一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法与应用与流程

文档序号:12346440阅读:来源:国知局

技术特征:

1.枯草芽孢杆菌高效分泌表达海藻糖合酶的重组表达载体,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分泌表达海藻糖合酶基因工程菌的构建方法,其特征在于,步骤如下:

(1)以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板,PCR扩增Sec途径中的NprE信号肽序列;以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的基因组为模板PCR扩增海藻糖合酶序列ps TreS;

所述NprE信号肽序列的PCR引物序列如下:

NprE-F:5’-AAAGGAGGAAggatccATGGGTTTAGGTAAGAA-3’;

NprE-R:5’-GAATGCTCATactagtAGCCTGAACACC-3’;

所述海藻糖合酶序列ps TreS的PCR引物序列如下:

ps TreS-F:5’-actagtATGAGCATTCCAGA-3’;

ps TreS-R:5’-tctagaTTAGATCACCGGGGATGC-3’;

(2)采用重叠PCR将步骤(1)制得的信号肽序列NprE与来源于施氏假单胞菌的海藻糖合酶序列ps TreS融合,制得NprE-ps TreS片段;NprE-ps TreS融合基因片段基因序列如SEQ ID NO.2所示;

(3)将步骤(2)中制得的NprE-ps TreS片段经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后,与同样经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后的pHT01质粒连接,转入大肠杆菌DH5α中,制得重组质粒pHT01-NprE-ps TreS;

(4)将步骤(3)制得的重组质粒通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌中,通过氯霉素平板筛选后,制得分泌表达海藻糖合酶基因工程菌。

3.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增NprE信号肽的反应体系如下:

2×Pfu mix 25μL,10μmol/L上游引物NprE-F 1μL,10μmol/L下游引物NprE-R 1μL,模板1μL,用ddH2O补足50μL;

PCR反应程序如下:

95℃预变性5min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸10min。

4.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增海藻糖合酶序列ps TreS的反应体系如下:

2×Pfu mix 25μL,10μmol/L上游引物ps TreS-F 1μL,10μmol/L下游引物ps TreS-R1μL,模板1μL,用ddH2O补足50μL;

PCR反应程序如下:

95℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸4min,30个循环;72℃延伸10min。

5.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中,重叠PCR的初次扩增体系为25μl:

海藻糖合酶序列ps TreS 4μL;NprE信号肽片段4μL;2×Pfu mix 12.5μL;ddH2O4.5μL;

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下:

95℃预变性5min;94℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸30s,5个循环;72℃延伸10min;

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μL:

上游引物NprE-F 2μL;下游引物ps TreS-R 2μL;2×Pfu mix 12.5μL;ddH2O 8.5μL;

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下:

95℃预变性5min;94℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸5min,30个循环;72℃延伸10min。

6.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(4)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800N。

7.如权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(4)中,电转化的条件如下:

将感受态细胞在2100V条件下进行电转化5ms。

8.权利要求2构建的分泌表达海藻糖合酶基因工程菌在制备海藻糖合酶中的应用。

9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,步骤如下:

将分泌表达海藻糖合酶基因工程菌在TB培养基中扩大培养至生长对数期,向TB培养基中加入IPTG至终浓度1μM,37℃诱导12h,离心,取上清液,蛋白浓缩,制得海藻糖合酶。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述离心条件为4℃,10000rpm,20min;

优选的,所述蛋白浓缩为膜浓缩;进一步优选的,所述膜浓缩为用孔径大小为0.2μm超滤膜浓缩。

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