一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法与应用与流程

本发明涉及一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术：

海藻糖(Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经α-1,1-糖苷键连接构成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。研究表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一，因此在科学界海藻糖有“生命之糖”的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。

鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。

海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalose synthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的外源表达的海藻糖合酶基因工程菌都是通过大肠杆菌构建的基因工程菌株，并且只是胞内表达。然而，和大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌是一种食品安全的微生物，而且其分泌蛋白能力较强。本发明通过基因工程的手段，将海藻糖合酶基因构建到枯草芽孢杆菌分泌表达载体上，利用电转化的方法将分泌表达载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以分泌表达海藻糖合酶的基因工程菌，并将其应用到生产食品医药级海藻糖的生产中去。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法与应用。本发明利用前期筛选到的能够分泌表达海藻糖的信号肽NprE，在商品化载体pHT01的基础上构建一个可以将海藻糖合酶分泌表达的载体，通过高效的电转化方法将分泌表达载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以分泌表达海藻糖合酶的基因工程菌。

本发明技术方案如下：

枯草芽孢杆菌高效分泌表达海藻糖合酶的重组表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述重组表达载体与文献报道的枯草芽孢杆菌表达载体pHT01载体相比，加上了中性蛋白酶的信号肽片段NprE，该信号可以将目的蛋白海藻糖合酶分泌到细胞外进行表达。海藻糖合酶分泌到细胞外后，通过对发酵液硫酸铵沉淀后得到较纯的蛋白酶液。

一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，PCR扩增Sec途径中的NprE信号肽序列；以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的基因组为模板PCR扩增海藻糖合酶序列ps TreS；

所述NprE信号肽序列的PCR引物序列如下：

NprE-F：5’-AAAGGAGGAAggatccATGGGTTTAGGTAAGAA-3’；SEQ ID NO.3

NprE-R：5’-GAATGCTCATactagtAGCCTGAACACC-3’；SEQ ID NO.4

所述海藻糖合酶序列ps TreS的PCR引物序列如下：

ps TreS-F：5’-actagtATGAGCATTCCAGA-3’；SEQ ID NO.5

ps TreS-R：5’-tctagaTTAGATCACCGGGGATGC-3’；SEQ ID NO.6

(2)采用重叠PCR将步骤(1)制得的信号肽序列NprE与来源于施氏假单胞菌的海藻糖合酶序列ps TreS融合，制得NprE-ps TreS片段；NprE-ps TreS融合基因片段基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将步骤(2)中制得的NprE-ps TreS片段经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后，与同样经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后的pHT01质粒连接，转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pHT01-NprE-ps TreS；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌中，通过氯霉素平板筛选后，制得分泌表达海藻糖合酶基因工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增NprE信号肽的反应体系如下：

2×Pfu mix 25μL，10μmol/L上游引物(NprE-F)1μL，10μmol/L下游引物(NprE-R)1μL，模板1μL，用ddH₂O补足50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增海藻糖合酶序列ps TreS的反应体系如下：

2×Pfu mix 25μL，10μmol/L上游引物(ps TreS-F)1μL，10μmol/L下游引物(ps TreS-R)1μL，模板1μL，用ddH₂O补足50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min,30个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

海藻糖合酶序列ps TreS 4μL；NprE信号肽片段4μL；2×Pfu mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30s，5个循环；72℃延伸10min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μL：

上游引物(NprE-F)2μL；下游引物(ps TreS-R)2μL；2×Pfu mix 12.5μL；ddH₂O 8.5μL；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。枯草芽孢杆菌WB800N来源于杭州宝赛生物有限公司。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，电转化的条件如下：

将感受态细胞在2100V条件下进行电转化5ms。

上述分泌表达海藻糖合酶基因工程菌在制备海藻糖合酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

将分泌表达海藻糖合酶基因工程菌在TB培养基中扩大培养至生长对数期，向TB培养基中加入IPTG至终浓度1μM，37℃诱导12h，离心，取上清液，蛋白浓缩，制得海藻糖合酶。

