一种恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料方法与流程

本发明涉及一种生物农药的制备方法，具体涉及一种恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料方法。

背景技术：
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阿维菌素，英文名称Avermectins，是由日本北里大学大村智和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，具有结构新颖、农畜两用的特点，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。阿维菌素是一种常见的农药制剂，广泛应用于农业，作为杀虫剂，用于防治十字花科小菜蛾、梨树梨木虱、棉花红蜘蛛、柑橘潜叶蛾锈壁虱、棉花棉铃虫、苹果树桃小食心虫和二斑叶螨、菜青虫等。阿维菌素发酵是一个产热的过程，伴随着温度升高的同时，发酵液中的水分也在不断地蒸发，同时由于空气温度的影响，也存在水分的蒸发。因此一方面会引起发酵液的粘度上升，使得溶氧降低，不利于菌体的生长代谢和酶的催化作用，使得效价增长受阻，生产中会出现菌丝次级代谢异常。

目前，阿维菌素采取的是分批式的发酵，所需营养物质一次性加入培养基中，直至本批发酵结束，发酵过程略有补糖。但采取中后期补糖后，过浓会导致糖阻，菌丝返青等现象，影响效价生长；过稀会导致培养基基质浓度降低，氮源不足。发酵菌丝代谢异常镜检菌丝无异样，发酵液粘度掉幅大，效价不长，严重影响阿维菌素的发酵进程，现有采取以下措施恢复发酵正常，1、放掉部分发酵液，重新补些新种子；2、放掉部分发酵液，把正常正常的发酵液压一小部分到罐中；实际应用中发现，以上方法恢复较慢，往往无法恢复到正常水平。

技术实现要素：
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针对现有制药企业阿维菌素发酵生产过程代谢出现的问题，本发明提供一种恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料方法。

本发明的技术方案如下：

一种恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料方法，恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料由磷酸氢二铵、葡萄糖、酵母粉和水组成；按各组分质量比之和百分之百计，其中，磷酸氢二铵为0.70～0.80％，葡萄糖为4.0～5.0％，酵母粉为4.0～5.0％，其余为水；

补料方法，包括步骤如下：

(1)将补料输送至补料罐中，升温至110～130℃进行灭菌20～30min，使补料罐内还原糖为3～8g/100ml，最后降温至70～80℃，得灭菌后的补料，备用；

(2)在发酵罐发酵周期中菌丝代谢出现异常时，按发酵罐内料液质量的1.5-2％补入上述补料，连续补入1-3天。

本发明优选的，按各组分质量比之和百分之百计，磷酸氢二铵为0.72～0.78％，葡萄糖为4.5～5.0％，酵母粉为4.5～5.0％，其余为水。

本发明优选的，按各组分质量比之和百分之百计，磷酸氢二铵为0.75％，葡萄糖为5％，酵母粉为5％，其余为水。

本发明优选的，步骤(1)，将补料输送至补料罐中，升温至120℃进行灭菌30min，使补料罐内还原糖为5g/100ml。

本发明优选的，发酵罐发酵周期在90h后，测试效价，发现效价零增长，发酵液粘度降低100mPa.s以上时为菌丝代谢出现异常。

进一步优选的，发酵罐发酵周期在90～180h后，测试效价，发现效价零增长，发酵液粘度降低100mPa.s～200Pa.s时为菌丝代谢出现异常。

本发明优选的，补料的补入量为料液质量的1.8～1.9％，最为优选的，补料的补入量为料液质量的1.8％。

本发明优选的，补料的补入时间为连续补入两天。

本发明优选的，所述的酵母为啤酒酵母。

葡萄糖为发酵碳源，磷酸氢二铵、酵母粉为氮源。碳源、氮源不足则发酵产物较少，碳源过量则产生糖阻效应，而氮源过量则菌丝返青，回到初级代谢，影响产抗。因此，在发酵菌丝次级代谢异常时，可能是发酵过程中溶解氧不足，使一些中间代谢产物积累，生长环境变化，影响某些酶活性，从而抑制微生物生长和产物合成。葡萄糖为发酵提供速效碳源，为菌丝的次级代谢产物中的碳链合成提供合适的碳元素。为合成目的产物提供所需的碳成分。同时能调节发酵液的PH环境。本工艺的料罐配比及补料时机恰当的补充了发酵所需的营养成分，刺激代谢异常菌丝恢复正常次级代谢。

