本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体为一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法。
背景技术：
寡雄腐霉属于卵菌门腐霉科腐霉属，是一种土壤习居型腐生菌，其能够在多种重要的农作物根围定殖，对植物和动物都没有毒性，对环境安全。寡雄腐霉的菌丝可以寄生于病原菌体内，干扰寄主的代谢活动，消耗细胞内的养分，造成病菌死亡，同时，还能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生长活性物质，促进植物生理代谢，养分吸收和生长发育。寡雄腐霉不仅对多数致病真菌有很强的寄生或拮抗作用，并且能诱导农作物产生系统抗性，是一种非常有应用价值的生防真菌。对其进行更进一步的研究利用，特别是从分子水平对其进行基因功能利用、遗传性状改良等方面研究势在必行。
农杆菌是广泛存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，其细胞中存在Ti质粒，包含可转移的T-DNA区域。在农杆菌侵染受体细胞后，T-DNA可与受体材料的基因组DNA结合并稳定遗传。农杆菌介导的基因转化方法最先也是最广泛地应用于植物，近年来也多为成功的应用于丝状真菌。与传统的真菌遗传转化方法相比，农杆菌介导的转化方法对受体材料要求简单、能得到较多单拷贝的T-DNA插入转化子、转化率更高、转化子稳定遗传性高，此种方法更适合于丝状真菌的DNA插入突变、基因标记、基因改造等方面的研究。
虽然丝状真菌转化的基本过程相同，但不同真菌转化所需要的转化参数存在差异，需要针对不同真菌的转化条件进行摸索。目前国内外未见关于农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化研究的报道。参考其他丝状真菌的转化方法无法顺利进行转化。
传统的农杆菌介导的遗传转化方法中，农杆菌与侵染对象混合后采用硝酸纤维素膜或滤纸等辅助的固体培养方式对转染的细菌或真菌进行共培养及选择培养，需要在培养基平板上铺膜，揭膜再铺膜的一系列操作步骤，过程繁杂，易污染，容易降低转化率，对实验的最终结果造成巨大影响，这一方法亟待改进。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述问题，提供一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化的方法，通过此方法可得到寡雄腐霉工程菌株，可用于从分子水平上进行寡雄腐霉基因功能、基因改良等相关基因遗传转化的研究应用，并且简化、优化了转化后抗性菌株培养筛选阶段的程序，提高了转化率。
本发明的内容，是提供一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化的方法，具体步骤如下：
（1）寡雄腐霉菌丝孢子悬浮液制备。
将寡雄腐霉菌丝接种在PDA平板上培养，用诱导培养基IM冲洗平板，将平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌丝冲洗下来，制备为寡雄腐霉孢子菌丝悬浮液。
作为优选，菌丝孢子悬浮液的浓度为1×106～7个/mL。
作为优选，诱导培养基IM为：PDB+300uM乙酰丁香酮，pH值为5.0。
（2）包含目的基因载体的农杆菌侵染用菌液制备。
从农杆菌工程菌株抗性平板上挑取单克隆，于5ml LB（Rif+相应载体抗生素）液体培养基中振荡培养活化；吸取上述菌液于新的LB（Rif+相应载体抗生素+乙酰丁香酮）液体培养基中扩大10倍培养； 4℃，5000rmp离心10min，收集菌体，用诱导培养基IM重悬稀释菌体，最终获得的农杆菌菌液浓度OD600为0.3～0.7。
作为优选，诱导培养基IM为：PDB+300uM乙酰丁香酮，pH值为5.0。
作为优选，农杆菌菌液浓度OD600为 0.6。
（3）农杆菌菌液侵染寡雄腐霉悬浮液。
上述获得的含有目的基因载体的农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液混合共培养，使农杆菌侵染寡雄腐霉，将目的基因导入寡雄腐霉中。农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液比例为：1～10 ：1。共培养条件为：避光，25℃， 60rmp培养不少于24h。
作为优选，共培养时间为48-96h。
（4）恢复培养。
向上述农杆菌与寡雄腐霉混合菌液中加入细菌抗生素恢复培养，培养条件为26℃,120rmp培养24～48h。
作为优选，加入的细菌抗生素为头孢霉素，浓度为200 mg/L。
（5）转化子的筛选。
经恢复培养的寡雄腐霉菌液，离心收集菌体，用PDB重悬，涂布添加有抗性选择压的PDA平板，于26℃培养，抗性选择压筛选寡雄腐霉转化子。
将抗性单菌落接种于新的添加有抗性选择压的PDA平板，于26℃培养。待菌丝生长铺满平板，从边缘挑取菌丝接种于无选择压的PDA平板上进行传代培养以检测其稳定性，将剩余寡雄腐霉抗性菌体收集提取基因组DNA进行PCR检测其目的基因插入与否。
