一种甲钴胺及其衍生物的纯化方法与流程

本发明属于药物化学领域，尤其涉及一种药物新的提纯方法，具体涉及一种新的甲钴胺及其衍生物的纯化方法。
背景技术：
：甲钴胺(methylcobalamin)，化学名：钴-α-[α-5，6-二甲基苯并咪唑基]-钴-β-甲基钴胺酰胺，结构式如式(i)所示：甲钴胺是日本卫材株式会社开发的一种辅酶型维生素b12，临床上主要用于治疗周围神经疾病及缺乏维生素b12引起的巨幼红细胞性贫血，与其他辅酶型维生素b12类药物相比，本品比氰钴胺易于进入神经元细胞器，参与脑细胞和脊髓神经元胸腺嘧啶核苷的合成，促进叶酸的利用和核酸代谢，且促进核酸和蛋白质合成作用较氰钴胺强；能促进轴突运输功能和轴突再生修复受损的神经，是一种治疗周围神经疾病比较有效的药物。式i甲钴胺是一种深红色结晶或结晶性粉末，无臭、无味，吸湿性强，遇强光或紫外线易被破坏，强酸强碱条件下亦不稳定。甲钴胺是由原料氰钴胺经还原甲基化制备所得，自然界中的维生素b12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素b12。维生素b12的结构极为复杂，著名有机化学家woodward最杰出的成就，就是组织了14个国家的110位化学家，协同攻关，历时11年，终于在他谢世前几年实现了，完成了复杂的维生素b12的合成工作。目前市场上供应的维生素b12主要通过微生物发酵制备。文献报道的甲钴胺的制备方法，以氰钴胺(维生素b12)，羟钴胺，腺苷钴胺为原料，经使用硼氢化钠还原后，然后使用甲基化试剂进行甲基化制备获得。使用的甲基化试剂主要有碘甲烷，硫(碳)酸二甲酯，三甲基卤化亚砜等。目前文献报道的甲钴胺或其衍生物的纯化方法，归纳起来主要有以下几种：1、层析法：文献[1]_cn103113443a、[2]_cn102391340a、[3]_wo2006100059a1、[4]_、赵春山.甲钴胺的合成研究.哈尔滨理工大学学报[j].9(5)：2004，104-105.、[5]_martintollinger，tomasdkrer，robertkonrat，etal.anefficientmethodforthepreparationofmethylcobalamin，nature’sorganometallicmethyltransfercatalyst.journalofmolecularcatalysisa[j]：chemical116(1997)147-155、[6]_jph06279484a报道的方法为采用层析的方法精制纯化甲钴胺及其衍生物。根据层析分离过程中使用吸附剂的不同，又可以分为大孔吸附树脂分离及硅胶或氧化铝吸附分离方法。其中文献[1]、[2]和[3]为采用大孔吸附树脂分离，而文献[4]、[5]和[6]为采用硅胶或氧化铝吸附分离。两种分离方法的共同点是，洗脱时采用的溶剂体系为丙酮/甲醇/乙醇与水的混合体系进行洗脱，然后浓缩，结晶获得甲钴胺及其衍生物。该分离纯化方法的缺陷主要体现在以下几个方面：一是分离纯化过程中需要使用价格较贵的吸附材料(大孔吸附树脂分离/硅胶或氧化铝)，不但有机溶剂使用量大，且分离纯化耗时，只适于试验室制备少量样品采用。因而不适于大规模工业化生产；二是分离洗脱完毕后，需对大量洗脱液进行浓缩处理，由于甲钴胺及其衍生物在高温下不稳定，容易降解。因而浓缩过程中温度高或时间过长都会造成产品杂质增大。2、丙酮/水结晶法：文献[7]_cn1524086a、[8]_us20020183511a1报道的方法为采用丙酮/水体系进行结晶，收率较高。但文献并未提供纯度或含量数据。本发明人在实施文献报道的方法制备甲钴胺时，发现丙酮/水结晶体系对甲钴胺的精制纯化效果有限，采用此方法制备甲钴胺对原料氰钴胺或羟钴胺的纯度要求较高，否则因原料引入的杂质带入后续反应产生的新杂质，采用丙酮/水体系进行纯化，难于获得预期效果；3、盐析法：文献[9]_ep0976757a2报道的方法为采用水对甲钴胺及其衍生物进行纯化，但在纯化过程中，在水中加入了大量的诸如氯化铵，溴化钠，氯化钙，氯化铜，磷酸二氢钠，氯化铁等无机盐。该方法虽可以避免使用有机溶剂，但缺陷也比较明显。一是加入的一些重金属盐，有些价格昂贵，有些毒性较大，因而不适用于制备药物。二是加入的无机盐的量较大，残留的盐后续去除较困难。甚至仍需要进行层析除盐。综上，目前使用上述方法制备分离提纯式(i)化合物，由于理论及大生产实践的限制，虽可以对部分参数进行优化及进行溶剂筛选替代，但仍然无法克服溶剂使用量大，精制纯化效果不理想，产品质量无法提高等缺陷。这些大量繁琐及耗时的工艺操作，不但降低生产效率，也不能保证获得高收率及高质量的产品，因而造成的浪费是惊人的。为此亟待一种新的技术方案，以提供更优的工艺条件，提高产品的质量，提高劳动生产率，最大限度的降低生产成本，使其更有利于大规模工业化分离提纯式(i)。技术实现要素：为克服现有技术缺陷，本发明的目的在于提供一种简便有效、能有效除去甲钴胺及其衍生物原料中的杂质的纯化方法。为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：一种甲钴胺及其衍生物的纯化方法，其特征在于：以甲钴胺及其衍生物(包括氰钴胺，羟钴胺，腺苷钴胺)粗品为原料，加入一定比例的纯化水或水与有机溶剂的混合溶剂，控制温度为25～80℃，加入一定比例的季铵盐，溶解。