生产β‑胡萝卜素的重组微生物及构建方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及MEP途径限速步骤发现、解除及其在萜烯类化合物生产中的应用，尤其涉及生产β-胡萝卜素的重组微生物及构建方法与应用。

背景技术：

萜类化合物(terpenoids)是自然界中存在的一类由异戊二烯为结构单元组成的化合物。许多萜类化合物具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分。有些萜类化合物已经开发出临床广泛应用的有效药物。

β-胡萝卜素和番茄红素是两种典型的萜类化合物。β-胡萝卜素是具有抗氧化、解毒、抗癌、预防心血管疾病，防治白内障和保护肝脏等作用。此外，β-胡萝卜素有维生素A源之称，是一种重要的人体生理功能活性物质，可以治疗由于缺乏维生素A引起的上体细胞质角质化，干眼病、夜盲症等(Lee et al.,2002；Das et al.,2007)。世界上已有52个国家地区批准使用。

由于萜类化合物具有广泛的应用前景，市场需求巨大，因此高效生产萜类化合物的方法一直以来是研究热点。目前萜类化合物的生产方法主要有三种：化学合成法、植物提取法和微生物发酵法。化学合成法工艺流程复杂、能耗高、污染大；另一方面，萜类化合物在植物中的含量通常很低，植物提取法对野生植物资源造成严重破坏；相比之下，微生物发酵法不受原料的限制、生产过程绿色清洁，具有很大的优势。由于大肠杆菌(Escherichia coli)基因组序列已完全公布，遗传背景和代谢途径都非常清楚、具有培养基要求简单和生长迅速等优点，很多研究都选取大肠杆菌作为出发菌种进行改造生产萜类化合物。图1为引入萜烯类合成基因后大肠杆菌生成萜烯类化合物的合成途径。

异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)是所有萜类化合物的前体化合物，目前已知有两种合成途径(Lee et al.,2002)。一种是甲羟戊酸途径(Mevalonic Acid Pathway，MVA途径)，主要存在于真菌和植物的胞液或内质网上。另一种是MEP途径，主要存在于细菌、绿藻和植物质体中。该途径的起始物是3-磷酸甘油醛和丙酮酸，经一系列酶催化形成大约5:1的IPP和DMAPP混合物。IPP在异戊酰焦磷酸异构酶(Isopentenyl diphosphate isomerase,Idi)的催化下异构成二甲基丙烯基焦磷酸DMAPP。IPP与DMAPP是萜类化合物的基本C5单位，可以在此基础上合成各种萜类化合物。

大肠杆菌具有MEP途径，可以合成萜类化合物的前体物质IPP与DMAPP，将萜类化合物的合成基因引入大肠杆菌，大肠杆菌即可生产萜类化合物。但由于大肠杆菌合成IPP和DMAPP的能力很差，所以萜类化合物的产量通常很低。提高大肠杆菌中MEP途径的代谢流、提高合成IPP与DMAPP的能力，成为提高大肠杆菌合成萜烯类化合物产量的关键。多个研究小组在寻找MEP途径中限速步骤、提高MEP途径中关键基因的表达强度中，做了大量工作(Yoon et al.,2007；Ajikumar et al.,2010；Alper etal.,2005a；Alper et al.,2005b；Choi et al.,2010；Jin and Stephanopoulos,2007；Yuan et al.,2006)。研究表明提高MEP途径中1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶基因(ispD)和4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶基因(ispF)、2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(ispE)、异戊酰焦磷酸异构酶基因(idi)的表达强度能提高重组大肠杆菌生产β-胡萝卜素的能力。但提高MEP途径中1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(dxr)、(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因(ispG)、(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶基因(ispH)的表达强度反而降低了重组大肠杆菌生产β-胡萝卜素的能力(Yuan et al.,2006)。

