一种赭曲霉毒素脱毒蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及微生物蛋白与基因，具体地说，涉及赭曲霉毒素脱毒蛋白及其编码基因。

背景技术：

赭曲霉毒素(ochratoxins，OTs)是一类由曲霉属和青霉属等产毒霉菌产生的有毒代谢产物，广泛分布于食品、粮食及其他农副产品中。其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)在自然界分布最广泛，毒性最强，对人类和动植物的影响最大。动物实验表明OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此，预防OTA的产生，减少或消除已经产生的OTA对食品安全至关重要。

目前国内外关于OTA的脱毒研究可分为物理、化学和生物脱毒三大类方法。近年来，随着对真菌毒素脱毒研究的深入，生物脱毒得到越来越多研究人员的关注。生物脱毒是指通过生物代谢或者酶促反应脱毒毒素或者修饰毒素分子而达到脱毒的目的，相对于物理、化学脱毒，生物脱毒具有环保安全、高效低毒、特异性强，污染小等优势。目前关于生物脱毒的研究多集中在脱毒微生物的筛选，而脱毒物质的研究发展缓慢。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种赭曲霉毒素脱毒蛋白及其编码基因，并使其在原核表达系统中高效表达。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种赭曲霉毒素脱毒蛋白，该蛋白获自枯草芽孢杆菌CW14(Bacillus subtilis，CGMCC No.12118)，是如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有赭曲霉毒素脱毒活性的SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

所述枯草芽孢杆菌CW14(Bacillus subtilis，CGMCC No.12118)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2016年01月28日，保藏编号为CGMCC No.12118。

进一步地，本发明提供了编码所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)编码区如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有赭曲霉毒素脱毒活性蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有赭曲霉毒素脱毒活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

进一步地，为了实现所述基因在微生物(大肠杆菌)中的重组表达，使用大肠杆菌偏爱的密码子和调整AT比例优化如SEQ ID NO.2所示的脱毒序列，得到如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。该序列能够使重组后的大肠杆菌更好的表达所述基因，得到所述具有赭曲霉毒素脱毒活性的蛋白。

进一步地，含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

作为优选，所述重组表达载体为原核表达载体，所述重组菌以大肠杆菌作为出发菌。

第二方面，本发明提供了前述蛋白或前述基因在赭曲霉毒素脱毒的应用。例如，将前述基因通过重组表达载体克隆到大肠杆菌中进行表达，得到具有赭曲霉毒素脱毒活性的蛋白，该蛋白具有脱毒OTA的生物活性，可作为一种重要的解毒剂应用于食品加工和饲料加工领域。

具体为，本发明以B.Subtilis基因组DNA为模板，通过参照赭曲霉毒素降解酶设计得到的特异性引物，经PCR扩增出所述基因序列。然后构建重组质粒pET-28a(+)/CPA，在大肠杆菌BL21表达系统中大量表达并纯化得到重组蛋白。

其中，所述特异性引物序列如下：

F：5’-CGC GTT GAA CATCAC GAA ATG GAA-3’；

R：5’-CCC AAA CCA GCC TGT TAC CG-3’。

扩增得到的PCR产物约1300bp左右，与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶分子量(1332bp)相近。且两者的碱基序列具有76.13％的相似性，氨基酸序列的相似性达到80.95％。表明以B.Subtilis基因组为模板扩增得到的蛋白与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶为同源蛋白。

本发明使用大肠杆菌偏爱的密码子和调整AT比例优化扩增的脱毒序列。将其与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶对比发现，二者碱基序列的相似性达到77.02％，氨基酸序列的相似性不变。

本发明的另一个目的是提供包含脱毒序列的重组表达载体，以及用上述重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。本发明进一步提供了一种脱毒序列的表达方法：培养上述重组菌株，诱导表达具有脱毒赭曲霉毒素活性的重组蛋白。

所述重组蛋白的分子量为48KDa，与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶的分子量大小一致。重组蛋白表达量大约为76mg/L。

