一种固氮基因nifDK基因敲除的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种固氮基因nifDK基因敲除的方法。

背景技术：

在基因敲除的实验过程中，通常采用融合PCR技术与抗性质粒连接后进行筛选，采用单一抗性质粒筛选会导致筛选效率低，不易找到重组子，最终实验失败。

技术实现要素：

为了解决构建慢生型大豆根瘤菌突变株的技术问题，本发明提供了一种固氮基因nifDK基因敲除的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种固氮基因nifDK基因敲除的方法，包括以下步骤：

一、PCR扩增慢生型大豆根瘤菌中的nifDK基因上下游片段，分别为nifDK-AB和nifDK-CD；

二、以nifDK-AB和nifDK-CD的PCR产物为模板进行融合PCR，PCR扩增nifDK-AD；

三、将nifDK-AD与载体pK18mobsacB相连，酶切验证，将nifDK-AD转入E.coli DH5α中；

四、将供体菌nifDK-AD、辅助菌pRK2013、受体菌HW-05三亲本杂交；

五、第一次同源重组：通过在Km^R的平板上生长，在10％蔗糖平板不生长，第一次筛选重组子；

六、第二次同源重组：通过在Km^R的平板上不生长，在10％蔗糖平板生长，第二次筛选重组子；

七、PCR验证，确定筛选的重组子已经插入到慢生型大豆根瘤菌的基因组中，而基因组中不含有野生株。

本发明采用融合PCR的方法，将融合片段与质粒pK18mobsacB连接，通过Km^R抗性筛选和sacB在10％蔗糖的筛选压力迫使其发生双交换，在2次同源重组后，采用PCR法筛选突变株，提高了筛选成功率。

附图说明

图1是筛选重组子流程图；

图2是基因组DNA提取结果，M：DNA Marker DL10000，1:HW-05基因组DNA，2:HH103基因组DNA；

图3是nifDK基因PCR扩增结果，M：DNA Marker DL10000，1:USDA110nifDK基因PCR扩增产物，2:HW-05nifDK基因PCR扩增产物；

图4是nifDK-AB片段PCR扩增结果，M：DNA Marker DL10000，1:nifDK-AB片段PCR扩增产物；

图5是nifDK-CD片段PCR扩增结果，M：DNA Marker DL10000，1-2:nifDK-CD片段PCR扩增产物；

图6是nifDK-AD片段PCR扩增结果，M：DNA Marker DL10000，1:nifDK-AD片段PCR扩增产物；

图7是nifDK-AD/pK18mobsacB转化后提取结果，M：DNA Marker DL10000，1:nifDK-AD/pK18mobsacB连接后转化提取结果；

图8是克隆酶切鉴定结果，M：DNA Marker DL10000，1:克隆EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切产物；

图9是重组子筛选，M：DNA Marker DL10000，1-2:nifDK片段PCR扩增产物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

以慢生型大豆根瘤菌HW-05为例，本发明提供的固氮基因nifDK基因敲除的方法如下：

一、试验方法

1、HW-05的分离

选取个大且饱满的根瘤，用剪刀将其剪下(带部分根)，将根瘤放在清水中浸泡4～5min，洗去杂质，再用95％乙醇浸泡5min后用0.1％的HgCl₂表面灭菌5min，然后用无菌水冲洗10次。在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在YMA培养基上划线，在28℃的温箱中培养3～5d后，挑取少许菌体观察其形态、大小、透明度、粘稠度、颜色、光泽等特征与标准菌对比，将获得的菌体挑入培养基斜面上，继续培养观察，如果菌落无异常，再划线稀释反复分离，直到纯化为止。

2、HW-05中nifDK基因的克隆

以慢生型大豆根瘤菌HW-05的基因组DNA为模板，采用同源序列克隆法，设计nifDK基因的特异性引物，采用PCR方法扩增目的基因nifDK全长DNA反应后，回收PCR产物与pMD18-T Vector Kit进行连接并转化至E.coli DH5α。送与上海生物工程有限公司进行测序。

3、PCR扩增HW-05中的nifDK-AB片段

(1)PCR管中依次加入以下试剂，以nifDK-A(F)和nifDK-B(R)为引物扩增nifDK-AB片段，扩增体系见表1：

表1

(2)扩增反应参数见表2：

表2

(3)取5μl反应产物，加1μL6×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、PCR扩增HW-05中的nifDK-CD片段

(1)PCR管中依次加入以下试剂，以nifDK-C(F)和nifDK-D(R)为引物扩增nifDK-CD片段，扩增体系见表3：

表3

(2)扩增反应参数见表4：

表4

(3)取5μl反应产物，加1μl 6×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

5、nifDK-AB片段和nifDK-CD片段融合

(1)PCR管中依次加入以下试剂，以nifDK-A(F)和nifDK-D(R)为引物，nifDK-AB 1μl和nifDK-CD 1μl为模板扩增nifDK-AD片段，扩增体系见表5：

表5

(2)扩增反应参数见表6：

表6

(3)取5μL反应产物，加1μL6×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

6、纯化产物与pK18mobsacB连接

将纯化的PCR产物nifDK-AD与载体pK18mobsacB在16℃连接过夜，反应体系如表7：

表7

7、酶切鉴定

限制性内切酶鉴定提取的质粒。根据pK18mobsacB载体酶切图谱，选用EcoRI和BamHI双酶切筛选阳性重组质粒，反应条件为37℃水浴4h。反应结束后分别取3μL酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，观察酶切结果，确定是否有外源片段以及插入片段大小是否正确，从而初步判断是否为重组克隆。

双酶切体系(20μl)见表8：

表8

8、nifDK-AD转入HW-05重组子筛选

通过两次同源重组，10％蔗糖和Km^R筛选后进行PCR检测阳性克隆，在20μLPCR反应体系中，以1μL质粒DNA(经20倍稀释)为模板，加入相应的PCR反应成分，进行PCR扩增，电泳检测是否扩出特异性条带，以确定重组子。筛选重组子流程图如图1所示。

二、实验结果

1、HW-05总DNA提取

总DNA提取结果，根据总DNA提取方法获得基因组DNA，结果见图2。

2、PCR扩增HW-05中nifDK片段

结果见图3。

3、PCR扩增HW-05中nifDK-AB片段

PCR扩增nifDK-AB片段产物大小约在600bp处，与预期大小相符，结果见图4。

4、PCR扩增HW-05中nifDK-CD片段

PCR扩增nifDK-CD片段产物大小约在600bp处，与预期大小相符，结果见图5。

5、PCR扩增HW-05中nifDK-AD片段

将nifDK基因上游的AB片段和下游的CD片段进行融合PCR扩增，扩增得到约1200bp目的条带，结果见图6。

6、nifDK-AD片段连接于pK18mobsacB载体及鉴定

选择nifDK-AD片段和pK18mobsacB载体共有的EcoRⅠ和BamHⅠ两种内切酶，进行酶切连接后转化，提取质粒，在约为7kb出现条带，结果见图7。

选用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切进行验证，出现两个条带分别约为1kb和6kb，结果见图8。

7、nifDK-AD转入HW-05重组子筛选

将nifDK-AD片段经三亲本杂交转入HW-05后，PCR扩增nifDK片段，条带约为1200bp的为重组子，结果见图9。