为了鉴定MEP途经的限速步骤，Yuan等利用同源重组的方法，用T5启动子在染色体上分别替换了MEP途径的各基因的启动子，发现调控dxs、idi、ispB、ispDF基因后，β-胡萝卜素产量分别提高了100％、40％、20％和40％。用T5启动子对这4个基因进行组合调控后，β-胡萝卜素产量提高了6.3倍，达到6mg/g干重细胞(Yuan et al.,2006)。Suh用强启动子T5调控MEP途经的关键基因dxs、idi和ispDF后，β-胡萝卜素产量比对照提高了4.5倍(Suh et al.,2012)。除了已经鉴定的MEP途径中的限速步骤外，可能MEP途径中还有其他蛋白因为高表达时可溶性低，而没有发现限速(Zhou et al.,2012)。Zhao 2013研究发现，在前体物质供给不足时，下游β-胡萝卜素合成基因很难完成高强度启动子调控实验，而当前体物质供应充足时，很容易实现高强度启动子调控下游基因，因此认为，菌株条件改变，大肠杆菌产β-胡萝卜素的限速步骤会跟着改变(Zhao et al.,2013)。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶基因ispG和(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸还原酶基因ispH的表达和/或活性，得到重组菌。

上述重组菌中，所述提高产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG和ispH基因的表达和/或活性为通过同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子实现的。

上述重组菌中，所述同时调控产β-胡萝卜素大肠杆菌中ispG基因和ispH基因的启动子为如下1)-9)中任一种：

1)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；

2)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

3)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

4)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；

5)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

6)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

7)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

8)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

9)将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH。

上述插入位置均为插入被调控基因前面，且紧邻被调控基因的起始密码子。

上述重组菌中，所述插入是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。

上述重组菌中，所述产β-胡萝卜素大肠杆菌为将β-胡萝卜素合成基因簇和trc调控元件导入大肠杆菌中，再将β-胡萝卜素合成基因簇的trc调控元件替换为人工调控元件M1-93；再将1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs的原始调控元件替换为人工调控元件M1-37；再将异戊酰焦磷酸异构酶基因idi的原始调控元件替换为人工调控元件M1-46；再将α-酮戊二酸脱氢酶基因sucAB、丁二酸脱氢酶基因sdhABCD和转醛醇酶基因talB的原始调控元件均替换为人工调控元件M1-46得到的菌，具体为CAR005。

上述重组菌的保藏号为CGMCC No.12884。

CAR015于2016年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏号为CGMCC No.12884，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

本发明另一个目的是提供一种构建上述重组菌的方法，为如下1)-9)中任一种：

1)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；

2)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

3)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

4)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列21所示的mRSL调控元件mRSL-1::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH；

5)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

6)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列23所示的mRSL调控元件mRSL-4::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

7)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列29所示的mRSL-3::ispH；

8)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列30所示的mRSL-4::ispH；

9)所示的方法包括如下步骤：将产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的序列25所示的mRSL调控元件mRSL-11::ispG，且将所述产β-胡萝卜素大肠杆菌中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的序列32所示的mRSL-14::ispH。

上述方法中，

所述插入是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组；

或所述产β-胡萝卜素大肠杆菌为CAR005。

上述的重组菌在生产β-胡萝卜素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第三个目的是提供一种生产β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，得到β-胡萝卜素。

本发明的实验证明，在具有一定β-胡萝卜素合成能力的重组大肠杆菌中，MEP途径中间体HMBPP胞内积累，可以引起细胞毒性；协调表达ispG和ispH基因，可以有效提高重组大肠杆菌的萜烯类化合物合成能力。。

附图说明

图1为引入萜烯类合成基因后大肠杆菌生成萜烯类化合物的合成途径。

图2为建库调控及测定细胞量、β-胡萝卜素相对产量及相应基因的转录水平；

A为dxr建库后所选菌株的细胞量和β-胡萝卜素相对产量；B为dxr建库后所选菌株dxr相对表达量；C为ispD建库后所选菌株的细胞量和β-胡萝卜素相对产量；D为ispD建库后所选菌株ispD相对表达量；E为ispE建库后所选菌株的细胞量和β-胡萝卜素相对产量；F为ispE建库后所选菌株ispE相对表达量。G为ispG建库后所选菌株的细胞量和β-胡萝卜素相对产量；H为ispG建库后所选菌株ispG相对表达量；I为ispH建库后所选菌株的细胞量和β-胡萝卜素相对产量；J为ispH建库后所选菌株ispH相对表达量。

图3为ispG和ispH基因组合调控菌株细胞生长和β-胡萝卜素产量变化；

A为OD₆₀₀；B为β-胡萝卜素相对产量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大肠杆菌ATCC 8739在文献“Gunsalus IC,Hand DB.(1941).The use of bacteria in the chemical determination of total vitamin C.J Biol Chem.141:853-858.”中公开过，公众可从天津工业生物技术研究所获得；