本发明还探索了重组蛋白的纯化方法和条件：通过亲和层析和超滤法纯化发酵液中的重组蛋白。纯化蛋白对OTA的脱毒率约为40％。

本发明还优化了重组蛋白的诱导表达条件，确定重组菌株表达重组蛋白的最佳条件是：诱导时间为4h、诱导温度为27℃、诱导剂浓度为1mM。

本发明所述蛋白及重组蛋白对赭曲霉毒素尤其是赭曲霉毒素A具有显著的脱毒活性。

本发明的有益效果在于：

本发明首次公开了一个来源于枯草芽孢杆菌的具有赭曲霉毒素脱毒活性的蛋白及其编码基因。

并首次将该基因在大肠杆菌中进行重组表达，得到对赭曲霉毒素A具有显著脱毒活性的蛋白质。该蛋白具有脱毒OTA的生物活性，可作为一种重要的解毒剂应用于食品加工和饲料加工领域。

附图说明

图1为B.Subtilis基因组的琼脂糖凝胶电泳图。1、2：提取的B.Subtilis基因组；3：DNA maker DL15000，分子量从上到下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2为B.Subtilis的CPA基因序列的PCR扩增产物。M：DNA maker DL15000，分子量从上到下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图3为测序结果与NCBI中B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶的碱基序列和蛋白序列比对。

图4为重组质粒pET-28a(+)/CPA的构建。

图5为序列优化后与NCBI中B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶的碱基序列比对。

图6为重组质粒pET-28a(+)/CPA的PCR验证。M：DNA maker DL15000，分子量从上到下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1：重组质粒pET-28a(+)/CPA为模板的PCR产物；2：空质粒，阴性对照。

图7为SDS-PAGE分析羧肽酶在重组大肠杆菌BL21中的表达。M：蛋白Marker，从上到下依次是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa；1、2：发酵上清；3、4：菌体沉淀。

图8为表达蛋白的Western blot分析。1、2：裂解上清；3：裂解沉淀。

图9为利用Bradford法测定表达上清中重组蛋白的浓度时绘制的标准曲线；横坐标为BSA浓度，纵坐标为吸光值。

图10为利用酶联免疫检测试剂盒测定纯化蛋白的活性时绘制的标准曲线；横坐标为赭曲霉毒素A标准品浓度(ppb)的对数，纵坐标为标准品百分吸光率。

图11为目的蛋白的纯化。M：蛋白Marker，分子量从上到下依次是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa；1：裂解上清；2：含目的蛋白的洗脱液；3：咪唑洗脱液；4：超滤后的纯化蛋白溶液。

图12为不同诱导时间对蛋白表达量的影响。M：蛋白Marker，分子量从上到下依次是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa。

图13为不同诱导温度对蛋白表达量的影响。M：蛋白Marker，分子量从上到下依次是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa；1：4℃；2：47℃；3：37℃；4：27℃。

图14为不同IPTG诱导浓度对蛋白表达量的影响。M：蛋白Marker，分子量从上到下依次是170KDa、130KDa、100KDa、70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、菌株

B.Subtilis菌株为本实验室从动物粪便中提取分离；大肠杆菌(Escherichia coli)BL21购自于天根生化科技(北京)有限公司，所有菌株-80℃保存。

二、酶和化学试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、DNA Maker DL2000、DL15000购TaKaRa生物工程(大连)有限公司；蛋白质Maker、EB(溴化乙锭)购自天根生化科技(北京)有限公司；抗His标签鼠单克隆抗体、AP标记山羊抗小鼠lgG(H+L)抗体购自康为世纪生物科技有限公司；显色液购自Amresco公司(美国)；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)残留酶联免疫检测试剂盒购自于北京勤邦生物科技有限公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺为Amresco公司产品；其他试剂均为分析纯。OTA为本实验室提取所得，经HPLC鉴定纯度＞98％。

三、常用试剂配制

(1)细菌基因及质粒提取所用试剂

1)TE缓冲液(pH 8.0)：100mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)，121℃高压灭菌20min，室温保存。

2)PBS缓冲液(pH 7.4)：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，121℃高压灭菌20min，室温保存。