加酸调节ph值，再加入活性炭搅拌吸附30min，过滤脱色得澄清料液。控制温度为25～60℃，搅拌下向澄清料液中加入有机溶剂，降温至0～10℃析晶，过滤或离心，干燥得高纯度的甲钴胺及其衍生物。所述的甲钴胺及其衍生物粗品纯度一般大于80％，优选的大于90％，更优选的大于95％。所述的甲钴胺及其衍生物粗品溶解后的溶液浓度为0.01～0.2/ml。所述的水与有机溶剂的混合溶剂中水与有机溶剂的体积比为1∶0.5～1.0。所述溶解温度一般为25～80℃，优选的30～60℃，更优选的30～40℃。所述的季铵盐通式为r4nx，其中四个烃基r可以相同，也可不同。x多是卤素负离子(f、cl、br、i)，也可是酸根(如hso4、rcoo等)，其中最常用的有十二烷基三甲基氯(溴)化铵、十四烷基三甲基氯(溴)化铵、十六烷基三甲基氯(溴)化铵、四丁基氯(溴)化铵、四丁基硫酸氢铵，苄基三乙基氯化铵三丁基甲基氯化铵。优选的季铵盐为四丁基溴化铵。所述的季铵盐与甲钴胺及其衍生物粗品质量之比为0.01～0.1∶1。所述的酸包括无机酸如盐酸、硫酸、硝酸和硫酸等和有机酸如甲酸、乙酸和三氟乙酸等，优选的为盐酸。所述ph值一般为4.0～7.0，优选的5.0～7.0，更优选的为5.5～6.5。所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮，优选的为丙酮。所述加入的有机溶剂的比例为甲钴胺或其衍生物粗品的40～80倍(v/m，ml/g)。所述的活性炭与甲钴胺及其衍生物粗品质量之比为0.01～0.05∶1。与现有技术相比，本发明方案的技术优点体现在以下几个方面：(1)本发明的关键之一在于纯化过程中不需要使用柱层析，不需要加入难以去除的诸如氯化铵，溴化钠，氯化钙，氯化铜，磷酸二氢钠，氯化铁等无机盐，与现有技术相比本发明方案更省时省物料，具有工艺简单，生产效率高，成本低，适合工业化生产等特点。(2)本发明的关键之二在于精制过程中使用季铵盐，有效的减少了杂质的析出。大大减少了原料药的杂质含量，使其单个杂质控制在0.10％以下，杂质总和控制在0.5％以下，保证了药品质量的安全性和可控性。(3)本发明的关键之三在于纯化时加入的季铵盐，很容易通过重结晶过程去除。不会残留到终产品中，不会对产品质量造成负面影响。附图说明图1是本发明实施例1制备获得的甲钴胺供试品溶液的hplc图谱；图2是本发明实施例2制备获得的甲钴胺供试品溶液的hplc图谱；图3是本发明实施例3制备获得的氰钴胺供试品溶液的hplc图谱；图4是本发明实施例4制备获得的氰钴胺供试品溶液的hplc图谱；图5是本发明对比实施例1制备获得的甲钴胺供试品溶液的hplc图谱；图6是本发明对比实施例2制备获得的氰钴胺供试品溶液的hplc图谱；具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。本实施例中的甲钴胺粗品，可按文献[7]_cn1524086a或[8]_us20020183511a1方法进行制备。本实施例中的氰钴胺为宁夏金维制药有限公司提供，纯度为98.6％。甲钴胺产品检测用方法：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(c18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：200ml乙腈-800ml0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph值3.5)，加入3.76g1-己烷磺酸钠检测波长：266nm柱温：40℃流速：调节流速使甲钴胺峰的保留时间约为12分钟运行时间：记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍进样量：20μl溶液配制：避光操作。供试品溶液：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液。系统适用性溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。对照溶液：精密量取1ml系统适用性溶液，加流动相稀释定容至10ml量瓶中，摇匀即得。测定法：照液相色谱系统。系统适用性要求：对照溶液中甲钴胺峰面积应为系统适用性溶液甲钴胺峰面积的7％～13％。重复进样6次系统适用性溶液，甲钴胺峰面积的相对标准偏差不超过3.0％。结果：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于甲钴胺主峰面积的0.5％，各杂质峰面积和不得大于甲钴胺主峰面积的2.0％。氰钴胺检测用方法：色谱柱：辛烷基全多孔硅胶微粒为填充剂(c8色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇-10g/l磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节ph值至3.5)(26.5：73.5)检测波长：361nm柱温：35℃，流速：0.8ml/min运行时间：记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍进样量：20μl溶液配制：供试品溶液：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，应在1小时内使用。