重组菌株M1-93在文献“Lu,J.,J.Tang,et al.(2012).Combinatorial modulation of galP and glkgene expression for improved alternative glucose utilization.ApplMicrobiolBiotechnol93(6):2455-2462.”中公开过，公众可从天津工业生物技术研究所获得。

M1-93人工调控元件序列见序列1。

番茄红素购自Sigma，产品目录号为L9879。

2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate(MEP)购自Echelon Biosciences，产品目录号为I-M051。

1-Hydroxy-2-methyl-2-buten-4-yl 4-diphosphate(HMBPP)购自Echelon Biosciences，产品目录号为I-M055。

1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate(DXP)购自Echelon Biosciences，产品目录号为I-M050。

4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol(CDP-ME)购自Echelon Biosciences，产品目录号为I-M052。

2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclophosphate(MEcPP)购自Echelon Biosciences，产品目录号为I-M054。

Isopentenyl pyrophosphate triammonium salt solution(IPP)购自Sigma，产品目录号为I0503-1VL。

pXZ-CS质粒在文献“Tan Z,Zhu X,Chen J,Li Q,Zhang X(2013)Activating phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in combination for improving succinate production.Appl Environ Microbiol 79(16):4838-4844.”中公开过，公众可从天津工业生物技术研究所获得。

pKD46质粒在文献“Datsenko,wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA.2000.97(12)：6640-6645；”中公开过，公众可从天津工业生物技术研究所获得。

重组菌CAR005为将β-胡萝卜素合成基因簇和trc调控元件导入大肠杆菌中，再将β-胡萝卜素合成基因簇的trc调控元件替换为人工调控元件M1-93；再将1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs的原始调控元件替换为人工调控元件M1-37；再将异戊酰焦磷酸异构酶基因idi的原始调控元件替换为人工调控元件M1-46；再将α-酮戊二酸脱氢酶基因sucAB、丁二酸脱氢酶基因sdhABCD和转醛醇酶基因talB的原始调控元件均替换为人工调控元件M1-46得到的菌，具体构建方法在公开号为CN 103087972A、发明名称为“生产萜类化合物的重组微生物及构建方法”的发明专利中公开过，公众可从天津工业生物技术研究所获得。

带有pKD46的大肠杆菌CAR005为将质粒pKD46导入大肠杆菌CAR005中得到的菌。

无盐LB的制备方法如下：

50％的蔗糖溶液：称取500g蔗糖，少量超纯水溶解后，定溶至1L，115℃，灭菌20min。

10％的无盐蔗糖LB培养基：称取5g酵母膏，10g蛋白胨于800ml水中，115℃，灭菌20min。灭菌后加200ml的50％的蔗糖溶液。

6％的无盐蔗糖LB培养基：称取5g酵母膏，10g蛋白胨，15g琼脂粉，溶于880ml水中，115℃，灭菌20min。灭菌后加120ml的50％的蔗糖溶液。

实施例中氯霉素、氨苄霉素、卡那霉素的浓度均分别为34μg/L、50μg/L、50μg/L。

表1本发明中所用的引物

表2为本发明中构建菌株

实施例1、摸索MEP途径dxr、ispD、ispE、ispG和ispH基因表达强度与β-胡萝卜素产量的关系

为了研究CAR005(Zhao J,Li Q,Sun T,et al.Engineering central metabolic modules of Escherichia coli for improving beta-carotene production.Metabolic engineering 2013；17:42-50.CAR001和CAR005都出自这篇文章)中MEP途径各基因表达强度与β-胡萝卜素产量的关系，建立mRS文库调控dxr、ispD、ispE、ispG和ispH基因，随机选15个菌株，测定β-胡萝卜素的产量，根据β-胡萝卜素的产量，再选几株代表性菌株用实时定量PCR方法，测定基因表达量，研究表达量与β-胡萝卜素的产量的关系。

一、构建mRS文库调控CAR005中dxr、ispD、ispE、ispG和ispH基因

本实施案例PCR扩增出mRS(mRNA稳定区)文库片段，插在几个待调控基因的起始密码子前，保留原始调控元件。原核生物中-10区同-35区之间称为mRNA稳定区，该区核苷酸种类和数目的变动会影响基因转录活性的高低，在这个区域建立文库，可以得到不同活性的启动子。该文库序列见序列2。