3)细胞裂解液(1000mL)：200mmol/L NaCl，100mM Tris-HCl(pH 8.0),2.0％SDS，50mM EDTA，1.0％TritonX-100，121℃高压灭菌20min，室温保存。

4)1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：用800mL蒸馏水溶解121.1g Tris-base，浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，分装后在121℃高温灭菌20min，室温保存。

5)RNase A贮存液(10mg/mL)：100mg RNase A溶于10mL含10mM Tris-HCl(pH 7.5)，15mM NaCl溶液中，于100℃煮沸15min，分装后-20℃冻存备用。

6)STE溶液：0.1mol/LNaCl，0.01mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.001mol/L EDTA(pH 8.0)，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。

7)Solution Ⅰ溶液：50mM葡萄糖，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，于4℃保存。

8)SolutionⅡ溶液：0.4mol/L NaOH，2％(w/v)SDS。溶液Ⅱ先用现配，室温下保存。

9)SolutionⅢ溶液(100mL)：60mL 5mol/L乙酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mL水，于4℃保存。

(2)琼脂糖凝胶电泳试剂

1)5mol/L EDTA溶液(pH 8.0)：18.61g Na2EDTA.12H2O溶于80mL双蒸水中，用1mol/L NaOH调pH至8.0，待完全溶解后，定容至100mL，121℃高压灭菌30min。(Na2EDTA.12H2O需加NaOH调pH至8.0时，才能溶解)。

2)50×TAE(1L)：242g Tris，57.1mL冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)混匀，定容至1000mL。

3)6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、30％甘油，4℃保存。

(3)Tricine-SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)试剂和溶液。

1)蛋白电泳缓冲液：称取3g Tris-base，14.4g甘氨酸，1g SDS，加水定容至1000mL，混匀，4℃保存。

2)单体贮存液A液：称取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉丙烯酰胺，加水定容至100mL，混匀，4℃避光保存。

3)10％SDS溶液：10g SDS溶于100mL水中，室温放置。

4)4×分离胶B液(100mL)：75mL 2mol/L Tris-HCl(pH 8.8),4mL10％SDS溶液，21mL蒸馏水，混匀，4℃保存。

5)4×浓缩胶C液(100mL)：50mL 1mol/L Tris-HCl(pH 6.8),4mL 10％SDS溶液，46mL蒸馏水，混匀，4℃保存。

6)5×上样缓冲液(pH 6.8)：称取10g SDS，加入40mL甘油，33mL浓缩胶缓冲液(pH 6.8)，5mLβ-巯基乙醇，加水定容至100mL，再加入0.05g溴酚蓝，混匀。

7)10％过硫酸铵(AP)：0.1g溶于1mL蒸馏水，现用现配。

8)染色液：量取225mL甲醇，50mL乙酸，称取0.5g考马斯亮蓝，溶解后加水至500mL。

9)脱色液：量取100mL甲醇，100mL乙酸，加水至1000mL。

(4)大肠杆菌诱导表达所用试剂

菌体裂解液(100mL)：称取0.605g Tris-base(50mM)，0.292g EDTA(乙二胺四乙酸)(10mM)，0.585g NaCl(10mM)，pH 8.0，用蒸馏水定容至100mL，-4℃保存。

(5)Western blot(蛋白质印迹法)所用试剂。

1)转膜缓冲液：称取1.6g Tris-Base，7.2g甘氨酸，量取100mL甲醇，用蒸馏水定容至500mL，混匀，室温保存。

2)TBST缓冲液：称取4.4g NaCl，0.1g KCl，1.5g Tris-base，再加入0.5mL Twen-20，用少量蒸馏水溶解混匀，调节pH为7.5左右，再用蒸馏水定容至500mL。