灵敏度溶液：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成1ug/ml的溶液，应在1小时内使用。系统适用性溶液：本品25mg，置25ml量瓶中，加水10ml使溶解，加1.0g/l对苯磺酰基氯醛甲酰胺钠溶液5ml和0.5mhcl溶液0.5ml，用水稀释至刻度，摇匀，放置5分种，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。立即进样。测定法：lc-液相色谱系统。系统适用性要求：系统适用性溶液中应出现氰钴胺峰与7β，8β-乳糖氰钴胺峰(相对保留时间约为1.2)，二者的分离度应大于2.5，灵敏度溶液中主峰的信噪比应大于5.0。结果：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，按面积归一化法计算，各杂质峰的相对保留时间和可接受限度见下表名称相对保留时间可接受限度(％)cyanocobalamin(氰钴胺)1.0——7β，8β-lactocyanocobalamin1.21.050-carboxycyanocobalarnin1.40.534-methylcyanocobalamin1.52.032-carboxycyanocobalamin1.61.08-epi-cyanocobalamin2.51.0anyotherunidentifiedimpurity——0.5totalimpurities——3.0注：任何小于0.1％的峰可忽略不计。实施例1在暗红色灯光下，将30.0g甲钴胺和0.90g四丁基溴化铵加入300ml纯化水和200ml丙酮的混合液中，升温至30～40℃搅拌至全溶解，用1mol/l盐酸溶液调节ph至6.1，再加入0.6g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴加丙酮1500ml，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得高纯度的甲钴胺28.92g，收率96.4％，纯度99.64％(面积归一法)。实施例2在暗红色灯光下，将20.0g甲钴胺和0.9g四丁基氯化铵加入180ml纯化水和100ml丙酮的混合液中，升温至30～40℃搅拌至全溶解，用1mol/l盐酸溶液调节ph至5.8，再加入0.5g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴加1200ml丙酮，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得高纯度的甲钴胺19.42g，收率97.1％，纯度99.62％(面积归一法)。实施例3在暗红色灯光下，将50.0g氰钴胺和2.0g四丁基溴化铵加入450ml纯化水和300ml丙酮的混合液中，升温至40～50℃搅拌至全溶解，滴加1mol/l盐酸溶液调节ph至5.6，再加入2.5g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴加3500ml丙酮，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得氰钴胺精制品48.6g，收率97.2％，纯度99.49％(面积归一法)。实施例4在暗红色灯光下，将100.0g氰钴胺和3.0g四丁基氯化铵加入800ml纯化水和500ml丙酮的混合液中，升温至40～50℃搅拌至全溶解，滴加1mol/l盐酸溶液调节ph至6.2，再加入4.0g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴6000ml丙酮，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得氰钴胺精制品96.7g，收率96.7％，纯度99.51％(面积归一法)。对比实施例1(甲钴胺)在暗红色灯光下，将10.0g甲钴胺加入100ml纯化水和70ml丙酮的混合液中，升温至30～40℃搅拌至全溶解，用1mol/l盐酸溶液调节ph至6.0，再加入0.4g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴加丙酮500ml，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得高纯度的甲钴胺9.62g，收率96.2％，纯度99.09％(面积归一法)。对比实施例2(氰钴胺)在暗红色灯光下，将20.0g氰钴胺加入220ml纯化水和120ml丙酮的混合液中，升温至30～40℃搅拌至全溶解，滴加1mol/l盐酸溶液调节ph至5.8，再加入0.6g活性炭，维持温度30～40℃搅拌脱色30分钟，过滤得澄清料液。将滤液加入结晶瓶中，控制温度30～40℃，搅拌下滴加1100ml丙酮，有红棕色晶体析出，滴完后降温至0～10℃继续搅拌析晶1小时，抽滤，滤饼真空干燥，称重得氰钴胺精制品19.36g，收率96.8％，纯度99.02％(面积归一法)。当前第1页12