本发明涉及用于免疫细胞培养的支原体检测试剂盒及检测方法。
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背景技术：
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自20世纪80年代以来，免疫细胞疗法备受关注，其系免疫疗法的一个重要分支，而后者被美国国立卫生研究院列为除手术、化疗、放疗以外的第四大癌症治疗模式。过继细胞免疫疗法(ACT)是从外周血中获得淋巴细胞，在体外诱导培养，最后将致敏淋巴细胞回输给肿瘤病人使其获得抗肿瘤免疫力，以达到治疗肿瘤的目的。
2010年卫生部令79号《药品生产质量管理规范》指出，对于免疫细胞治疗这类方法需要有标准操作程序和产品的质量控制。除细菌真菌、内毒素外，支原体也是免疫细胞培养中一项重要的检测指标。支原体大小一般在0.3-0.5μm之间，感染后不易被觉察，且用常规的过滤手段无法去除。中国药典2010版指出临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法(DNA染色法)，但这两种方法操作比较繁琐且需要较长时间才能得到检测结果。2006年欧洲药典已将PCR作为常规检测方法，PCR检测方法应用特异性引物扩增支原体基因组序列，具有灵敏、准确的特点，并且检测周期短，当天即可以看到检验结果。因此建立一种免疫细胞培养体系中支原体污染的快速准确PCR检测方法，对于免疫细胞的临床回输显得尤为重要。
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技术实现要素：
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本发明的目的在于建立一种可靠稳定、操作简便的利用PCR技术检测免疫培养细胞中支原体污染的方法。
为了实现上述目的，提供一种用于免疫细胞培养的支原体检测试剂盒，包括以下PCR扩增用的引物对：
上游引物，其RNA序列如SEQ ID No.1所示，
下游引物，其RNA序列如SEQ ID No.2所示，
以及
DNase-free water，
2×Taq Master Mix。
本发明还于采用上述支原体检测试剂盒的检测方法，检测包括以下步骤：
a.支原体样本收集，
b.将支原体与试剂盒中的引物对进行PCR扩增，
c.对扩增后的产物进行电泳染色检测，阳性样本将在270bp处出现特异性条带。
支原体样本收集的具体优化步骤如下：
i.收取待检样品，取1mL至离心管，200g离心力室温离心1min，将上层清液液转至新管，待用，
ii.取上述上层清液作液为PCR模板，每25μL反应体系加1μL。
PCR扩增的具体优化步骤如下：
i.融化2×Taq Master Mix和引物对，并放置在冰上，
ii.确定扩增样品的数目，其中包括阳性、阴性对照和待检样品，
iii.计算PCR反应所需各成分总含量，
iv.将PCR各反成分加到一无菌管中，振荡混匀并置于冰上，
v.将干净消毒的八联管置于架上并正确标记，
vi.将24μLPCR反应混合液加到每一个八联管中，并置于冰上，
vii.将每个样品吸取1μL加到相应的含有24μLPCR反应混合液的管中。然后将反应管快速离心后即可开始PCR反应，其中PCR反应条件为：
预变性：94℃，2min，
循环：
94℃，30sec；
55℃，30sec，35cycles；
72℃，30sec，
延伸：72℃，10min，
保存：4℃。
电泳染色检测的具体优化步骤如下：
i.制胶：1.5％琼脂糖凝胶，称取0.375g琼脂糖于三角烧杯中，加入25mL 1×TAE电泳缓冲液，水浴溶化琼脂糖，稍冷后注入凝胶模中，冷却凝固后，即可用于电泳，
ii.上样：取10μL PCR扩增产物，直接点样，
iii.电泳：120V电泳20分钟，
iv.浸染：电泳结束后，将胶放置在含0.5uM Ethidium bromide的TAE染液中,室温7-10min，
vi.于紫外光凝胶成像系统内观察、拍照。
本发明的有益效果是：从临床实际应用可行性出发，在考虑稳定可靠性、便捷性、经济性的前提下，建立针对于临床免疫细胞培养的支原体PCR检测方法，以期为临床回输的免疫细胞制剂在质量可靠性上保驾护航。
[附图说明]
图1是用本发明方法检测不同免疫细胞培养样本的琼脂糖电泳图，最左侧泳道为DNA Marker，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3-7为所检测的样品，其中泳道3、4、6、7为被支原体污染的样品，其他样品没有。
[具体实施方式]
以下结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，应当理解实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实验室设备：Bio-Rad C1000PCR仪、电泳仪及水平电泳槽、八联管离心机(TomymicroONE)、凝胶成像系统
序列的引物对为：
CLS-MP5(5′-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3′)
CLS-MP3(5′-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3′)
PCR所用其他试剂：DNase-free water，2×Taq Master Mix
电泳所用试剂：琼脂糖、溴化乙锭(ethidium bromide，EB)、TAE电泳缓冲液(迪申生物技术有限公司)
引物对是特异性扩增支原体16s rRNA保守区域的引物对，实现一次检测就可以覆盖多种支原体的目的，可以覆盖免疫细胞培养中常见的支原体感染种类。本PCR方法能够检测的支原体种类包括：Acholeplasmalaidlawii,M.arginini,Mycoplasma fermentans,M.hyorhinis,M.orale,M.pneumoniae,Mycoplasma gallisepticum,Mycoplasma synoviae and Spiroplasmacitri。以及Mycoplasma arthritidis,Mycoplasma genitalium,Mycoplasma hominis,Mycoplasma penetrans,Mycoplasma salivarium,Ureaplasmaurealyticum,Mycoplasma bovis,Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma pirum.
(1)收取5份不同的免疫细胞培养上清，各取1mL至离心管，200g室温离心1min，将细胞残骸沉淀至管底。将上清转至新管作为PCR模板，每25μL反应体系加1μL。
(2)融化2×Taq Master Mix，CLS-MP5，CLS-MP3primer，并放置在冰上。
(3)设阳性、阴性对照各1份，待检样品5份。
(4)配制PCR反应混合液：ddH2O 96μL，2×Taq Master Mix 80μL，CLS-MP5primer(10μM)8μL，CLS-MP3primer(10μM)8μL。将PCR各反应成分的终体积加到一无菌管中，振荡混匀，然后将24μL PCR反应混合液加到每一个八联管中，并置于冰上。
(5)将每个样品吸取1μL加到相应的含有24μL的PCR反应混合液的管中。然后将反应管快速离心后即可开始PCR反应。
(6)进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果见图1。最左侧泳道为DNA Marker，泳道1为阳性对照，在270bp处出现了预期的条带，泳道2为阴性对照，在270bp处没有出现扩增产物，说明PCR体系正常工作，检测结果准确可靠。泳道3-7为所检测的样品，其中泳道3、4、6、7在270bp处出现条带，说明这4份为被支原体污染的样品，对应的免疫细胞出现了支原体污染。而泳道5在270bp处没有出现扩增产物条带，说明对应的免疫细胞未出现支原体污染。