3)封闭液：称取0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL TBST缓冲液，混匀，4℃保存。

4)一抗溶液(抗His标签鼠单克隆抗体)：吸取10μL鼠单克隆抗体溶于5mL封闭液中，混匀，4℃保存。

5)二抗溶液(AP标记山羊抗小鼠lgG抗体)：吸取5μL AP标记山羊抗小鼠lgG抗体溶液溶于5mL封闭液中，混匀，4℃保存。

(6)蛋白浓度测定用试剂

考马斯亮蓝G250溶液：称取50mL考马斯亮蓝G250溶液溶于25mL 95％的乙醇中，加入50mL 85％(w/v)的H3PO4，用蒸馏水定容至500mL，室温避光保存(可保存一个月左右)。

(7)蛋白纯化所用试剂

1)结合缓冲液(pH 8.0)：称取6.005g NaH2PO4(50mM)，58.44g NaCl(300mM)，0.6808g咪唑(10mM)溶于蒸馏水，混匀，调节pH 8.0，用蒸馏水定容至1000mL，抽滤，室温保存。

2)洗脱缓冲液(pH 8.0)：称取6.005g NaH2PO4(50mM)，58.44g NaCl(300mM)，17.02g咪唑(25mM)溶于蒸馏水，混匀，调节pH 8.0，用蒸馏水定容至1000mL，抽滤，室温保存。

3)咪唑(0.5M)：称取17.02g咪唑溶于蒸馏水，并用蒸馏水定容至500mL，混匀，抽滤，室温保存。

4)乙醇溶液(30％v/v)：量取30mL乙醇溶于70mL蒸馏水中，混匀，抽滤，室温保存。

四、培养基和储液

1)LB培养基：称取10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取物，调节pH 7.0，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。

2)LB/Kan培养基：称取10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g琼脂粉，调节pH 7.0，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。待温度降至55℃左右，加入2.5mL 10mg/mL的卡那霉素溶液，使其终浓度为25μg/mL，倒平板，待冷凝后于4℃贮存备用。

3)卡那霉素(Kan)储液(10mg/mL)：将卡那霉素配制成浓度为10mg/mL的母液，分装在10mL离心管中，-20℃冻存，使用前在冰上化冻。

4)IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)溶液(1mol/L)：称取2.3831g IPTG溶于10mL蒸馏水中，过滤除菌，-20℃保存。

实施例1 B.Subtilis基因组的提取

B.Subtilis基因组的提取步骤如下：

1)LB固体培养基中挑取活化的B.Subtilis CW14于10mL LB液体培养基中，37℃、200r/min培养24h；

2)取1mL菌液于2mL离心管，10000r/min离心5min，弃上清；加入1mL PBS缓冲液，重悬菌体，再次离心，弃上清；

3)加入500μL预冷(4℃保存)的乙醇，重悬菌体后，10000r/min离心5min，弃上清；

4)加200μL PBS溶液，40μL 50mg/mL的溶菌酶溶液，用移液枪吹打，彻底悬浮沉淀后，37℃水浴30min；

5)加500μL裂解液，10μL蛋白酶K溶液，55℃水浴过夜；

6)加入2μL的RNase A溶液，37℃水浴30min；

7)加700μL苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，混匀，12000r/min，离心10min；取上清600μL，重复操作一次；

8)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇＝24:1，混匀，12000r/min，再次离心10min，重复操作至分界面的白色层(蛋白层)消失；

9)取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静置6h，后13000r/min离心10min，弃上清；

10)用70％乙醇洗涤2次，12000r/min离心5min，自然晾干；

11)加40μL ddH2O，2μLRNase，在37℃放置30min；

12)1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。

结果如图1。

实施例2 B.Subtilis的CPA基因序列的PCR扩增

(1)引物合成

参考文献(Chang XJ,Wu ZD,Wu SL.Degradation of ochratoxin A by Bacillus amyloliquefaciens ASAG1.Food Additives&Contaminants:Part A,2015,32(4):564–571)，引物序列稍作改变。引物序列如下：

F：5’-CGC GTT GAA CATCAC GAA ATG GAA-3’

R：5’-CCC AAA CCA GCC TGT TAC CG-3’

将上述引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

(2)PCR扩增

采用25μL反应体系，以B.Subtilis基因组DNA为模板，在0.5mL Eppendorf管中依次加入：

混匀瞬时离心后，按如下PCR条件进行扩增反应：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火1min；72℃延伸30s，34个循环；然后72℃完全延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

