葡萄糖氧化酶突变体的制作方法

文档序号：14326893阅读：244来源：国知局

本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用。

背景技术：

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-d-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β-d-葡萄糖生成d-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-d-吡喃葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子c1上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对l-葡萄糖和2-o-甲基-d-葡萄糖完全没有活性。

由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。而黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于40％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。目前采用饲料制粒后将葡萄糖氧化酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且无法保证酶制剂的稳定性以及酶制剂在饲料中的分布均一性。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对目前饲料用葡萄糖氧化酶具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列seqidno:1具有至少70％同源性的序列；

(ⅱ)具有所述(ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(ⅲ)由如seqidno:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如seqidno:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

在本发明的另一些实施例中，所述取代为取代1个或2个氨基酸。

在本发明的一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶具有75％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶具有80％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶具有85％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶具有90％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶具有95％以上同源性的酶；

在本发明的一些实施例中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的一些实施例中，所述葡萄糖氧化酶具有如seqidno:1所示的氨基酸序列，编码所述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列之一如seqidno:2所示。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶的第64位氨基酸发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由a变为r，或由a变为l，或由a变为k，或由a变为m，或由a变为f，或由a变为n，或由a变为q。

编码上述第64位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的dna分子，其具有如seqidno：3或seqidno：5或seqidno：6或seqidno：7或seqidno：8或seqidno：9或seqidno：10所示的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶的第415位氨基酸发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第415位氨基酸由a变为k，或由a变为r，或由a变为n。

编码上述第415位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的dna分子，其具有如seqidno：4或seqidno：11或seqidno：12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶的第64位和第415位氨基酸同时发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由a变为r,第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为r，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为r，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为l，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为l，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为l，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为k，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为k，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为k，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为m，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为m，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为m，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为f，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为f，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为f，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为n，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为n，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为n，第415位氨基酸由a变为n；或是第64位氨基酸由a变为q，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为q，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为q，第415位氨基酸由a变为n。

在本发明的进一步优选实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由a变为r，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为r，第415位氨基酸由a变为r；或是第64位氨基酸由a变为l，第415位氨基酸由a变为k；或是第64位氨基酸由a变为l，第415位氨基酸由a变为r。

编码上述第64位和第415位氨基酸同时发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的dna分子，其具有如seqidno：13或seqidno：14或seqidno：15或seqidno：16所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。

本发明还提供了具有上述dna分子的重组表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。

本发明提供的葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，在60℃处理10min后残余酶活达到51.79％～67.64％，在65℃处理5min后残余酶活达到35.63％～53.90％，70℃处理2.5min后残余酶活达到17.6％～34.96％。本发明提供的葡萄糖氧化酶两点突变体，与对应单点突变体相比，其耐热性又得到进一步提升，在60℃处理10min后残余酶活达到71.19％～82.92％，在65℃处理5min后残余酶活达到63.03％～72.58％，70℃处理2.5min后残余酶活达到49.91％～58.96％，75℃处理2.5min后残余酶活达到24.78％～32.05％。从以上结果可以说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual,3nded.(sambrook,2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

其中a、r、l、k、m、f、n、q分别是氨基酸ala，arg，leu，lys，met，phe，asn，gln的缩写。

本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：

菌株与载体：大肠杆菌dh5α、毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418购自invitrogen公司。

酶与试剂盒：pcr酶及连接酶购买自takara公司，限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorphii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基(lb培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，ph7.0)；

lb-amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；

酵母培养基(ypd培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

酵母筛选培养基(md培养基)：2％葡萄糖，2％琼脂糖，1.34％ynb，4×10^-5生物素；

bmgy培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，1％甘油；

bmmy培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，0.5％甲醇。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1葡萄糖氧化酶耐热单点突变体的获得