根据本发明优选的，所述离心条件为4℃，10000rpm，20min。

根据本发明优选的，所述蛋白浓缩为膜浓缩；进一步优选的，所述膜浓缩为用孔径大小为0.2μm超滤膜浓缩。

上述TB培养基为本领域常规培养基，每升组分如下：

蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH₂PO₄ 2.31g，K₂HPO₄ 12.54g，甘油4ml。

有益效果

1、本发明首次在重组载体中加入信号肽片段NprE，该信号可以将目的蛋白海藻糖合酶分泌到重组工程菌的细胞外进行表达，从而极大简化了后续酶分离纯化的步骤；

2、本发明所述工程菌直接将外源蛋白分泌到培养基中，无需对细胞破碎，就可以得到目的酶液，且采用的枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，其遗传背景清楚，遗传操作系统完善而精确，可保证最终的表达系统处于完全食品级的地位，达到食品安全级的标准，为下游海藻糖工业化生产奠定了基础。

3、本发明采用高拷贝游离重组质粒表达海藻糖合酶基因可以提高目的基因海藻糖合酶的拷贝数，从而提高外源基因的表达量，实现海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

附图说明

图1是pHT01-NprE-ps TreS载体构建示意图；

图2a是NprE信号肽的琼脂糖凝胶电泳图；

图2b是来源于施氏假单胞菌的海藻糖合酶序列ps TreS的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是NprE-ps TreS融合片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图4是pHT01质粒BamHⅠ/XbaⅠ双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌168购自杭州宝赛生物有限公司；

枯草芽孢杆菌WB800N购自杭州宝赛生物有限公司；

穿梭质粒pHT01购自杭州宝赛生物有限公司；

施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)购自中国科学院微生物菌种保藏中心(CGMCC)；

实施例1：构建重组质粒

(1)克隆得到信号肽基因片段

以枯草168的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，得到NprE信号肽片段。

所述的PCR引物序列如下：

NprE-F：5’-AAAGGAGGAAggatccATGGGTTTAGGTAAGAA-3’

NprE-R：5’-GAATGCTCATactagtAGCCTGAACACC-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Pfu mix 25μL，10μmol/L上游引物(NprE-F)1μL，10μmol/L下游引物(NprE-R)1μL，模板1μL，用ddH₂O补足50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。

(2)克隆得到施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)海藻糖合酶基因

依据NCBI上公开的施氏假单胞菌海藻糖合酶全长核苷酸序列设计引物，引物序列如下：

ps TreS-F：5’-actagtATGAGCATTCCAGA-3’

ps TreS-R：5’-tctagaTTAGATCACCGGGGATGC-3’

以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的基因组为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

2×Pfu mix 25μL，10μmol/L上游引物(ps TreS-F)1μL，10μmol/L下游引物(ps TreS-R)1μL，模板1μL，用ddH₂O补足50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。

(3)将步骤(1)制得的NprE信号肽片段与步骤(2)制得的施氏假单胞菌海藻糖合酶基因片段进行重叠PCR，制得NprE-ps TreS片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

海藻糖合酶序列ps TreS 4μL；NprE信号肽片段4μL；2×Pfu mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30s，5个循环；72℃延伸10min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μL：

上游引物2μL；下游引物2μL；2×Pfu mix 12.5μL；ddH₂O 8.5μL；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。-20℃保存；

(4)将步骤(3)中制得的NprE-ps TreS片段经BamHⅠ/XbaⅠ双酶切与同样双酶切后的pHT01质粒连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pHT01-NprE-ps TreS。

所述PCR产物酶切体系为：

PCR产物50μL；BamHⅠ2.0μL；XbaⅠ2.0μL；10×buffer K 6.0μL；

反应条件：37℃反应4h。

所述pHT01质粒酶切体系为：

pHT01质粒50μL；BamHⅠ2.0μL；XbaⅠ2.0μL；10×buffer K 6.0μL

反应条件：37℃反应4h。

PCR产物和载体双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收，然后用DNA胶回收试剂盒进行胶回收。