结果显示扩增出的条带约1300bp左右，条带单一，明亮清晰，与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶分子量(1332bp)相近(图2)。

(3)PCR产物序列测定与分析

将上述PCR产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司，利用DNNMAN对测序序列与NCBI中的B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶序列进行同源性比较(图3)。由比对结果可以看出，PCR产物与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶序列具有76.13％的相似性，氨基酸序列的相似性达到80.95％，表明以B.Subtilis基因组为模板扩增得到的蛋白与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶为同源蛋白。

实施例3 重组质粒pET-28a(+)/CPA的构建及鉴定

重组质粒pET-28a(+)/CPA的密码子优化及构建(图4)交由北京奥克鼎盛生物科技有限公司。

利用DNAMAN对优化合成的目的片段与NCBI中B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶序列进行比对(图5)，结果表明，优化后碱基序列的相似性达到77.02％，氨基酸序列不变。

1.含有重组质粒pET-28a(+)/CPA甘油菌的活化

取于-80℃冻存的含有重组质粒pET-28a(+)/CPA甘油菌菌株置于冰上融化，轻弹壁管使其混匀；

2)取100μL该菌接入2mL新鲜的LB/Kan(Kan终浓度为25μg/mL)液体培养基中，37℃摇床200r/min过夜培养后，于新鲜的LB/Kan(Kan终浓度为25μg/mL)平板上划线，37℃培养2d至单菌落出现，随机挑取2个阳性克隆子提取质粒。

2.重组质粒pET-28a(+)/CPA的提取及鉴定

(1)pET-28a(+)/CPA质粒提取步骤如下：

1)从LB/Kan平板上挑取阳性菌落接种于20mL LB/Kan液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养；

2)取1.5mL菌液于10mL离心管，于4℃，5000r/min离心5min，弃上清，收集菌体；

3)用0.5mLSTE溶液重悬菌体沉淀，于4℃，1000r/min离心5min，弃上清，并使沉淀尽量干燥；

4)加200μL溶液Ⅰ(含100μg/mL RNaseA)重悬菌体，涡旋混匀，震荡使之彻底悬浮，于冰上静置5min；

5)加200μL新配制的溶液Ⅱ(100μL NaOH+100μL SDS)，盖紧管帽，轻柔上下颠倒5～10次，使之充分混匀，裂解菌体，冰浴2min；

6)加200μL溶液Ⅲ(预冷)，轻柔上下颠倒，混匀(此时将出现白色絮状沉淀)冰浴10min，在4℃环境下12000r/min离心15min；

7)取上清，加等体积苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，混匀，10000r/min，离心5min；取上清600μL于一干净的离心管中，重复操作一次；

8)取上清，加0.7倍体积异丙醇，混匀(枪吹打)，室温沉淀10min(-80℃，静置20min)。12000r/min离心15min，弃上清；

9)用70％乙醇洗涤2次，12000r/min离心5min，除尽壁管上上的水滴，并在超净工作台上晾干；

10)用20μL无菌水(含20μg/mL的RNase)溶解DNA沉淀，37℃保温脱毒1h后，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒后，于-20℃冻存备用。

(2)重组质粒pET-28a(+)/CPA的PCR鉴定

以提取出的pET-28a(+)/CPA进行PCR扩增，采用25μL反应体系，在0.5mL Eppendorf管中依次加入：

重组质粒2μL混匀瞬时离心后，按如下PCR条件进行扩增反应：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火1min；72℃延伸30s，34个循环；然后72℃完全延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图6)。

从图6可以看出，以重组质粒pET-28a(+)/CPA为模板可以扩增出DNA片段，而以空白质粒pET-28a(+)则不能扩增出DNA片段，说明目的基因已成功连接到载体pET-28a(+)上，重组质粒pET-28a(+)/CPA构建成功。