1.1葡萄糖氧化酶基因的扩增

以黑曲霉(aspergillusniger)基因组为模板进行pcr扩增，pcr引物god-f1、god-r1如下：

god-f1：ggtattgaggcatctttgttgac

god-r1：ttattgcatagaagcgtaatc

胶回收pcr产物，连接peasy-t载体，转化至大肠杆菌dh5α中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，扩增得到的基因片段的核苷酸序列为seqidno：2，其编码的氨基酸序列为seqidno：1。通过ncbiblast比对发现，seqidno：1与来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶序列相似性高达100％，从而确定通过pcr获得的基因为葡萄糖氧化酶基因，命名为god。

1.2葡萄糖氧化酶突变体基因的扩增及合成

为了提高上述葡萄糖氧化酶god的耐热性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计pcr引物god-f2、god-r2如下：

god-f2：ggcgaattcggtattgaggcatctttgttgac(下划线为限制性内切酶ecori识别位点)

god-r2：atagcggccgcttattgcatagaagcgtaatc(下划线为限制性内切酶noti识别位点)

以god基因为模板，以上述引物用genemorphii随机突变pcr试剂盒(stratagene)进行pcr扩增，胶回收pcr产物，ecori、noti进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mmiptg的lb+amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出10μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70℃处理5min后，两块96孔板都加入40μl底物，于30℃反应30min后，dns法测定生成的还原糖，计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。实验结果表明，有些突变对葡萄糖氧化酶god的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高葡萄糖氧化酶对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选到既能显著提高葡萄糖氧化酶god的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：a64r单点突变，a415k单点突变。

将含a64r单点突变的葡萄糖氧化酶突变体命名为god1，其编码核苷酸序列为seqidno：3；含a415k单点突变的葡萄糖氧化酶突变体命名为为god2，其编码核苷酸序列为seqidno：4。

用引物god-f2、god-r2对上述两个突变体分别进行pcr扩增，引物两端引入ecori、noti位点。pcr反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，god1、god2基因均为大小1800bp左右的片段。

通过上述同样的pcr方法扩增得到野生型葡萄糖氧化酶god的基因片段。

1.3毕赤酵母工程菌株的构建

将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突变体基因god1和god2，通过ecori和noti位点与表达载体ppic9k相连接，构建表达载体ppic9k-god1和ppic9k-god2。

将表达载体ppic9k-god1和ppic9k-god2用sali进行线性化，表达载体线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，在md平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株gs115/ppic9k-god1和gs115/ppic9k-god2，然后分别在含不同浓度遗传霉素的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。

将筛选得到的单点突变体的转化子分别命名为毕赤酵母god1(pichiapastorisgod1)和毕赤酵母god2(pichiapastorisgod2)，分别转接于bmgy培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入bmmy培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，分别得到含葡萄糖氧化酶god1和god2的发酵上清液；将其进行sds-page电泳检测分析。结果显示，发酵上清液中葡萄糖氧化酶突变体god1和god2的分子量大小约为64kda，与理论分子量大小相同。

通过上述同样的酶切连接方法将野生型葡萄糖氧化酶基因god克隆到毕赤酵母gs115宿主中，构建得到重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母god(pichiapastorisgod)。摇瓶水平发酵毕赤酵母god，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含野生型葡萄糖氧化酶god的发酵上清液。

(1)葡萄糖氧化酶酶活单位的定义

在ph6.0，30℃条件下，每分钟能把1μmol的β-d-葡萄糖氧化为d-葡萄糖酸和过氧化氢

所需要的酶量，定义为1个酶活力单位(iu)。

(2)酶活测定方法

将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10u/ml。取4支150*15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml4-氨基安替吡啉、0.1ml辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5min时吸光度值为a0，再反应1min后，读取吸光度值a1，得出δa500＝a1-a0。

酶活计算公式：

试样中酶活力x1(u/ml或u/g)按照如下公式计算：

x1＝δa500×f×b×1000/(887×t×a×d)＝33.82×δa500×f

式中：

f---------------------酶液稀释倍数

b--------------------反应液体积(3ml)