本发明的有益效果：

1.本工艺的料罐配比及补料时机恰当的补充了发酵所需的营养成分，有利于发酵产物合成，从而使阿维菌素发酵菌丝代谢异常恢复正常代谢。

2.本工艺设备简单易行，所添加的物料用量小，有效提高了发酵生产水平，而且不对产品本身及下游产品的内在质量造成影响，具有明显的经济效益和推广价值。

附图说明

图1为不同葡萄糖浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，磷酸氢二铵浓度为0.75％，酵母浓度为5.0％，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价；

图2为不同磷酸氢二铵浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，葡萄糖浓度为5.0％，酵母浓度为5.0％，横坐标为磷酸氢二铵浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价；

图3为不同酵母浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，酸氢二铵浓度为0.75％，葡萄糖浓度为5.0％，横坐标为酵母浓度，纵坐标为效价涨幅；效价涨幅＝当前效价-前一天的效价。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例所用的设备均为常规现有设备。

实施例中使用的原料，市售产品。

实施例1：

一种恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料方法，恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料由磷酸氢二铵、葡萄糖、酵母粉和水组成；其中，葡萄糖200kg、磷酸氢二铵30kg、酵母粉200kg，水3570kg，阿维菌素发酵补料总计：4吨。

补料方法，包括步骤如下：

(1)将补料输送至补料罐中，升温至120℃进行灭菌30min，使补料罐内还原糖为5g/100ml，最后降温至70～80℃，得灭菌后的补料，备用；

(2)酵罐发酵周期在90h后，测试效价，发现效价零增长，发酵液粘度降低100mPa.s以上时为菌丝代谢出现异常，按发酵罐内料液质量的1.6％补入上述补料，连续补入2天。发酵称重120吨，补入2.0吨料液。

实施例2：

同实施例1的提高阿维菌素发酵水平的补料方法，不同之处在于：

恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料由磷酸氢二铵、葡萄糖、酵母粉和水组成；其中，葡萄糖180kg、磷酸氢二铵32kg、酵母粉180kg，水3570kg，阿维菌素发酵补料总计：4吨。

补料方法，包括步骤如下：

(1)将补料输送至补料罐中，升温至120℃进行灭菌30min，使补料罐内还原糖为5g/100ml，最后降温至70～80℃，得灭菌后的补料，备用；

(2)酵罐发酵周期在90h后，测试效价，发现效价零增长，发酵液粘度降低100mPa.s以上时为菌丝代谢出现异常，按发酵罐内料液质量的1.8％补入上述补料，连续补入2天。发酵称重120吨，补入2.16吨料液。

实验例一

选取十批发酵罐，采取不同葡萄糖浓度的补料、不同磷酸氢二铵浓度的补料以及不同酵母浓度的补料于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料实验，分别测定其效价及效价增幅，

效价测试方法：高效液相色谱法，按照国标GB 29696-2013规定的方法进行。

图1给出了不同葡萄糖浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，从图1中可以看出，补料中葡萄糖浓度在5.0％时，且在发酵周期90h代谢异常及早补入补料效价增幅最佳。

图2给出了不同磷酸氢二铵浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，从图2中可以看出，补料中磷酸氢二铵浓度在0.75％时，且在发酵周期进行到90h代谢异常及早补入补料效价增幅最佳。

图3给出了不同酵母浓度的恢复阿维菌素发酵菌丝代谢的补料按照本发明的补料方法分别于发酵罐发酵周期进行到90h、110h、140h进行补料对效价涨幅的影响曲线图，从图3中可以看出，补料中酵母粉浓度在5.0％时，且在发酵周期进行到90h代谢异常及早补入补料效价增幅最佳。

综上，当补料中酵母粉浓度在5.0％，磷酸氢二铵浓度在0.75％，葡萄糖浓度在5.0％，在发酵周期进行到90h代谢异常及早补入补料效价增幅最佳，刺激代谢异常菌丝恢复正常次级代谢。