实施例4 重组菌株BL21/pET-28a(+)/CPA的转化

重组菌株BL21/pET-28a(+)/CPA的转化操作步骤如下：

1)取出-80℃冻存的E.coil BL21感受态细胞，置于冰上使其缓慢融化，轻弹壁管使其混合均匀；

2)于冰上将8μL提取的重组质粒pET-28a(+)/CPA加入到1)中的100μL E.coil BL21感受态细胞中，混匀，置于冰上30min；

3)42℃水浴热击90s，立即冰浴2min；

4)加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃、150r/min，预培养1.5h；

5)5000r/min离心5min，去除部分上清，留有约500μL菌液，吸取100μL菌液涂布于LB/Kan平板上，37℃培养，观察菌落生长情况。培养至出现单菌落，将平板置于4℃备用。

实施例5 B.Subtilis CW14脱毒酶的诱导表达和纯化

1.重组大肠杆菌菌株的诱导表达

1)从LB/Kan平板中挑取单菌落加入50mL LB/Kan(终浓度25μg/mL)液体培养基，37℃摇床200r/min过夜培养，使OD≈0.6；

2)过夜培养后，将菌液按照5％的接种量接种于新鲜的LB/Kan(终浓度25μg/mL)液体培养基，37℃摇床200r/min培养3～4h，使OD值达到0.8～1.0；

3)加入IPTG(终浓度1mM)诱导剂，25℃摇床200r/min，诱导4h；

4)将诱导后的菌液在4℃的环境中8000r/min离心10min，收集上清和菌体；

5)菌体重溶于适量裂解液，再加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，充分混匀，-20℃过夜；

6)37℃水浴溶解，-20℃冻结，反复冻融2～3次；

7)冰上超声破碎菌体，超声仪工作条件为：工作10s，间隔20s，15个循环；超声结束后，将溶液10000r/min离心20min，收集上清和沉淀；将沉淀溶于适量PBS缓冲液中，与裂解上清同时进行SDS-PAGE验证(图7)。

2.SDS-PAGE检测

SDS-PAGE具有较高的灵敏度，蛋白感量约在几十微克范围，一般只需要不到微克量级的蛋白质，只要该蛋白有一定量的表达，无论其有无活性，均可通过此方法验证。而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

SDS-PAGE的操作步骤如下：

制胶

分别制备12.5％的分离胶和5％的浓缩胶，其制备方法如下：

将上述试剂按配方用量混匀备用。分别制备14mL 12.5％的分离胶和4mL 5％的浓缩胶，其制备方法如下：

12.5％分离胶：14mL 12.5％的分离胶+70μL AP+7μL TEMED

5％浓缩胶:4mL 5％浓缩胶+30μL AP+5μL TEMED

混匀后，加入装配好的玻璃板中，准备上样。

2)上样：将样品与5×SDS样品缓冲液(20μL+5μL)在一个Eppendorf管中混合均匀，放入100℃水浴加热10min。用10μL移液枪小心取上清点样，防止样品漂出。样品上样量20μL，低分子量蛋白Marker上样量为5μL。空置的加样孔，需加等体积的1×SDS样品缓冲液，防止相邻泳道样品的扩散。

3)跑胶：以80V恒压进行电泳，当样品进入分离胶后将电压稳定在120V。待溴酚蓝跑出胶的底部，停止电泳。取出凝胶，切去浓缩胶，将剩余的分离胶进行染色30min。

4)倾去染色液，将凝胶浸在脱色液中置于80r/min的摇床上，每20min更换一次脱色液，直至得到清晰的条带和干净的背景。

从图7中可以看出，在分子量约为48KDa处有一条清晰的条带，与B.Amyloliquefaciens ASAG1中的羧肽酶的分子量大小一致。发酵上清中几乎不含有目标蛋白，而菌体中含有大量目标蛋白。

3.Western blot蛋白验证

Western blot操作步骤如下：

1)将SDS-PAGE蛋白电泳胶从玻璃板上取下，去除非必要部分。相应位置条带切下，浸于TBST缓冲液中；

2)剪膜：按照凝胶尺寸剪切硝化纤维素膜(又称NC膜，比凝胶稍大点)和滤纸(比凝胶稍小)，浸泡于转移缓冲液中；

3)要先往电泳夹上倒电转buffer，电转夹内按阴性(黑、下)到阳性(红、上)的顺序依次铺放：滤纸(3层)、凝胶、NC膜、滤纸(3层)，滤纸各层之间不能产生气泡，用镊子赶气泡；