本发明采用液体共培养及液体恢复培养的方式将含有目的基因载体的农杆菌侵染菌液与寡雄腐霉菌丝孢子悬浮液以适当比例混合侵染后进行共培养以及恢复培养，直接将菌液离心收集，涂布于添加抗性选择压的平板上筛选寡雄腐霉抗性转化子，将抗性转化子单克隆菌体纯化培养并鉴定。此发明的方法中添加了恢复培养阶段，有利于除去农杆菌并使被侵染后的寡雄腐霉特别是寡雄腐霉原生质体恢复生长活力；采用液体共培养及液体恢复培养的方式，省去了共培养及恢复培养阶段的平板制备及铺膜、揭膜程序，简化了操作流程，减少了污染机会，并且方便挑取抗性单菌落进行纯化培养与鉴定。本发明首次对农杆菌介导的寡雄腐霉的基因遗传转化进行研究，提供了一套简单便行的转化方法，为利用该生防真菌的功能基因及对其性状进行改造提供了研究途径。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
以下实验选用转化载体的抗性筛选标记为：Kan抗性基因和Bar抗性基因；载体上包含：GFP基因，gpdA启动子，trpC终止子。
以下实例所选用农杆菌菌株为EHA105，LBA4404，AGL1，以及使用的寡雄腐霉菌株均由本实验室保存。
以下实验中使用的培养基配方如下：
PDA：马铃薯200 g/L，切块煮烂，用纱布过滤掉马铃薯残渣，加入葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，用水定容至1L。高压灭菌待用。
PDB：马铃薯200 g/L，切块煮烂，用纱布过滤掉马铃薯残渣，加入葡萄糖20g/L，用水定容至1L。高压灭菌待用。
IM渗透培养基：PDB+300 uM乙酰丁香酮，pH值为5.0。
实施例一采用寡雄腐霉菌丝孢子悬液进行农杆菌介导遗传转化实验
（1）将寡雄腐霉菌丝接种在PDA平板培养基上，26℃，培养6d，用2～4mL 诱导培养基IM冲洗平板，将平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌丝冲洗下来，使成为浓度1×107个/mL的孢子菌丝悬浮液。
（2）从含有目的基因载体的农杆菌工程菌株抗性平板上挑取单克隆，于5ml LB（50mg/L 利福平Rif + 50mg/L 卡那霉素Kan）液体培养基中，28℃，200rmp振荡培养20h；吸取上述菌液2mL于20mL LB（50mg/L Rif + 50mg/L Kan + 300 uM乙酰丁香酮）液体培养基中培养，28℃，240rmp培养至OD600为2.5；4℃，5000rmp离心10min，收集菌体，用IM渗透培养基（PDB+300 uM乙酰丁香酮，pH值为5.0）重悬稀释菌体，使菌液OD600为0.6。
（3）将上述侵染用农杆菌菌液与寡雄腐霉孢子菌丝悬浮液等体积混合。
（4）上述混合菌液于25℃，60rmp避光振荡培养72h。
（5）向上述共培养的混合菌液中加入200mg/L头孢霉素（Cef），于26℃，120rmp恢复培养24h。
（6）将恢复培养后的寡雄腐霉菌体离心收集，用PDB重悬并涂布抗性选择平板（PDA + 200mg/L Basta + 200mg/L Cef），于26℃培养。
（7）从上述平板上挑取抗性单克隆菌落，接种于新的抗性选择平板（PDA + 200mg/L Basta + 200mg/L Cef），待菌丝生长铺满平板，从边缘挑取菌丝接种于无选择压的PDA平板上进行传代培养以检测其稳定性，将剩余寡雄腐霉抗性菌体收集提取基因组DNA进行PCR检测。
实验结果：恢复培养后的菌体涂布抗性选择平板，2天后抗性选择平板上布满菌落，随机挑取100个抗性菌落分别接种在新的抗性选择平板上3天后菌丝铺满平板。分别提取基因组DNA进行PCR扩增，100个寡雄腐霉转化子均为阳性，传5代后置于抗性选择平板上依旧具有Basta抗性。
实施例二 不同共培养时间对遗传转化的影响实验。
参照实施例一中所述方法，将农杆菌菌液与寡雄腐霉菌丝孢子悬浮液共同培养不同时间，依据PCR检测结果确定最佳的共培养时间，实验结果如下表所示：
由实验结果可见，当农杆菌菌液与寡雄腐霉菌丝、孢子悬浮液共同培养时间在48～96h时，可以获得很好的转化效果。
实施例三 恢复培养对遗传转化的影响实验。
参照实施例一中所述方法，农杆菌菌液与寡雄腐霉菌丝、孢子悬浮液共同培养后是否经历恢复培养及恢复培养时间，实验结果如下表所示：
由实验结果可见，恢复培养阶段可以很好的促进被侵染后的寡雄腐霉菌体恢复生长活力增加转化效果，恢复培养24～48h均可。
实施例四 农杆菌菌液浓度对遗传转化的影响实验。
参照实施例一中所述方法，采用不同浓度农杆菌菌液侵染寡雄腐霉菌丝、孢子，依据PCR检测结果确定最佳的菌液浓度，试验结果如下表所示：
通过实验可见，农杆菌侵染寡雄腐霉的适宜侵染浓度OD600在0.3～0.7，OD600为0.6时转化率最高。
实施例五 农杆菌菌液侵染寡雄腐霉时二者的体积比测试实验。
参照实施例一中所述方法，采用不同体积比例的农杆菌菌液与寡雄腐霉菌丝、孢子悬浮液进行侵染，依据PCR检测结果确定最佳的侵染比例，试验结果如下表所示：
由实验结果可见，当农杆菌菌液与寡雄腐霉菌丝、孢子悬浮液的比例在1～10 ： 1时，可以获得很好的转化效果。
实施例六 寡雄腐霉悬浮液浓度对转化的影响。
参照实施例一中所述方法，采用不同浓度的寡雄腐霉悬浮液进行侵染，依据PCR检测结果确定最佳的悬浮液浓度，试验结果如下表所示：
由实验结果可见，当寡雄腐霉菌丝、孢子悬浮液的浓度在1×106～7个/mL时，可以获得很好的转化效果。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实例方式，本领域技术人员可在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。