，而蓝莓miR156转基因拟南芥植株却有29片叶。图2(d)是野生型拟南芥植株与蓝莓miR156转基因拟南芥植株抽苔时叶片数对比图。从图中可以看出：野生型拟南芥植株只有16片叶片，而蓝莓miR156转基因拟南芥3个植株却分别具有33片、30片、29片叶片，叶片数量约是野生型拟南芥植株的2倍。由此可见，蓝莓miR156基因具有促进植株营养生长的功能。2、Pre-miR156M对植物开花时间的影响图3(a)是野生型拟南芥植株(最左边两盆)与蓝莓miR156转基因拟南芥植株(最右边一盆)花后形态对比图。图3(b)是图3(a)的局部放大图。从图中可以看出：野生型拟南芥植株与蓝莓miR156转基因拟南芥植株二者开花时期不同(野生型拟南芥植株30天左右即开花，Pre-miR156M过表达的拟南芥植株60天左右才能开花)，野生型拟南芥植株已经有大量果荚和分枝时，蓝莓miR156转基因拟南芥植株才刚开始开花，蓝莓miR156转基因拟南芥植株的开花时期明显晚于野生型拟南芥植株的开花时期。由此可见，蓝莓miR156基因具有推迟开花时间的功能。五、结论拟南芥植株小(1个茶杯可种植好几棵)、每代时间短(从发芽到开花不超过6周)、结子多(每棵植物可产很多粒种子)、生活力强(用普通培养基就可作人工培养)，其基因组是目前已知植物基因组中最小的，每个单倍染色体组(n＝5)的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。拟南芥这种小小的有花植物是植物科学(包括遗传学和植物发育)研究中的模式生物之一，其在农业科学中所扮演的角色和小鼠、果蝇在人类生物学中扮演的角色一样，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为"植物中的果蝇"。我们将蓝莓miRNA156基因的克隆产物(Pre-miR156M)转入到了拟南芥植株中，对植株的叶片生长速度、叶片数量以及开花时间进行了研究，发现蓝莓miRNA156基因不仅具有促进拟南芥植株营养生长的功能，而且具有推迟拟南芥开花时间的功能。由于拟南芥是植物科学研究中的模式生物之一，是"植物中的果蝇"，所以基于上述研究结果，我们可以确定的得出下面的结论：蓝莓miR156基因不仅具有促进蓝莓营养生长的功能，而且具有推迟蓝莓开花时间的功能，因此其可以应用在改良和培育优质蓝莓品种中。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3