4)电转：将电转夹竖直放入电转槽中，加入冰盒，注满电转液浸没转移夹，与4℃环境下进行电转，80V，200～300mA，电转2h；

5)将电转盒用TBST清洗两次，加入封闭液，将膜用TBST洗洗后放入封闭液中，室温封闭2h，或4℃封闭过夜；

6)加入稀释好的的一抗溶液，室温反应3h(或4℃过夜)，TBST洗3次，每次5min；

7)加入稀释好的二抗溶液，室温反应1h，TBST洗3～6次，每次5min；

8)显色液显色(2mL显色液)，避光，晃动直至清晰显色，双蒸水终止反应。

Western blot结果(图8)表明，在分子量为48KDa处的蛋白条带确定为目标蛋白。综合以上结果，表明目的基因在宿主菌BL21内可以被IPTG诱导表达，且表达的蛋白产物主要存在于菌体沉淀中，在发酵上清中含量较少。菌体经过溶菌酶处理并超声破碎后，目标蛋白主要存在于裂解上清中，而在裂解沉淀中含量很少，表明目标蛋白在BL21中为上清表达。

4.重组蛋白表达量的测定

利用Bradford法测定表达上清中重组蛋白的浓度。

1)标准曲线的绘制

取10支1.5mL离心管，按照下表加入各试剂：

将上述各溶液震荡、混合均匀后，向各管中分别加入980μL的考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，室温反应2min，测定各管溶液在595nm处的吸光值，以BSA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图9。

2)样品蛋白含量的测定

将20μL裂解上清样品溶液和980μL的考马斯亮蓝G250溶液加入干净的1.5mL离心管中，摇匀，室温反应2min，测定溶液在595nm处的吸光值，由标准曲线即可得裂解上清中目标蛋白含量。

5.重组蛋白的纯化

(1)亲和纯化表达上清中的重组蛋白

1)将适量保存在30％的酒精中散胶，加入沙漏中抽滤，以除去酒精；

2)向砂芯漏斗中加入10倍散胶体积的结合液，用于平衡凝胶。混合均匀后，抽滤，除去结合液；

3)用药匙将砂芯漏斗中平衡后的散胶刮至烧杯中，若散胶挂壁，可用少量结合液冲洗，以减少散胶损失；

4)表达上清液经0.22μm水系滤膜过滤，向烧杯中加入过膜后的表达上清液，175r/min震荡15min，防止蛋白失活，置于冰盒上，抽滤，留样，散胶挂壁可用少量洗脱液冲洗，以减少散胶损失；

5)向凝胶中加入4倍体积的洗脱液，175r/min震荡10min。抽滤，保存滤液；重复操作，直至目标蛋白完全洗脱下来；

6)用5倍体积的0.5M的咪唑清洗散胶，震荡10min后抽滤；

7)用2倍体积的去离子水清洗凝胶2-3次，抽滤；

8)用2-3倍体积的30％的乙醇溶液清洗2次，并于30％的酒精溶液中储存。

(2)超滤管(膜孔径10KDa，50mL，Millipore)对表达上清中的蛋白进行浓缩纯化

1)向超滤管中加入超纯水至完全过膜，冰浴或在冰箱中预冷10min，然后将水倒出，即可加入蛋白溶液。操作时动作要轻，防止把膜戳破。加入蛋白溶液前，超滤管要插在冰上预冷；

2)向超滤管中加入7mL表达上清，4℃、4500g离心20min；

3)待超滤管中蛋白溶液浓缩至1mL时，继续添加表达上清至7mL，4℃、4500g离心20min，直至所有的表达上清加完为止；

4)当所有表达上清浓缩至1mL左右，加入6mL酶解缓冲液(使用前用0.22μm的水系微孔滤膜过滤)，4℃、4500g离心20min；

5)重复操作4)，直至最后浓缩至500μL左右；

6)用200μL枪头取蛋白浓缩液，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打混匀浓缩液，吸取浓缩液于2mL离心管中；

