一种重组长效鸡干扰素α的制备方法与流程

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种重组长效鸡干扰素α(Recombinant Long-acting chicken interferonα，rLaChIFNα)的制备方法。

背景技术：

随着养鸡业的发展，我国养鸡业已由农村家庭副业发展成了社会一大产业，鸡的品种和数量都位于世界前列。正是这迅猛的发展，进而伴随着很多问题，鸡的病毒病日益明显，如禽流感、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、马立克氏病和鸡新城疫等传染性疾病，每年都会在不同的季节不同程度的暴发，感染发病后，初发病急、临床症状严重、极易传播扩散以及病死率和死亡率均较高的特点，给养鸡业造成巨大经济损失；不仅如此，因鸡与人类生活密切相关，某些病毒性传染病如禽流感等还会给人类健康带来潜在威胁。

目前鸡病毒性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。而一些病毒病甚至目前尚无疫苗可用。而药物治疗主要使用抗生素，但近年来抗生素的广泛大量使用导致耐药性菌株大量产生，并通过食物链传染给人，进而给人类健康带来更大的威胁。我国从16年开始明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，使用干扰素来替代或者部分取代抗生素来积极治疗和预防家禽、家畜的病毒性疾病是目前最为关注的问题。

干扰素是1957年由Issacs和Lindeman首先发现的一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种重组长效鸡干扰素α的制备方法，使得利用该方法制备的重组长效鸡干扰素α纯度高、活性强、半衰期长。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种基因工程菌，利用该工程菌可以表达重组长效鸡干扰素α。

本发明还解决一个技术问题：提供一种重组长效鸡干扰素α。

为了解决上述技术问题，本发明提出如下技术方案：

一种重组长效鸡干扰素α的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：

(1)长效鸡干扰素α基因的获取，所述长效鸡干扰素α基因的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示；(2)所述长效鸡干扰素α基因连接至原核表达载体pET-28a上获得表达载体；(3)所述表达载体转化大肠杆菌，获得基因工程菌；(4)所述基因工程菌用IPTG诱导，表达长效鸡干扰素α；(5)重组长效鸡干扰素α粗制品的制备；(6)重组长效鸡干扰素α粗制品的纯化。

优选的，所述长效鸡干扰素α基因的获取步骤为：利用引物，从鸡肝脏组织中提取RNA进行RT-PCR反应，并将扩增出的鸡干扰素α基因及鸡血清白蛋白基因通过柔性link连接起来；所述鸡干扰素α基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示；所述鸡血清白蛋白基因的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。

优选的，(1)所述鸡干扰素α基因的引物序列为：

上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC

下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG

上游引物带有EcoR I酶切位点；下游引物带有linker；

(2)所述鸡血清白蛋白基因的引物序列：

上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC

下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG

上游引物带有linker；下游引物带有Nco I酶切位点。

优选的，所述RT-PCR反应的反应体系为：在25μL的总反应体系中，模板RNA 1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。

优选的，所述鸡干扰素α基因及鸡血清白蛋白基因连接PCR反应体系为：在25μL的总反应体系中，鸡干扰素模板DNA1μL、鸡血清白蛋白模板DNA1μL，鸡干扰素上游引物0.5μL，鸡血清白蛋白下游引物0.5μL，转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸90S，循环35次，最后72℃延伸10min。

优选的，所述大肠杆菌为BL21大肠杆菌。

优选的，所述重组长效鸡干扰素α粗制品制备的步骤为：离心收集细菌，加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀，－20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，超声功率:400W，工作10s，间隔3S，超声6min，重复3～4次，4℃离心12000r/min离心15min分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白。

优选的，所述重组长效鸡干扰素α粗制品纯化的步骤为：亲和层析；脱盐、缓冲液置换；离子交换层析；分子筛层析。

利用上述方法构建的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌可以表达长效鸡干扰素α。

利用上述方法制备的重组长效鸡干扰素α。

本发明的制备方法为：通过设计特异性引物，从本地肉鸡(购自于安徽省实验动物中心)肝脏组织中提取RNA进行两种RT-PCR反应，并将扩增出的鸡干扰素α基因及鸡血清白蛋白基因通过柔性link连接起来，产物经双酶切后再连接至原核表达载体pET-28a(购自于优宝生物科技有限公司，货号：VT1207)上。以大肠埃希菌BL21(DE3)(购自于优宝生物科技有限公司，货号：ST1007)作为原核表达的宿主菌，构建BL21/pET-28a-rLaChIFNα重组菌，将质粒抽提送测序，将重组菌用IPTG诱导其表达长效鸡干扰素α，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹实验(Western Blot)鉴定后保存菌种。

