本发明具体涉及一种桑黄液体菌种培养的优化方法。
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：桑黄（phellinusigniarius），中药名，由于通常生长在桑属（morusl.）植物上且子实体为黄褐色的缘故而得名，有“森林黄金”之美称。桑黄是一种大型珍贵的多年生药用真菌，以子实体入药，在我国，应用桑黄治病从明朝开始到至今已经有2000多年的历史了。在古代，民间就流传有“桑树生黄，幸得之，百病可医”的说法及“如果得到附生于桑树上的黄色疙瘩（桑黄），死人也可复活”的传说。中医认为桑黄性寒、味微苦、味辛，归肝、膀胱经。本品辛行甘和，人血分以化瘀，瘀血循经而行出血止，有化瘀之功效，能利五脏、软坚、排毒、止血、活血和胃止泻等。民间用于治痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、疮窟积聚、癖软、脱肛泻血、带下、经闭、脾虚泄泻等。同时民间把它作为一种治疗肝病、癌症的绝药。但是由于桑黄对生长环境、温度、湿度要求极高，加之生长周期长，极难发现，因而天然的桑黄数量非常稀少，货源奇缺，价格昂贵。同时由于外商需求量大，经济效益高，致使各产地对桑黄进行掠夺性开采，野生子实体孢子无法形成。在我国东北地区该资源已经难以恢复，西北也即将枯竭。再加上我国天然的桑黄数量本来就非常稀少，子实体的人工栽培尚处于起步阶段，所以要想形成稳定的医药工业产品来源，就必须充分挖掘桑黄的自然资源，深入开展桑黄菌种的分离培养，以利于分离出生长周期短、抗污染能力强、多糖产量高及其药理作用好的桑黄菌种。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能有效促进桑黄的菌丝的生长的桑黄液体菌种培养优化方法。为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：配制液体培养培养基，配方为碳源、氮源、微量元素、磷酸二氢钾、硫酸镁和水。所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉中的一种。所述氮源选自蛋白胨、酵母膏、奶粉、尿素、氯化铵中的一种。所述微量元素选自维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12中的一种。液体培养基的配制步骤具体如下：（1）计算：按照选定的培养基配方，计算各种成分的用量。（2）称量：将所有药品按照计算准确称量。（3）煮汁：量取1000ml的水用电磁炉烧开然后按照易溶到不易溶的顺序依次将药品加入锅中，用玻璃棒搅拌直至溶解。（4）分装：将配制好的培养基分装到500ml的三角瓶中，每个三角瓶装150ml，用漏斗分装避免培养基粘在三角瓶口壁上，如粘上则用纱布擦干净否则易滋生杂菌。用封口膜封口，并贴上标签。（5）灭菌：放在高压灭菌锅内灭菌，在压力为0.1-0.2mpa，温度为121℃下，灭菌40min，待其压力降至零时，打开压力锅盖取出三角瓶放置冷却备用。液体培养基的接种步骤具体如下：（1）将已灭过菌的三角瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种环等放人超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70%的酒精对菌种培养皿进行消毒，操作人员的手带无粉乳胶手套并用70%酒精消毒，点燃酒精灯。（2）在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针和打孔器在酒精灯火焰上灼烧消毒，用打孔器在桑黄菌种平板表面进行打孔。打孔时沿菌落最外缘向中间逐次打，边缘的菌丝生长能力比较旺盛。（3）接种：用消毒过的接种针挑1个菌饼块，沿着三角瓶封口薄膜一侧揭开一条缝，通过酒精灯火焰的无菌区，将菌饼块掉入三角瓶内，每个三角瓶内接2块的菌饼块。放菌饼块的时候不要接触到瓶壁，避免污染。接种后将三角瓶移至19℃的恒温振荡摇床中静止培养24h，后在恒温为19℃转速120r/min恒温振荡摇床继续培养。利用本发明的优化条件培养的菌种，生长周期短、抗污染能力强、多糖产量高及其药理作用好的桑黄菌种。具体实施方式实施例1本实施例中桑黄液体菌种培养步骤如下：1、配制液体培养培养基。配方为可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1g，维生素b110mg，水1000ml。将液体培养基装入500ml三角瓶中（120ml/瓶)，用2mol/l柠檬酸和1mol/lnaoh将培养基的ph值从自然调到2.2至6.2，然后放到高压灭菌锅内，灭菌40min，取出备用，以测定不同的ph值对桑黄菌丝生长的影响。配制步骤具体如下：（1）计算：按照选定的培养基配方，计算各种成分的用量。（2）称量：将所有药品按照计算准确称量。（3）煮汁：量取1000ml的水用电磁炉烧开然后按照易溶到不易溶的顺序依次将药品加入锅中，用玻璃棒搅拌直至溶解。（4）分装：将配制好的培养基分装到500ml的三角瓶中，每个三角瓶装150ml，用漏斗分装避免培养基粘在三角瓶口壁上，如粘上则用纱布擦干净否则易滋生杂菌。用封口膜封口，并贴上标签。（5）灭菌：放在高压灭菌锅内灭菌，在压力为0.1-0.2mpa，温度为121℃下，灭菌40min，待其压力降至零时，打开压力锅盖取出三角瓶放置冷却备用。