7)浓缩蛋白液-80℃冷冻过夜，真空冷冻冻干，-20℃密封保存(图9)。

用Bandscan软件扫描分析可得，目的条带占总蛋白的20％左右，用Bradford法测得裂解上清中总蛋白含量为380mg/L，目标蛋白浓度大约为76mg/L。

实施例6 纯化蛋白活性测定

采用赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)残留酶联免疫检测试剂盒进行纯化蛋白的活性测定。

(1)样品前处理步骤按照赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)残留酶联免疫检测试剂盒说明书操作，稍作修改，具体操作如下：

1)称取冻干的蛋白5mg，溶于1mL蒸馏水中，加入OTA溶液(体系OTA终浓度为2μg/mL)，30℃孵育12h。

2)参考文献(彭晓丽.赭曲霉毒素A对拟南芥的毒理机制研究.博士学术论文,中国农业大学,导师:罗云波,2010)，提取体系中剩余的OTA：先用2M HCl使体系pH为2～3，在加入2mL三氯甲烷，振荡混匀后，6000g离心10min，取三氯甲烷层并用氮气吹干，溶于等体积50％的甲醇中，再加入等体积的10％的氯化钠溶液，用振荡器震荡1min，混匀；

3)取20μL用于分析。

(2)酶联免疫检测试剂盒的操作步骤：

1)将所需试剂从冷藏环境中取出，自然回温至室温，每种液体试剂试剂使用前充分混匀；

2)取出所需数量的微孔数，将不用的微孔板放回铝箔袋真空密封，保存于4℃环境中；

3)编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，记录标准孔和样本孔所在位置；

4)配制酶结合物工作液：将所需量的浓缩酶结合物用酶结合物稀释液按照1:20的体积进行稀释，酶结合物工作液要现用现配；

5)加标准品/样本和酶结合物工作液：加入标准品/样本20μL到相应的微孔中，然后加入酶结合物工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应10min；

6)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入去离子水250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内去离子水，用吸水纸拍干；

7)显色：加入底物液A液50μL/孔，底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应5min；

8)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

(3)标准曲线的绘制与计算

百分吸光率：

以标准品百分吸光率为纵坐标，以赭曲霉毒素A标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线，如图10。

3)测定样品溶液在450nm处的OD值，代入公式得OTA对应浓度，根据OTA的减少量得纯化蛋白对OTA的脱毒率。

结果表明纯化蛋白对OTA的脱毒率约为40％。

实施例7 重组蛋白诱导表达优化

(1)诱导时间对蛋白表达量的影响

摇菌至OD600＝0.5，在27℃条件下，以1mM IPTG诱导蛋白表达，每隔1h取样备用，直到诱导达5h取样终止。样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的最佳诱导时间。结果如图10所示。诱导时间为1h时，几乎检测不到蛋白的表达；随着诱导时间的延长，蛋白表达量增加，第4h目标蛋白的表达量达到最大，继续诱导培养，蛋白表达量变化不大。因此确定蛋白表达最佳诱导时间为4h。

(2)诱导温度对蛋白表达量的影响

摇菌至OD600＝0.5，加入终浓度为1mM的IPTG，分别于4℃、27℃、37℃和47℃条件下诱导4h。诱导后不同样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的最佳诱导温度。结果如图11所示，4℃时蛋白几乎不表达，温度为27℃时IPTG诱导蛋白表达量最高，温度继续升高，蛋白表达量有所下降。

(3)诱导剂浓度对蛋白表达量的影响

摇菌至OD600＝0.5，在27℃条件下，分别使用0.5、1、1.5mM IPTG诱导4h，不同样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的最佳诱导浓度。由图12可以看出，随着IPTG浓度的增大，蛋白表达量呈增加的趋势；当IPTG浓度由1mM增加到1.5mM时，蛋白表达量没有明显的差异。因此，选用IPTG浓度为1mM作为蛋白表达的最佳诱导浓度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。