一种重组大肠杆菌全细胞转化合成D‑阿洛酮糖的方法与流程

本发明涉及一种重组大肠杆菌全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

稀少糖是指在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀少糖通常具有蔗糖的甜度，但机体不能代谢或者代谢很少，可作为高热量糖的替代物。稀少糖在食品、医药、保健等领域具有广泛的应用前景。

D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位的差向异构体，是自然界中含量非常低的稀少糖。D-阿洛酮糖具有甜度高、溶解性好、低卡路里和低血糖反应等优点，能够作为最理想的蔗糖替代品之一。在食品中添加D-阿洛酮糖，不仅能提高它的胶凝度，还可以与食品蛋白发生美拉德反应改善其风味。2011年，D-阿洛酮糖已经被美国FDA认证安全，可在食品和膳食领域作为添加剂使用。在医药保健领域，D-阿洛酮糖可以通过抑制脂肪酶和α-糖苷酶，降低体内脂肪的积累和抑制血糖浓度的上升。在膳食中添加D-阿洛酮糖可以降低餐后血糖反应，提高胰岛素的敏感性和葡萄糖耐受性。此外，D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧自由基，在治疗神经组织退化和动脉粥样硬化等相关疾病具有潜在功能。

D-阿洛酮糖在自然界含量极少且难以通过化学途径合成。由于生物转化法具有反应条件温和、副产物少、纯化步骤简单、绿色环保等优点而逐渐成为D-阿洛酮糖合成的主要方向。D-阿洛酮糖的生物转化主要分为以全细胞转化和利用纯酶或对纯酶固定化后进行转化。目前主要的合成方法采用以D-果糖为底物，在D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-Psicose 3-epimerase，缩写为DPE)的作用下合成D-阿洛酮糖。目前利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的报道比较少，相对于纯酶转化，全细胞转化合成D-阿洛酮糖工艺简单，更具备工业应用潜力。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的在于提供含有所述基因的载体或细胞系。

本发明的第三个目的在于提供所述基因编码的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明的第四个目的在于提供一种重组大肠杆菌，是以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因。

本发明的第五个目的在于提供所述重组大肠杆菌的构建方法，是将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe与pET28a连接，构建重组质粒pET28a-dpe，再将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。

本发明的第六个目的在于提供一种全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，是以D-果糖为底物，加入所述重组大肠杆菌湿菌体，60～70℃反应0.5-6h。

在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD₆₀₀为0.6～1.0时，加入终浓度为0.1-1.0mM IPTG，16-37℃诱导5～20h，收集湿菌体。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在16℃诱导10～20h。

在本发明的一种实施方式中，所述湿菌体用pH 7.5的缓冲液稀释，并在4℃保存。

在本发明的一种实施方式中，所述湿菌体浓度为2.5～30mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述含D-果糖的溶液pH为7～10，并添加0.3-0.7mM金属离子；所述金属离子包括Co²⁺，Mn²⁺。

本发明还提供所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在食品、医药、保健品领域的应用，所述应用包括：制备食品添加剂，制备辅助降血糖降血脂的食品、药品或保健品，以及制备用于清除活性氧自由基的产品。

有益效果：本发明提供的阿洛酮糖-3-差向异构酶具有良好的温度稳定性，在pH7～10的条件下转化生产D-阿洛酮糖的转化率达20％以上。本发明采用全细胞转化生产D-阿洛酮糖，转化率可达34％。相对于D-阿洛酮糖的纯酶转化法，全细胞转化合成D-阿洛酮糖无需分离纯化酶、具有工艺简单、成本低等特点，更适合大规模应用。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测DPE酶在大肠杆菌中的表达情况；1：蛋白marker；2：诱导前全细胞；3：诱导16h的全细胞；4：细胞裂解液上清；5：细胞裂解液沉淀；

图2为DPE在不同温度下的酶活；

图3为金属离子对DPE的稳定性的影响；A，添加Co²⁺；B，未添加Co²⁺；

图4为全细胞转化生产D-阿洛酮糖的转化率。

具体实施方式

酶活测定方法：向反应体系中加入适量酶液，在65℃反应20min后，高温煮沸5min以终止反应。将反应体系在15000rpm离心15min，上清液过0.22μM的水膜，通过高效液相色谱检测是否有D-阿洛酮糖产物的产生。

酶活的定义：在65℃，pH 8.5的条件下每分钟产生1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶的量定义为1U；相对酶活定义为最大酶活的百分比。