1000----------------消光系数单位转换系数

887-----------------消光系数(l·mol-1·cm-1)

t---------------------反应时间(min)，即读数a1与a0之间的时间差值1min。

a--------------------加入样品体积(0.1ml)

d--------------------比色皿的厚度(cm)

(3)酶活测定结果

按照上述方法进行发酵上清液的酶活测定，结果显示：重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母god发酵上清液的酶活为105u/ml，而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母god1和毕赤酵母god2发酵上清液的酶活分别达到100u/ml和121u/ml。

1.4发酵验证

在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母god、毕赤酵母god1和毕赤酵母god2的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/l、磷酸二氢钾5.5g/l、磷酸二氢铵55g/l、硫酸钾20.3g/l、硫酸镁16.4g/l、氢氧化钾1.65g/l、消泡剂0.05％。

发酵工艺：ph值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

采用实施例1中1.3所述葡萄糖氧化酶酶活测定方法对粗酶液进行酶活检测，结果显示，重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母god最终的发酵酶活为3050u/ml，而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母god1和毕赤酵母god2最终的发酵酶活分别达到3011u/ml，3340u/ml。

1.5葡萄糖氧化酶酶学性质测定

1、最适作用ph

采用ph值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在30℃条件下对实施例1中1.4所述发酵粗酶液进行葡萄糖氧化酶活力测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示野生型葡萄糖氧化酶god与突变体god1和god2的最适作用ph值都为6.0，且在不同ph条件下的相对酶活水平差别不大。2、最适反应温度

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，ph5.0条件下，对实施例1中1.4中所述粗酶液进行葡萄糖氧化酶酶活测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示，野生型葡萄糖氧化酶god1的最适作用温度为30℃；而葡萄糖氧化酶突变体god1和god2的最适作用温度为35℃。

3、热稳定性分析

将上述粗酶液用ph6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释后，在60℃处理10min、65℃处理5min、70℃处理2.5min后，测定酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算残余酶活。结果所示，葡萄糖氧化酶突变体god1和god2的残余酶活均显著高于野生型。其中，野生型葡萄糖氧化酶god在60℃处理10min后残余酶活为40.19％，在65℃处理5min后残余酶活剩22.04％，70℃处理2.5min后酶活仅剩9.89％；而葡萄糖氧化酶突变体god1在60℃处理10min后残余酶活为69.32％，在65℃处理5min后残余酶活为58.86％，70℃处理2.5min后残余酶活为39.96％；葡萄糖氧化酶突变体god2在60℃处理10min后残余酶活为60.04％，在65℃处理5min后残余酶活为39.34％，70℃处理2.5min后残余酶活为27.67％，从以上结果可以说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

实施例2葡萄糖氧化酶耐热单点突变体的饱和突变筛选

采用实施例1中所述筛选并获得耐热突变体的方法，对葡萄糖氧化酶god的第64位和第415位氨基酸分别进行饱和位点突变。进一步，对获得的突变体分别进行热稳定性实验。

结果显示：当葡萄糖氧化酶god的第64位氨基酸由a突变为l，或k，或m，或f，或n，或q时，均表现出比野生型更好的耐热性,将上述突变体分别命名为god3，god4，god5，god6，god7，god8，其编码核苷酸序列分别为seqidno：5，seqidno：6，seqidno：7，seqidno：8，seqidno：9，seqidno：10；

当葡萄糖氧化酶god的第415位氨基酸由a突变为r或n时，均表现出比野生型更好的耐热性，将上述突变体分别命名为god9和god10，其编码核苷酸序列分别为seqidno：11和seqidno：12。