(一)、调控CAR005中dxr基因

以dxr基因为例，用两步同源重组法构建dxr基因的mRS文库，具体方法如下：

以pXZ-CS质粒为模板，dxr-cat-up和dxr-cat–down为引物，PCR得到3000bp左右的DNA片段I；DpnI处理后，将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌CAR005中。取200μl转化的菌液涂在含有氯霉素和氨苄的LB平板上，30℃过夜培养后，分别在含有氯霉素氨苄的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上筛选，得到在卡那霉素LB平板上不长，氯霉素氨苄LB平板上长的克隆，使用引物cat-up和dxr-320-down进菌落PCR验证，得到约800bp大小片段的菌株为正确菌株，重组正确菌株为dxr基因前带有cat-sacB的大肠杆菌CAR005，该菌可用于第二步同源重组。

以M1-93的基因组DNA(序列1)为模板，扩增引物为dxr-up-P/dxr-mRSL-down，PCR扩增得到200bp左右的DNA片段II；上游引物dxr-up-P包括待调控dxr基因原始启动子外的50bp碱基和M1-93的人工调控元件的5’末端起20bp同源片段；下游引物dxr-mRSL-down包括待调控dxs基因的起始密码子后的40bp碱基(基因的+1到+40区)、RBS区在内的mRS区的兼并引物片段(5’-ATTTCACACAGGAAACAGCT(N18)-3’)和M1-93的人工调控元件的3’末端起20bp同源片段。这对引物可以扩增出一组mRS区为兼并序列的人工调控元件，用这组元件进行第二步同源重组，即将这组片段电转化至步骤(一)得到的含pKD46的菌株中。将转化菌液转入50ml无盐LB+10％surcose培养基中，37℃、250rpm震荡培养24h后，在无盐LB+6％surcose平板上划线，41℃过夜培养，去除pKD46质粒。分别在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上筛选，得到在含氯霉素的LB平板上不长的克隆，进行PCR验证，使用引物P-up/dxr-320-down进行验证。随机选15株验证正确的重组大肠杆菌，命名为dxr-1、dxr-2、dxr-3……dxr-15，即将用于启动dxr基因的表达的表2所示的各个基因对应的mRSL-1元件至mRSL-15元件分别插入大肠杆菌中CAR005基因组中的dxr基因前。

上述案例中所用引物见表1，构建菌株见表2。

(二)调控CAR005中ispD、ispE、ispG和ispH基因

采用(一)中的方法，将(一)中的各个引物替换为各个基因所需引物。

结果得到如下重组菌：

ispD-1、ispD-2、ispD-3……ispD-15分别为将大肠杆菌中CAR005基因组中的ispD基因前分别插入用于启动ispD基因的表达的表2所示的mRSL-1::ispD-mRSL-15::ispD，。

ispE-1、ispE-2、ispE-3……ispE-15分别为将大肠杆菌中CAR005基因组中的ispE基因前分别插入用于启动ispE基因的表达的表2所示的mRSL-1::ispE-mRSL-15::ispE。

ispG-1、ispG-2、ispG-3……ispG-15分别为将大肠杆菌中CAR005基因组中的ispG基因前分别插入用于启动ispG基因的表达的表2所示的mRSL-1::ispG-mRSL-15::ispG。

ispH-1、ispH-2、ispH-3……ispH-15分别为将大肠杆菌中CAR005基因组中的ispG基因前分别插入用于启动ispH基因的表达的表2所示的mRSL-1::ispH-mRSL-15::ispH。

上述(一)和(二)得到的所有菌构成文库菌株。

二、文库菌株β-胡萝卜素的产量

将上述一得到的各个文库菌株分别挑单菌落于4ml的LB培养基的试管中，30℃，250rpm过夜培养；然后按照1％(体积百分含量)的接种量，即100μl菌液，将试管中的菌液转接到含10ml培养液的100ml三角瓶中，30℃，250rpm培养；培养24h后。取500μL菌液于13000rpm离心3min弃上清液，用灭菌水清洗菌体，加1ml丙酮重悬菌体，在55℃黑暗条件下萃取15min，13000rpm离心10min收集上清液。以CAR005为对照。