所述连接体系为：

pHT01酶切质粒5.0μL；酶切后的PCR产物3.0μL；10×T4buffer 1.0μL；T4-DNA Ligase1.0μL

反应条件：16℃反应10h。

将连接好的NprE-ps TreS基因和pHT01连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

实施例2：枯草芽孢杆菌WB800N电转感受态细胞的制备

挑取新鲜LB固体培养基表面的枯草芽孢杆菌WB800N单菌落于5ml LB培养基中，过夜培养。取2.5mL过夜培养物接入40mL菌体增殖培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.85～0.95之间。将菌液冰水浴10min，然后5000g，4℃离心5min，收集菌体。用50mL预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)重悬菌体，5000g，4℃离心5min，去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，分装于EP管，每管分装60μL。

实施例3：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800N中

将50ng质粒DNA(1～8μL)加入到60μl感受态细胞中，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2100V条件下进行电转化5ms。电击完毕后，取出杯子并立即加入1mL菌体复苏培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，200rpm振荡复苏培养3h后，涂布于含氯霉素的LB平板上。37℃培养箱培养过夜。筛选抗氯霉素的菌株。

实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定

将上述的阳性重组菌落，接种到LB液体培养基中(含氯霉素)培养过夜，吸取1mL菌液，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别以ps TreS-F，ps TreS-R和NprE-F，NprE-R为引物进行PCR扩增。

所述菌落PCR的初次扩增体系为20μL：

上游引物1μL；下游引物1μL；模板2μl；2×Pfu mix 10μL；ddH₂O 6μL；

所述的菌落PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min 30s，30个循环；72℃延伸10min；

琼脂糖凝胶电泳证明外源片段ps TreS和NprE信号肽均已分别连接到pHT01质粒上。

实施例5：阳性重组菌的发酵

将实施例4构建好的重组菌pHT01-NprE-ps TreS接种于50mL LB液体培养基中(含浓度25μg/mL的氯霉素)，37℃，200rpm培养过夜，次日按1％接种量转接于TB培养基中，培养7h至生长对数期，加入IPTG至终浓度为1μM，37℃诱导12h，取发酵液在4℃，10000rpm条件下离心20min，上清即为胞外粗酶液。用于酶活力的测定。

上述TB培养基为本领域常规培养基，每升组分如下：

蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH₂PO₄ 2.31g，K₂HPO₄ 12.54g，甘油4ml。

上述LB液体培养基，每升组分如下：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0。

实施例6：海藻糖合酶酶活的检测

在反应体系中加入500μL 60％的麦芽糖溶液，500μL胞外粗酶液。在37℃下反应12h。通过高压液相的方法测定海藻糖的转化率，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者比例为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为25min。按照如下公式计算转化率。

根据高效液相结果中麦芽糖峰面积，海藻糖峰面积及葡萄糖峰面积利用软件拟合得到曲线，计算三者的质量，其中m3为转化为海藻糖的质量，m2为转化为葡萄糖的质量，m1为剩余麦芽糖的质量。

结果表明，本发明所构建的海藻糖合酶基因工程菌能够实现海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。胞外粗酶液中的麦芽糖转化为海藻糖的转化率可达72％。具有广泛的工业应用前景。

对比例1

将来源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的海藻糖合酶克隆到穿梭质粒pHT43中，该质粒含有AmyQ信号肽，通过用IPTG作为诱导剂诱导其表达，成功实现了其在枯草芽孢杆菌中的胞内表达，但是未能实现其胞外表达。

对比例2

根据中国专利文献CN103215300A(申请号201310174692.7)中公开的内容，将海藻糖合酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌。结果显示，总的麦芽糖转化为海藻糖的转化率达63.1％。

本发明是将海藻糖合酶基因克隆到穿梭质粒pHT01中，通过电转化的方法将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB800N中，该质粒不仅在枯草芽孢杆菌中能够稳定的遗传，而且因其拷贝数较高，其携带的目标基因剂量也相应增加，因此，本发明所构建的海藻糖合酶基因工程菌能够实现海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，其麦芽糖转化为海藻糖的转化率高达72％。相比较整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶来说，采用本发明的方法生产海藻糖合酶显得更加有优势。