2、接种。（1）将已灭过菌的三角瓶、接种工具、酒精棉球、酒精灯、接种环等放人超净工作台中，开启紫外线灯照射30min，用70%的酒精对菌种培养皿进行消毒，操作人员的手带无粉乳胶手套并用70%酒精消毒，点燃酒精灯。（2）在酒精灯火焰无菌区范围内，将接种针和打孔器在酒精灯火焰上灼烧消毒，用打孔器在桑黄菌种平板表面进行打孔。打孔时沿菌落最外缘向中间逐次打，边缘的菌丝生长能力比较旺盛。（3）接种：用消毒过的接种针挑1个菌饼块，沿着三角瓶封口薄膜一侧揭开一条缝，通过酒精灯火焰的无菌区，将菌饼块掉入三角瓶内，每个三角瓶内接2块的菌饼块。放菌饼块的时候不要接触到瓶壁，避免污染。3、摇床培养。将三角瓶移至19℃的恒温振荡摇床中静止培养24h，后在恒温为19℃转速120r/min恒温振荡摇床继续培养。菌丝球直径的测定从接种后48h开始，以后每隔24h测定一次。每次测量取液均需要在超净工作台内进行，取液时先用1ml移液枪枪头移取3次，共取出3ml培养液放入垫有吸水纸的培养皿中，按1ml培养液含菌球大小的数量比随机取十个菌丝球排成一行用游标卡尺测总长度，并计算出平均每个菌丝球的直径。菌丝球密度的测定中，测量时间及取液方法和菌丝球直径的测定步骤相同，取出3ml的培养液放入培养皿中，在培养皿中垫上彩色吸水纸便于观察计数数出3ml培养液中的菌丝球个数并求出1ml培养液中的菌丝球个数。菌丝球重量的测定中，测量时间及取液方法和菌丝球直径的测定步骤相同，取出3ml培养液放入垫有彩色吸水纸的培养皿中，用吸水纸把水分吸收掉用接种针随机的挑出不同大小10个的菌丝球放到电子天平上测出总质量，并求出每个菌丝球的重量。培养基ph采用如下方式测定：在超净工作台内，以无菌操作的方式用灭过菌的玻璃棒蘸取培养液置于ph试纸上然后对照比色卡读出ph值并记录。实施例2本实施例说明培养基中不同碳源下菌丝的生长差异。培养基配方为碳源20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1g，维生素b110mg，水1000ml。碳元素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物还是蛋白质的基本组成元素，同时又是重要的能源来源。培养基中不同碳源菌丝的生长明显的差异如表1所示。（取培养第3天的菌丝球）表1不同碳源对桑黄液体菌丝生长的影响从表1可以看出，以可溶性淀粉为碳源最好，并显著高于葡萄糖，麦芽糖等其他碳源，菌丝球培养第4d菌丝密度稠密，可溶性淀粉的直径最大达到1.72mm是直径最小的葡萄糖的2倍，丝生长量的大小依次可溶性淀粉>乳糖>麦芽糖>葡萄糖>蔗糖。实施例3本实施例说明培养基中不同氮源下菌丝的生长差异。培养基配方为葡萄糖20g，氮源10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1g，维生素b110mg，水1000ml。氮元素是真菌合成蛋白质、核酸的重要原料，对菌丝的生长发育非常重要。从表2可以看出，不氮源条件下桑黄菌丝的生长有着明显的差别（取培养第3天的菌丝）。表2不同氮源对桑黄菌丝生长状况的影响从表2可以看出奶粉，氯化铵和蛋白胨等有机氮为试验组菌丝球的密度稠密，菌丝球的直径大小一致性高，菌丝状况明显好于酵母膏和尿素为无机氮源的试验组。从生长量来看以奶粉为氮源的菌丝生长速度最快菌丝直径达到1.90mm，菌丝球重量21.30mg/个，菌丝球密度达到23.67个/ml，次之为蛋白胨和氯化铵。实施例4本实施例说明培养基中不同微量元素下菌丝的生长差异。培养基配方为葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1g，微量元素10mg，水1000ml。维生素作为微量生长因子对桑黄的生长有着明显的影响，从表3可以看出桑黄对不同的生长因子利用率是有差异的（取培养第3天的菌丝）。表3不同生长因子对桑黄菌丝生长状况的影响桑黄菌丝体不能合成必要的维生素，适当的加入一些vb系列的生长因子可以促进菌丝的生长从表3可以看出维生素b12对桑黄菌丝生长的促进高于维生素b1等生长因子。实施例5本实施例说明培养基中不同培养液初始ph值下菌丝的生长差异。培养基配方为葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1g，维生素b110mg，水1000ml。不同初始ph值对桑黄菌丝生长是有影响的它们之间的差异程度从表4可以看出（取培养第5天的菌丝）。表4不同初始ph值对桑黄菌丝生长状况的影响编号ph值菌丝直径（mm）菌丝球重量（mg/个）菌丝球密度（个/ml)培养液颜色12.2000乳白色22.60.681.103.67乳白色33.01.3614.9318.67乳白色43.20.8812.6712.67灰白色53.41.17227.00107.67粉红色64.52.3133.184.20深红色74.01.43126.80105.67粉红色85.52.4247.5315.33深红色96.01.5368.2022.00咖色106.21.271.830.67咖色从表4可以看出，初始ph值在3.4-6.0的范围内对桑黄的生长没有太大的影响，生长速率高于其他ph值。在培养液ph值为3.4-4.5范围内时菌丝球的直径与密度要其他的ph值范围是要大一些，说明桑黄子实体的形成与生长多以弱酸性为宜，因此将培养液的ph值控制在3.4-4.5之间有利于菌丝生长。当前第1页12