重组长效鸡干扰素α经纯化、除菌、分装和冻干制成冻干粉针剂。加2ml注射用水后迅速溶解为均匀悬浊液。规格为：干扰素含量≥1000万IU/瓶，2～8℃可长期保存。使用时轻轻摇匀后翅下肌肉注射，每次注射10万单位/羽，一个疗程3次。在治疗已发病鸡的同时，应及时隔离未发病鸡并给予等量药物预防。

本发明与现有技术相比，所制的重组长效鸡干扰素α是一类能长期诱导鸡细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，半衰期在6天左右，能够用于禽流感、鸡新城疫等病毒性疾病的防治。

本发明所取得的技术效果还可以通过实施例记载的数据证明。

下文实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，本发明所要求保护的范围并不局限下述实施例。

附图说明

图1为鸡干扰素α基因及鸡血清白蛋白基因RT-PCR扩增的结果。

在图1中，泳道M：DNA Marker DL2000，泳道1：鸡干扰素α基因RT-PCR扩增产物在502bp左右出现单一条带；泳道2：鸡血清白蛋白基因RT-PCR扩增产物在1848bp左右出现单一条带；

图2为鸡干扰素α基因与鸡血清白蛋白基因连接扩增的结果。

在图2中，泳道M：DNA Marker DL10000，泳道1：鸡干扰素α基因与鸡血清白蛋白基因连接扩增产物在2365bp左右出现条带；鸡血清白蛋白扩增产物在1848bp左右出现条带，鸡干扰素α在502bp左右出现条带，为非特异反应。

图3为重组质粒pET-28a/rLaChIFN-αPCR及双酶切结果

在图3中，泳道M：DNA Marker DL10000，泳道1：pET-28a质粒对照，泳道2：质粒PCR结果，泳道2：重组质粒双酶切结果；

图4为IPTG 32℃诱导的重组长效鸡干扰素α蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。

在图4中，泳道M：蛋白Marker，泳道1：IPTG 32℃诱导后空菌菌体，泳道2：重组长效鸡干扰素α工程菌诱导5h后的菌体破碎后沉淀，泳道3：重组长效鸡干扰素α工程菌诱导5h后的菌体破碎后上清，可见重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在105KD处优势表达条带。

图5为重组蛋白Western Blot鉴定结果。

在图5中，泳道M：蛋白Marker，泳道1：空菌对照，泳道2：重组长效鸡干扰素α工程菌诱导破碎后沉淀，泳道3：为重组长效鸡干扰素α工程菌诱导破碎后上清。

图6为重组长效鸡干扰素α对VSV致细胞病变的抑制作用。

在图6中，1为VSV病毒对照孔，2为HEp-2细胞对照孔；

A3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；

B3-12为梯度稀释(从右向左)的rLaChIFNα处理孔；

图7为重组长效鸡干扰素α工程菌菌株革兰染色光镜图(1000×)。

图8为肉鸡单次注射rLaChIFNα后rLaChIFNα浓度时间曲线。

具体实施方式

实施例1：重组长效鸡干扰素α制备工艺流程

长效鸡干扰素α基因的获取：

采用TAKARA公司RNA提取试剂盒从鸡肝脏组织中提取RNA，并利用引物进行RT-PCR反应；

鸡干扰素α基因引物序列：

上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC

下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG

上游引物带有EcoR I酶切位点；下游引物带有linker

鸡干扰素α目的基因如Seq ID NO.1所示。

鸡血清白蛋白基因引物序列：

上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC

下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG

上游引物带有linker；下游引物带有Nco I酶切位点。

鸡血清白蛋白目的基因如Seq ID NO.2所示。

RT-PCR反应体系：在25μL的总反应体系中，模板RNA 1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free H₂O至25μL；