上述葡萄糖氧化酶突变体具体的耐热性能见表1。

表1葡萄糖氧化酶突变体耐热性分析

实施例3葡萄糖氧化酶耐热两点组合突变体的获得

采用实施例1中所述筛选并获得突变体的方法，对葡萄糖氧化酶god的第64位和第415位耐热位点进行突变组合筛选。进一步，对获得的突变体分别进行热稳定性实验。

结果显示：耐热性比上述单点突变体更好的两点突变组合包括：a64r+a415k，或a64r+a415r，或a64r+a415n，或a64l+a415k，或a64l+a415r，或a64l+a415n，或a64k+a415k，或a64k+a415r，或a64k+a415n，或a64m+a415k，或a64m+a415r，或a64m+a415n，或a64f+a415k，或a64f+a415r，或a64f+a415n，或a64n+a415k，或a64n+a415r，或a64n+a415n，或a64q+a415k，或a64q+a415r，或a64q+a415n。

所述两点突变体的葡萄糖氧化酶酶活残留率比上述单点突变体普遍提高了30％～235％。而其中耐热性最强的两点突变组合包括：a64r+a415k，或a64r+a415r，或a64l+a415k，或a64l+a415r。将所述四个两点突变体分别命名为god11，god12，god13，god14，其编码核苷酸序列分别为seqidno：13，seqidno：14，seqidno：15，seqidno：16。

所述葡萄糖氧化酶突变体具体的耐热性能见表2。

表2葡萄糖氧化酶突变体耐热性分析

综上所述，与野生型相比，本发明筛选获得的葡萄糖氧化酶突变体具有更强的耐热性，更适合用作饲料添加剂，有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120>葡萄糖氧化酶突变体