HPLC检测条件：采用色谱柱HPX-87H(300×7.8mm)，以5mM硫酸作为流动相，流速0.5mL/min，柱温箱温度60℃，用示差检测器进行检测。

实施例1重组大肠杆菌的构建

以经过密码子优化得到的dpe基因片段为模板，扩增dpe基因，获得如SEQ ID NO.1所示序列。扩增dpe基因的引物如下：

上游引物：5-GCGCGGATCCATGAAGCACGGTATCTATTA-3(BamHI)

下游引物：5-CCGGAAGCTTGGAGTGTTTGTGACATTCTA-3(HindIII)

PCR条件：94℃变性2min；98℃变性30s；50℃退火30s，68℃延伸2min。使用BamHI和HindIII两种限制性内切酶对pET-28a和PCR扩增的dpe基因37℃进行酶切，用T4连接酶16℃进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，用带有卡那霉素抗性的平板进行筛选，挑取转化子进行质粒提取、酶切验证和基因测序。将构建成功地重组质粒pET28a-dpe转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，挑取阳性转化子，得到重组大肠杆菌。

实施例2重组大肠杆菌的全细胞制备

将重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-dpe在含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养，待OD₆₀₀约0.8时，加入终浓度为0.1mM IPTG诱导，16℃诱导20h，用SDS-PAGE检测DPE酶在大肠杆菌中的表达情况，结果如图1所示。诱导完成后收集菌体，获得充足大肠杆菌全细胞。

实施例3DPE最适温度的确定

在不同温度下检测DPE活性，如图2所示。DPE在60～70℃有较好的温度稳定性，当温度为65℃，全细胞转化的DPE活性最高，在45℃时，活性可达到50％以上，在70℃的高温下仍保有90％左右的酶活。

实施例4DPE的温度稳定性

将收集的湿菌体在不同温度下(60℃、65℃、70℃)放置不同时间(0.5、1、2、4、8h)，每隔一段时间取出湿菌体，测定相对酶活，结果如表1所示，DPE在60℃有较好的稳定性，放置1h，相对酶活能维持在53.9％。随着温度的升高，DPE热稳定性逐渐降低，在80℃放置30min后酶活几乎完全丧失。

表1不同温度下DPE的相对酶活(％)

实施例5金属离子提高DPE酶活

为了测定金属离子对全细胞转化DPE酶活的影响，在不同金属离子存在下，以50mM Tris-HCl(pH 8.5)作为缓冲液，测定浓度为2.5mg/mL的湿菌体在65℃下的相对酶活。由表2可知，当反应体系中不加入任何金属离子，DPE是具有活性的。当在反应体系中加入EDTA螯合掉所有的金属离子时，DPE丧失了活性。向反应体系中加入Co²⁺和Mn²⁺，酶活显著提高，分别提高了157.19和126.06。

表2各种金属离子对D-阿洛酮糖产出的影响

将收集的湿菌体在不同温度(55℃、60℃，65℃，70℃)在Co²⁺(0.5mM)存在下(以不加Co²⁺为对照)，放置不同时间(0.5，1，2，4，8h)，取出湿菌体，测定相对酶活。由图3可知，加入Co²⁺离子后，DPE的热稳定性得到很大的改善。在65℃时，加入Co²⁺，反应6h后DPE相对活性仍保持在30％以上(图3-A)；不加入Co²⁺，反应1h DPE基本丧失酶活(图3-B)。

实施例6不同细胞浓度下全细胞转化合成D-阿洛酮糖

使用不同的细胞浓度(1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL)在65℃、pH 7.5、0.5mM Co²⁺条件下反应20min测定D-阿洛酮糖的转化率。结果如表3所示，当菌体浓度2.5～30mg/mL时，转化率为23％以上。

表3细胞浓度对全细胞转化的影响

实施例7不同pH下全细胞转化合成D-阿洛酮糖

在不同pH条件下，测定2.5mg/mL湿菌体在65℃，0.5mM Co²⁺存在下DPE的相对酶活，并计算转化合成D-阿洛酮糖的转化率。结果如表4所示，DPE的最适pH为8.5，且该酶有一定的酸碱耐受性，在弱酸或弱碱下，仍保有50％以上的酶活，并且DPE在pH为7～10的范围内，转化率高于20％。

表4pH对DPE全细胞转化合成D-阿洛酮糖的影响

实施例8全细胞转化合成D-阿洛酮糖

以100g/L D-果糖为底物，湿菌体全细胞浓度为25mg/mL，在65℃，pH 8.5，0.5mM Co²⁺的10mL反应体系中，加入适量湿菌体，65℃反应，高效液相色谱测定上清液中底物D-果糖的消耗和产物D-阿洛酮糖的产生情况，结果如图4所示，40分钟时，反应达到平衡状态，D-阿洛酮糖的转化率达34％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。