RT-PCR反应条件：50℃反转录30min，95℃预变性4min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，循环35次，最后72度延伸10min，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在582bp和1848bp左右出现特异条带，其结果如图1所示。

连接PCR反应体系：在25μL的总反应体系中，鸡干扰素模板DNA 1μL、鸡血清白蛋白模板DNA 1μL，鸡干扰素上游引物0.5μL，鸡血清白蛋白下游引物0.5μL，转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；

PCR反应条件：95℃预变性4min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸90S，循环35次，最后72度延伸10min，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2365bp左右出现特异条带，其结果如图2所示。所述长效鸡干扰素α基因的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示。

表达载体、基因工程菌的构建：

选择目的基因经测序后无误的连接后PCR的胶回收产物进行双酶切后与双酶切后表达载体pET-28a进行连接，并转化至BL21大肠杆菌，分别涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行EcoR I和Nco I双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2365bp处出现单一条带，其结果如图3所示。

重组蛋白的表达：

挑取pET-28a/rLaChIFNα工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中37℃摇菌1h复苏工程菌活性，后在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h后，测OD值达到1.0时，加入IPTG，32℃诱导表达(终浓度100μg/ml)5h，收集细菌，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在105KD处可见优势表达条带，其结果如图4所示

重组长效鸡干扰素α粗制品的制备：

离心收集细菌，加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀，－20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率:400W，工作10s，间隔3S，超声6min，重复3～4次，4℃离心，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；

重组长效鸡干扰素α粗制品纯化：

亲和层析：

将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl40mM还原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脱，收集rLaChIFNα峰；

脱盐、缓冲液置换：

将第一步纯化的rLaChIFNα过脱盐柱，用缓冲液(50mMTris-Cl pH7.0)置换，准备下一步离子交换层析；

离子交换层析：

分别用Loading buffer(50mMTris-Cl pH7.0)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH7.0)梯度洗脱，收集rLaChIFNα峰；

分子筛层析：

离子交换层析收集到的rLaChIFNα过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa2HPO4 0.15MNaCl pH7.0)收集rLaChIFNα峰；

测定rLaChIFNα效价及比活性，比活性≥1.0×10⁵IU/mg蛋白为合格；

无菌分装，-80℃保存。

实施例2重组长效鸡干扰素α的鉴定

蛋白含量的定量检测：

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定。

SDS-PAGE电泳检测：

与空菌相比，重组菌在105KD左右有一条浓染的新增蛋白条带。

Western Blot结果:

以abcam公司鼠抗鸡α干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:10000稀释)。重组长效鸡干扰素α样品能与抗鸡干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，105KD左右处出现特异性条带，如图5所示。

实施例3：重组长效鸡干扰素α效价检测

按照微量细胞病变抑制法，采用VSV/HEp-2系统：在96孔微量细胞培养板上用DMEM营养液培养HEp-2细胞，置5％CO₂培养箱37℃条件下培养24h，加入不同剂量的重组长效鸡干扰素α，24h后吸弃，再分别接种100 TCID₅₀ VSV病毒。

结果表明获得的重组长效鸡干扰素α对VSV引起HEp-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组长效鸡干扰素α处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥1.0×10⁵ IU/ml，如图6所示。

实施例4：重组长效鸡干扰素α在鸡体内的半衰期的测定

HPLC-MS/MS法，测定rLaChIFNα的血药浓度与时间关系，使用WinNonlin软件处理，计算rLaChIFNα在鸡体内的药代动力学参数。

取六只体重大致相同的肉鸡(雌雄各半)，颈部皮下注射2mg/ml rLaChIFNα2ml，分别在1h、2h、4h、8h、16h、26h、44h、79h、144h、194h、254h、324h翅下采血，置于37℃温箱静置30min，取血清，使用HPLC测定rLaChIFNα浓度：

表1、不同时间点肉鸡血清中rLaChIFNα浓度

表2、肉鸡注射rLaChIFNα血清中动力学参数

结果表明重组长效鸡干扰素α有较长的半衰期。经HPLC-MS/MS测定法测定后半衰期能达到144h左右，较普通干扰素提高约24倍。见图8。

上述实施例旨在说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让本领域的技术人员能够理解并实施，并不能据此来限制本发明所要求的保护范围。