<130>

<160>16

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>581

<212>prt

<213>1

<400>1

glyileglualaserleuleuthraspprolysaspvalserglyarg

151015

thrvalasptyrileilealaglyglyglyleuthrglyleuthrthr

202530

alaalaargleuthrgluasnproasnileservalleuvalileglu

354045

serglysertyrgluseraspargglyproileilegluaspleuasn

505560

alatyrglyaspilepheglyserservalasphisalatyrgluthr

65707580

valgluleualathrasnasnglnthralaleuileargserglyasn

859095

glyleuglyglyserthrleuvalasnglyglythrtrpthrargpro

100105110

hislysalaglnvalaspsertrpgluthrvalpheglyasnglugly

115120125

trpasntrpaspasnvalalaalatyrserleuglnalagluargala

130135140

argalaproasnalalysglnilealaalaglyhistyrpheasnala

145150155160

sercyshisglyvalasnglythrvalhisalaglyproargaspthr

165170175

glyaspasptyrserproilevallysalaleumetseralavalglu

180185190

aspargglyvalprothrlyslysasppheglycysglyaspprohis

195200205

glyvalsermetpheproasnthrleuhisgluaspglnvalargser

210215220

aspalaalaargglutrpleuleuproasntyrglnargproasnleu

225230235240

glnvalleuthrglyglntyrvalglylysvalleuleuserglnasn

245250255

glythrthrproargalavalglyvalglupheglythrhislysgly

260265270

asnthrhisasnvaltyralalyshisgluvalleuleualaalagly

275280285

seralavalserprothrileleuglutyrserglyileglymetlys

290295300

serileleugluproleuglyileaspthrvalvalaspleuproval

305310315320

glyleuasnleuglnaspglnthrthralathrvalargserargile

325330335

thrseralaglyalaglyglnglyglnalaalatrpphealathrphe

340345350

asngluthrpheglyasptyrserglulysalahisgluleuleuasn

355360365

thrlysleugluglntrpalagluglualavalalaargglyglyphe

370375380

hisasnthrthralaleuleuileglntyrgluasntyrargasptrp

385390395400

ilevalasnhisasnvalalatyrsergluleupheleuaspthrala

405410415

glyvalalaserpheaspvaltrpaspleuleuprophethrarggly

420425430

tyrvalhisileleuasplysaspprotyrleuhishisphealatyr

435440445

aspproglntyrpheleuasngluleuaspleuleuglyglnalaala

450455460

alathrglnleualaargasnileserasnserglyalametglnthr

465470475480

tyrphealaglygluthrileproglyaspasnleualatyraspala

485490495

aspleuseralatrpthrglutyrileprotyrhispheargproasn

500505510

tyrhisglyvalglythrcyssermetmetprolysglumetglygly

515520525

valvalaspasnalaalaargvaltyrglyvalglnglyleuargval

530535540

ileaspglyserileproprothrglnmetserserhisvalmetthr

545550555560

valphetyralametalaleulysileseraspalaileleugluasp

565570575

tyralasermetgln

580

<210>2

<211>1746

<212>dna

<213>2

<400>2

ggtattgaggcatctttgttgacagaccctaaggatgtttctggaagaaccgttgactac60

attattgctggtggtggtttgaccggattgaccactgccgcaagattgactgaaaatcca120

aacatctctgttttggtcatcgagtctggttcttacgaatctgacagaggacctattatc180

gaagacttgaacgcttacggtgatattttcggatcttctgttgatcatgcctacgagaca240

gttgagttggctactaacaatcagactgctttgattaggtctggaaatggtttgggtgga300

tctactttggttaatggaggtacttggactagaccacataaggctcaggttgattcttgg360

gaaactgtttttggtaacgaaggttggaactgggataacgttgcagcttactctttgcaa420

gcagaaagagctagggctccaaacgctaagcaaattgctgctggtcattactttaacgct480

tcttgtcacggtgttaacggaactgtccacgccggacctagagacactggagatgattac540

tctccaattgtcaaggcattgatgtctgctgttgaagatagaggagtcccaaccaagaag600

gatttcggttgtggtgatccacatggtgtttctatgttcccaaatacattgcacgaagat660

caagttaggtctgacgctgctagagaatggttgttgccaaattatcaaagaccaaacttg720

caggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggttttgttgtctcaaaacggtactactcca780

agagctgtcggtgtcgagttcggtactcataagggtaatactcacaacgtttacgctaag840

catgaagttttgttggctgctggttctgctgtttctccaaccatcttggagtattctgga900

attggtatgaagtctattttggaaccattgggtattgatactgtcgttgatttgccagtt960

ggtttgaacttgcaggatcagactacagccactgtcagatccagaattacttctgctggt1020

gctggtcaaggtcaggctgcatggtttgctacttttaacgaaacttttggtgattactct1080

gaaaaggctcatgaattgttgaacactaagttggaacaatgggctgaagaagctgttgct1140

agaggtggttttcataatactactgctttgttgattcaatacgaaaactacagagactgg1200

attgttaaccataacgttgcctattctgagttgtttttggacaccgctggtgttgcttct1260

tttgatgtttgggatttgttgccatttacaagaggttacgttcacattttggataaagat1320

ccatacttgcatcactttgcatacgatccacaatactttttgaacgaattggacttgttg1380

ggtcaagctgctgctactcaattggctagaaacatttctaactctggtgcaatgcaaact1440

tactttgccggtgaaactatcccaggagataacttggcttacgatgctgatttgtctgct1500

tggactgaatacattccataccatttcagaccaaactaccacggtgtcggtacttgttct1560

atgatgccaaaggaaatgggaggtgttgtcgataacgctgcaagagtctacggagttcaa1620

ggtttgagagttattgatggttctattccaccaactcaaatgtcttctcatgttatgact1680

gttttttacgctatggctttgaagatttctgatgctatcttggaagattacgcttctatg1740

caataa1746

<210>3

<211>1746

<212>dna

<213>3

<400>3

ggtattgaggcatctttgttgacagaccctaaggatgtttctggaagaaccgttgactac60

attattgctggtggtggtttgaccggattgaccactgccgcaagattgactgaaaatcca120

aacatctctgttttggtcatcgagtctggttcttacgaatctgacagaggacctattatc180

gaagacttgaacagatacggtgatattttcggatcttctgttgatcatgcctacgagaca240