采用紫外分光光度计453nm下测定上清液中β-胡萝卜素吸收值。

β-胡萝卜素的相对产量＝上清液中β-胡萝卜素吸收值乘以/上清液细胞浊度(OD600nm)

dxr-1、dxr-2、dxr-3……dxr-15β-胡萝卜素的相对产量的结果见图2A，图2A表明，CAR005的dxr基因经mRS文库调控后，随机所选15株菌的β-胡萝卜素产量为CAR005的0.5到0.99倍，细胞量为CAR005的0.66到0.9倍。选β-胡萝卜素产量较低的菌株dxr-4(调控元件mRSL-4::dxr序列见序列3)和dxr-6(调控元件mRSL-6::dxr序列见序列4)、β-胡萝卜素产量中等的菌株dxr-2(调控元件mRSL-2::dxr序列见序列5)和dxr-5(调控元件mRSL-5::dxr序列见序列6)、及β-胡萝卜素产量较高的菌株dxr-11(调控元件mRSL-11::dxr序列见序列7)和dxr-15(调控元件mRSL-15::dxr序列见序列8)用实时定量PCR方法测定dxr基因的表达量。

ispD-1至ispD-15β-胡萝卜素的相对产量的结果见图2C所示，表明，CAR005的ispD基因经mRS文库调控后，随机所选15株菌的β-胡萝卜素产量为CAR005的0.99到1.05倍。选β-胡萝卜素产量较低的菌株ispD-1(调控元件mRSL-1::ispD序列见序列9)和ispD-15(调控元件mRSL-15::ispD序列见序列10)、β-胡萝卜素产量中等的菌株ispD-6(调控元件mRSL-6::ispD序列见序列11)和ispD-13(调控元件mRSL-13::ispD序列见序列12)、及β-胡萝卜素产量较高的菌株ispD-7(调控元件mRSL-7::ispD序列见序列13)和ispD-9(调控元件mRSL-9::ispD序列见序列14)用实时定量PCR方法测定ispD基因的表达量。

ispE-1至ispE-15β-胡萝卜素的相对产量的结果如图2E所示，表明，CAR005的ispE基因经mRS文库调控后，随机所选15株菌的β-胡萝卜素产量为CAR005的0.97到1.09倍。选β-胡萝卜素产量较低的菌株ispE-5(调控元件mRSL-5::ispE序列见序列15)和ispE-15(调控元件mRSL-15::ispE序列见序列16)、β-胡萝卜素产量中等的菌株ispE-3(调控元件mRSL-3::ispE序列见序列17)和ispE-12(调控元件mRSL-12::ispE序列见序列18)、及β-胡萝卜素产量较高的菌株ispE-6(调控元件mRSL-6::ispE序列见序列19)和ispE-8(调控元件mRSL-8::ispE序列见序列20)用实时定量PCR方法测定ispE基因的表达量。

ispG-1至ispG-15β-胡萝卜素的相对产量的结果如图2G所示，表明，CAR005的ispG基因经mRS文库调控后，随机所选15株菌的β-胡萝卜素产量为CAR005的0.11到0.79倍，细胞量为CAR005的0.47到0.91倍。选β-胡萝卜素产量较低的菌株ispG-1(调控元件mRSL-1::ispG序列见序列21)和ispG-13(调控元件mRSL-13::ispG序列见序列22)，β-胡萝卜素产量较低的菌株ispG-4(调控元件mRSL-4::ispG序列见序列23)和ispG-5(调控元件mRSL-5::ispG序列见序列24)，及β-胡萝卜素产量较低的菌株ispG-11(调控元件mRSL-11::ispG序列见序列25)和ispG-14(调控元件mRSL-14::ispG序列见序列26)，用实时定量PCR方法测定ispG基因的表达量。

ispH-1至ispH-15β-胡萝卜素的相对产量的结果如图2I表明，CAR005的ispH基因经mRS文库调控后，随机所选15株菌的β-胡萝卜素产量为CAR005的0.98到1.06倍。随机选ispH-1(调控元件mRSL-1::ispH序列见序列27)、ispH-2(调控元件mRSL-2::ispH序列见序列28)、ispH-3(调控元件mRSL-3::ispH序列见序列29)、ispH-4(调控元件mRSL-4::ispH序列见序列30)、ispH-5(调控元件mRSL-5::ispH序列见序列31)和ispH-14(调控元件mRSL-14::ispH序列见序列32)用实时定量PCR方法测定ispH基因的表达量。

