一种GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法与流程

本发明涉及一种GyV7环形病毒VP3蛋白的制备方法。

背景技术：

鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CAV)一直被认为是圆环病毒科(Circoviridae)中环形病毒属(Gyrovirus)唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等(Rijsewijk FA,Dos Santos HF,Teixeira TF,Cibulski SP,Varela AP,Dezen D,et al.Discovery of a genome of a distant relative of chicken anemia virus reveals a new member of the genus Gyrovirus.Archives of virology.2011Jun；156(6):1097-100)，从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等(Sauvage V,Cheval J,Foulongne V,Gouilh MA,Pariente K,Manuguerra JC,et al.Identification of the first human gyrovirus,a virus related to chicken anemia virus.Journal of virology.2011Aug；85(15):7948-50)在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然而，目前尚无检测GyV7抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV7病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV7蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV7在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV7VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种操作简单、效率高、快速的GyV7环形病毒VP3蛋白表达载体的制备方法，并实现VP3蛋白的表达。本发明的原理和最核心的关键技术是：科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV7的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供了一种用于PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体的引物，其核苷酸序列为：

上游引物1：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；(SEQ ID NO.1)

下游引物1：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。(SEQ ID NO.2)

扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5‘端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5‘端带有额外CAT碱基。

本发明提供了一种用于PCR扩增GyV7病毒VP3基因的引物，其核苷酸序列为：

上游引物2：5’-GTTCCAGGGGCCCATGGCACACCTATACAC-3’；(SEQ ID NO.3)

下游引物2：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTGCGGCGT-3’。(SEQ ID NO.4)

扩增GyV7病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5‘端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV7病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5‘端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。

本发明还提供了一种GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体与GyV7病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，用于PCR扩增GyV7病毒VP3基因的引物分为上、下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其具体包括如下步骤：

1)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段：以pGEX-6p-1质粒以及GyV7病毒VP3基因为模板，利用上述引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段(附图1，步骤1)；

2)将GyV7病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-1载体：利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；

3)阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达(附图1，步骤3)。

本发明还提供了上述GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法，以及上述的引物在制备GyV7诊断抗原、抗VP3多克隆抗体以及制备GyV7流行病学有效诊断试剂方面的应用。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本发明中，利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外重组技术克隆GyV7病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达；

2)该发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速构建GyV7病毒VP3基因的原核表达载体。

3)本发明获得的GyV7病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV7诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV7流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

4)本发明将获得GyV7环形病毒VP3蛋白表达载体，实现VP3基因在大肠杆菌中的表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。这一表达载体构建及纯化的VP3融合蛋白将为建立检测GyV7抗原及抗体的血清学诊断方法，探究VP3生物学功能提供有效的免疫学试剂，填补国内外空白。因此，本发明具有一定应用价值。

附图说明

图1是一种GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法策略。步骤1：以人工合成的GyV7病毒VP3基因为模板，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段。步骤2：利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆。步骤3：阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。

图2是PCR扩增GyV7病毒VP3片段。泳道1，GyV7病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNA Marker。

图3是PCR扩增线性化载体pGEX-6p-1。泳道1，线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物；泳道M，DNA Marker。

图4是SDS-PAGE分析GyV7病毒VP3基因的表达。泳道M，蛋白Marker；泳道1、2分别代表经IPTG诱导的超声裂解pGEX-6P-1样品的上清，沉淀；泳道3、4、5分别代表经IPTG诱导的超声裂解样品VP3上清，沉淀及纯化后VP3蛋白。

图5是Western blot鉴定抗GyV7VP3蛋白多克隆抗体。1,转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

实施例1：

1)设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段引物：

扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5’端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5’端带有额外CAT碱基。扩增GyV7病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV7病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见表1，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成。

表1：扩增pGEX-6p-1线性化载体和GyV7病毒VP3片段引物设计：

2)pGEX-6p-1线性化载体以及GyV7病毒VP3基因片段PCR扩增：

以pGEX-6p-1质粒以及合成的GyV7VP3基因为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcGyV7-VP3质粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：94℃变性5分钟,随后进行30个循环(94℃变性30秒,58℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M为DNA Marker，其中泳道1为GyV7病毒VP3片段PCR产物。如图3所示，其中泳道M为DNA Marker，泳道1为线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物。

3)GyV7病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-1载体：

将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-1以及GyV7病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的GyV7病毒VP3片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1表达线性化载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。

实施例2：

GyV7病毒VP3蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含GyV7病毒VP3基因的阳性克隆(命名为pGEX-VP3)转化BL21细菌，经IPTG诱导(0.1mmol/ml)后收集细菌，进行超声(40赫兹)破碎。将超声破碎样品离心后分上清与沉淀进行SDS-PAGE(5％的浓缩胶，10％的分离胶)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST单抗为一抗，羊抗鼠HRP标记的IgG为二抗)鉴定表达。

其具体步骤如下：

1)GyV7病毒VP3蛋白诱导表达:

将获得的含GyV7病毒VP3基因的阳性克隆(命名为pGEX-VP3)转化到BL21细菌后，转接种于3ml含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基，37℃250rpm振摇培养过夜。次日按1:100转接种于LB培养基，37℃1500rpm振摇2.5h，用终浓度为1mM IPTG 37℃诱导。诱导5h后将菌液转移至离心管内，6000rpm离心5min，去上清，用PBS洗涤一次，600μL灭菌DDW悬浮细菌，并且在冰浴上进行超声波裂解，30HZ，10min。10000rpm离心5min，取上清，沉淀用300μL灭菌DDW重悬，-20℃冻存备用。分别取30μL细菌裂解上清和沉淀，加入5μL 6×SDS凝胶上样缓冲液混匀，煮沸5min；用于SDS-PAGE(5％的浓缩胶，10％的分离胶)电泳分析重组蛋白的表达及其表达形式。在图4中，VP3蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。

2)GyV7病毒VP3蛋白的纯化:

在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化。简要步骤如下：向纯化柱中加入5个体积的DDW去除乙醇；用10个体积的结合Buffer(140mM Nacl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4)平衡柱子；将蛋白样品5-10mL/每次，重复过柱两次，使蛋白充分结合在柱上。用10个体积的结合Buffer洗涤柱中的杂蛋白；用5个体积的洗脱Buffer(50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽)洗脱目的蛋白，随后加入透析袋中用1×PBS溶液充分透析，分装后，在-70℃保存；取纯化后的蛋白按比例加入5×Loading Buffer，煮样5min后，用SDS-PAGE电泳分析。结果表明VP3蛋白获得了良好的纯化(如图4中泳道5所示)。

3)GyV7病毒VP3蛋白的免疫反应性:

将纯化的VP3蛋白腹腔免疫6周龄BALB/C小鼠，免疫三次，每次间隔14天，剂量均为50μg/只/次。首免时与等体积的完全弗氏佐剂混合至油包水状，再次免疫时与等体积的不完全弗氏佐剂混合，之后免疫不加佐剂。三免后采集小鼠血清，用在293T细胞中表达的VP3蛋白作为抗原进行western blot分析血清中抗VP3特异性抗体。结果表明获得的抗GyV7病毒VP3蛋白的小鼠多抗能与在293T细胞中表达的VP3蛋白进行特异性反应(图5)。这一结果表明本发明表达的VP3蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV7血清学诊断中将具有良好的应用前景。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种GyV7环形病毒VP3蛋白制备方法

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<170> PatentIn version 3.5

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