上述各菌为将各自基因的启动子替换为括号里面的调控元件。

三、β-胡萝卜素产量与相应基因表达量关系

提取菌株dxr-4、dxr-6、dxr-2、dxr-5、dxr-11和dxr-15总RNA，反转录得到cDNA的第一链；以第一链cDNA为模板，dxr-610-f/dxr-802-r为引物，用iQSYBR Green RT-PCR试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)在实时定量PCR仪(Bio-Rad CFX Connect Real Time System)进行PCR，同时，以CAR005中dxr的cDNA量为对照，测定所选菌株中dxr的表达量。为了保证样品一致性，以16S RNA为内参基因，用于扩增的引物为16S-797-f/16S-963-r，所用引物序列见表1。

实时定量PCR扩增程序:

1)95℃10min,1cycle

2)95℃15s-60℃30s-72℃30s,40cycles

3)60℃-95℃，0.2℃/s

ABI Prism 7000SDS软件(Applied Biosystems)进行数据分析。

将CAR005的cDNA按照一定浓度稀释，测定dxr和16S基因的相对表达量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各个样品中dxr和16S基因的相对表达量，然后计算每个样品做三个重复。

dxr样品＝dxr相对量/16S相对量

dxr相对表达强度＝dxr样品/dxrCAR005

采用同样方法分别测定文库选定菌株相应基因的相对表达量，所用引物见表1。

结果如图2所示。

图2B表明，CAR005的dxr基因mRS文库所选6株菌中dxr表达量为CAR005中dxr表达量的的0.68到42.86倍。β-胡萝卜素产量最低的菌株dxr-4中dxr表达量最高，表达量是CAR005中dxr表达量的42.86倍；而β-胡萝卜素产量最高的dxr-15中dxr基因的表达量最低，为CAR005中dxr表达量的0.68倍。Dxr表达量与相应菌株β-胡萝卜素产量呈反比，即菌株中dxr表达量越高，其β-胡萝卜素产量越低。

图2D表明，CAR005的ispD基因mRS文库所选6株菌中ispD表达量为CAR005中ispD表达量的的7到116倍。ispD基因mRS文库所选株菌β-胡萝卜素产量和细胞量与出发菌株CAR005相比变化不大，而ispD表达水平有明显差异，因此，认为ispD表达量和β-胡萝卜素产量没有明显相关性。

图2F表明，CAR005的ispE基因mRS文库所选6株菌中ispE表达量为CAR005中ispE表达量的的6到44.5倍。ispE基因mRS文库所选株菌β-胡萝卜素产量和细胞量与出发菌株CAR005相比变化不大，而ispE表达水平有明显差异，因此，认为ispE表达量和β-胡萝卜素产量没有明显相关性。

图2H表明，CAR005的ispG基因mRS文库所选9株菌中ispG表达量为CAR005中ispG表达量的的5.09到75.83倍。β-胡萝卜素产量最低的菌株ispG-1中ispG表达量最高，表达量是CAR005中ispG表达量的75.83倍；而β-胡萝卜素产量最高的ispG-11中ispG基因的表达量最低，为CAR005中ispG表达量的5.09倍。ispG表达量与相应菌株β-胡萝卜素产量呈反比，即菌株中ispG表达量越高，其β-胡萝卜素产量越低。

图2J表明，CAR005的ispH基因mRS文库所选6株菌中ispH表达量为CAR005中ispH表达量的的4到36.4倍。ispH基因mRS文库所选株菌β-胡萝卜素产量和细胞量与出发菌株CAR005相比变化不大，而ispH表达水平有明显差异，因此，认为ispH表达量和β-胡萝卜素产量没有明显相关性。

实施例2、ispG和ispH组合调控得到的重组菌

分别将ispG库调控中ispG-1、ispG-4和ispG-11的ispG的人工调控元件，与ispH库中ispH-3、ispH-4和ispH-14的ispH的人工调控元件在CAR005中组合调控。

一、重组大肠杆菌G1H3、G1H4、G1H14、G4H3、G4H4、G4H14、G11H3、G11H4和G11H14的构建

重组大肠杆菌G1H3为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-1::ispG(序列21)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-3::ispH(序列29)；

重组大肠杆菌G1H4为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-1::ispG(序列21)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-4::ispH(序列30)；

重组大肠杆菌G1H14为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-1::ispG(序列21)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-14::ispH(序列32)。

重组大肠杆菌G4H3为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-4::ispG(序列23)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-3::ispH(序列29)。

重组大肠杆菌G4H4为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-4::ispG(序列23)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-4::ispH(序列30)。

重组大肠杆菌G4H14为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-4::ispG(序列23)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-14::ispH(序列32)。

重组大肠杆菌G11H3为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-11::ispG(序列25)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-3::ispH(序列29)。

重组大肠杆菌G11H4为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-11::ispG(序列25)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-4::ispH(序列30)。

重组大肠杆菌G11H14为将出发菌CAR005基因组中的ispG基因前插入启动ispG基因表达的mRSL调控元件mRSL-11::ispG(序列25)，且将出发菌CAR005基因组中的ispH基因前插入启动ispH基因表达的mRSL-14::ispH(序列32)。

上述重组大肠杆菌均用两步同源重组的方法，插入人工调控元件，以G1H3、G1H4、G1H14构建方法为例，具体如下：

(一)以pXZ-CS质粒为模板，ispH-cat-up和ispH-cat-down为引物，PCR得到3000bp左右的DNA片段I；DpnI处理后，将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ispG-1中。取200μl转化的菌液涂在含有氯霉素和氨苄的LB平板上，30℃过夜培养后，分别在含有氯霉素氨苄的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上筛选，得到在卡那霉素LB平板上不长，氯霉素氨苄LB平板上长的克隆，使用引物cat-up和ispH-395-down进菌落PCR验证，结果重组菌正确，该重组菌为ispH基因前带有cat-sacB的大肠杆菌ispG-1，该菌可用于第二步同源重组。

(二)分别以ispH-3、ispH-4和ispH-14的基因组DNA为模板，扩增引物为ispH-440-up/ispH-395-down，PCR扩增得到940bp左右的DNA片段II；这个片段包括相应调控元件及上下游400bp左右的同源臂，将这条片段电转至步骤(一)得到的含pKD46的菌株中。将转化菌液转入50ml无盐LB+10％surcose培养基中，37℃、250rpm震荡培养24h后，在无盐LB+6％surcose平板上划线，41℃过夜培养，去除pKD46质粒。分别在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上筛选，得到在含氯霉素的LB平板上不长的克隆，进行PCR验证，使用引物P-up/ispH-395-down进行验证。筛选验证正确，送去测序，测序正确的菌株命名为G1H3、G1H4、G1H14。所述案例中所用引物见表1，构建菌株见表2.

(三)采用上述(一)、(二)所述方法，用ispH-3、ispH-4和ispH-14的ispH的人工调控元件分别调控ispG-4和ispG-11中ispH基因，得到重组大肠杆菌G4H3、G4H4、G4H14、G11H3、G11H4和G11H14。所用引物见表1，所构建菌株见表2。

二、重组大肠杆菌G1H3、G1H4、G1H14、G4H3、G4H4、G4H14、G11H3、G11H4和G11H14的β-胡萝卜素测定

将重组大肠杆菌G1H3、G1H4、G1H14、G4H3、G4H4、G4H14、G11H3、G11H4和G11H14按照实施例1的方法进行发酵培养，测定β-胡萝卜素产量，同时以CAR005为对照，计算β-胡萝卜素相对产量。结果如图3所示。

结果表明，G1H3、G1H4、G1H14中B-胡萝卜素产量分别为CAR005的0.16、0.47、0.55倍，即在ispG表达量高时(G1H3、G1H4、G1H14中ispG表达量是CAR005的75.8倍)，β-胡萝卜素的产量随着ispH基因表达量提高而提高；G4H3、G4H4、G4H14中B-胡萝卜素产量分别为CAR005的0.57、1.70、1.76倍(G4H3、G4H4、G4H14中ispG表达量是CAR005的10.84倍)，G11H3、G11H4和G11H14中B-胡萝卜素产量分别为CAR005的0.93、1.66、1.72倍(G11H3、G11H4和G11H14中ispG表达量是CAR005的5.09倍)；在ispG表达量低时，β-胡萝卜素产量随着ispH的表达量增加而增加，当ispH表达量增加到一定程度，则β-胡萝卜素产量不再增加。并且各菌株的细胞生长和β-胡萝卜素产量趋势相同。

将β-胡萝卜素产量最高菌株G4H14命名为CAR015。摇瓶中培养24小时，用HPLC方法测定β-胡萝卜素产量，β-胡萝卜素产量达64.83mg/L，单位细胞产量达41.63mg/g。

取制备的β-胡萝卜素萃取液用0.45μm的微孔滤膜(Millpor公司)过滤，使用HPLC(Agilent Technologies高效液相色谱仪1260Infinity)测β-胡萝卜素含量。测定方法同标准品测定。

标准品β-胡萝卜素购自美国Sigma公司(Cat.No.C4582)，到货之后马上进行标准曲线的测定。过滤时所用滤膜为0.45μm的微孔滤膜(Millpor公司)；丙酮、甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙腈为色谱纯试剂，由Merk公司提供。

准确称取β-胡萝卜素的标准品5mg加入1ml二氯甲烷溶解，丙酮定容至10ml，得到500μg/ml的标准品溶液。使用时用丙酮进行倍比稀释(2×、4×、8×、16×、32×)，过滤至HPLC进样瓶中，进行HPLC检测。采用Symmetry C18柱(4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇：乙腈：二氯甲烷＝21:21:8；进样量：20μl；进样时间：20min；DAD灯检测；检测波长为450nm，通过标品峰面积与β-胡萝卜素浓度之间的关系，得到β-胡萝卜素的标准曲线。

CAR015于2016年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏号为CGMCC No.12884，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

实施例3、重组大肠杆菌发酵得到MEP途径代谢中间体及其应用

推测MEP途径中HMBPP积累，导致ispG-1生长变慢、β-胡萝卜素产量降低，因此测定代表性菌株重组大肠杆菌ATCC 8739、CAR005、ispG-1、ispG-4、G1H14和G4H14(CAR015)中MEP途径代谢中间体积累情况。本实施案例研究MEP途径代谢中间体积累对β-胡萝卜素产量的影响。

一、MEP途径中间体的获得及测定

配制提取液，提取液为甲醇和水(体积比为4:1)。

将上述重组大肠杆菌挑单菌落于4ml的LB培养基的试管中，30℃，250rpm过夜培养；然后按照1％(体积百分含量)的接种量，即100μl菌液，将试管中的菌液转接到含10ml培养液的100ml三角瓶中，30℃，250rpm培养；培养5h后，取10ml培养物离心收集细胞，然后用2ml提取液重悬细胞；将重悬物置于-20℃冰箱中20分钟进行萃取，放置过程中，不时摇动，使萃取充分。萃取结束后离心，将上清液取出放置一个新的离心管中，重复上述萃取过程，然后合并两次萃取液，得到含有MEP途径中间体的溶液。

用带有6500Q-TRAP的质谱仪的安捷伦1290HPLC测定含有MEP途径中间体的溶液中代谢中间体，上样量为15μl。包含溶剂A和溶剂B(体积比为85:15)的流动相在15℃、0.8ml/min流速下，经氨基柱(50×4.6mm,particle size 5μm；Phenomenex)分离MEP代谢中间体。溶液A为含20mM的乙酸铵和20mM的氨水的5％的乙腈水溶液；溶液B为乙腈。以电喷雾电离、正离子检测，优化MEP途径中间体条件，不同物质的离子对见表3。各中间体浓度换算为每OD每升培养基体积含量。

表3MEP途径中间体质谱测定是最优离子对

分别测定了ATCC 8739、CAR005(ATCC 8739是构建CAR005的出发菌株)、ispG-1、G1H14、ispG-4和G4H14菌的MEP途径中间体，结果见表4。在原始菌株大肠杆菌ATCC8739和CAR005中，中间体HMBPP的量分别为0.059和0.07μmol/OD₆₀₀/L(每升是培养体积的每升)，ispG的转录水平增加到原始水平的10.8倍和75.8倍时，胞内HMBPP浓度分别为0.203和0.413μmol/OD₆₀₀/L，分别是出发菌株CAR005的2.9和5.9倍。在ispG的转录水平增加到原始水平的10.8倍和75.8倍基础上，将ispH的转录水平增加36倍，HMBPP积累分别从0.413降低到0.257μmol/OD₆₀₀/L，从0.203降低到0.062μmol/OD₆₀₀/L。而其他中间体的积累量与细胞生长及β-胡萝卜素产量没有明显的相关性(表4)。

表4代表性重组大肠杆菌菌株中胞内代谢中间体浓度(μmol/OD₆₀₀/L broth)