一种鲜地黄中甘露三糖的提取方法与流程

本发明涉及甘露三糖提取制备技术领域，特别涉及一种鲜地黄中甘露三糖的提取方法。

背景技术：

甘露三糖(英文名：manninotriose，分子式C₁₈H₃₂O₁₆)，是一种天然的功能性寡糖，可以强效增殖人体肠道内有益菌群(双歧杆菌和乳酸菌等)，具有良好的生理功能。尤为重要的是，甘露三糖是鲜地黄经加工炮制成熟地黄后含量最高的化学成分，含量高达30％(折干计)，因此从经济效益和安全性角度考虑，有必要开发从鲜地黄中制备高纯度甘露三糖的方法，以期经进一步研究和开发使甘露三糖成为一类创新药物，并为地黄的质量控制提供参考。

CN104059111B公开了一种采用地黄根为原料，用活性炭分离得到甘露三糖的方案。所采用原料中甘露三糖含量偏低(因水苏糖含量高于甘露三糖数倍)从而导致提取率偏低，采用活性炭分离甘露三糖容易造成吸附从而提取率进一步降低。

郭威等在上海中医药大学学报,2007,21(6):70-72.“地黄中活性成分甘露三糖提取工艺研究”中以熟地黄为原料，优化了沸水浸提工艺，如时间、次数、加水量等，但其使用的是沸水浸提，能源消耗大，提取率不高。

山东大学赵宇的硕士学位论文《鲜地黄产后加工机理研究》中以鲜地黄加工后生地黄为原料，测定了不同温度和时间等因素影响下的甘露三糖的含量变化，为控制地黄在加工炮制过程中水苏糖的降解方式提供了有益的参考，但论文中并未提及如何将甘露三糖更大程度的提取出来。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术从鲜地黄中提取甘露三糖的工艺中存在的能耗高、提取率不高的问题，本申请公开了一种从鲜地黄炮制直到提取、纯化的甘露三糖的提取方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种鲜地黄中甘露三糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)鲜地黄高温加工炮制：鲜地黄洗净后切片，密闭加热至90-95℃保持5-6h进行炮制；

(2)甘露三糖样液制备：将步骤(1)得到的鲜地黄加工炮制品加入70-80℃的水中浸提0.5-1h，残渣按上述操作继续浸提1次，合并浸提液，真空浓缩，即得到甘露三糖样液；

(3)醇沉：将乙醇加入甘露三糖样液，自然降温静置，得甘露三糖样液醇沉部分；

(4)除杂脱色浓缩：将步骤(3)得到的醇沉部分用水稀释，用0.5％的活性炭或大孔吸附树脂脱色，过滤后浓缩得浓缩液；

(5)色谱分离：将浓缩液稀释，通过凝胶LH20柱色谱以25％的乙醇洗脱，以TLC检测合并含甘露三糖的馏分，浓缩或冷冻干燥得甘露三糖。

所述的提取方法，优选步骤(2)中鲜地黄加工炮制品与水的质量比为1:2。

所述的提取方法，优选步骤(3)中乙醇与甘露三糖样液体积比为1:2。

所述的提取方法，优选步骤(4)中脱色时上样液重量与树脂体积比例为450g/L。

所述的提取方法，优选步骤(3)中将乙醇加入甘露三糖样液，在温度80℃保温30min，自然降温静置24h。

所述的提取方法，优选步骤(5)得到的甘露三糖纯度大于98％，总收率≥4％。

所述的提取方法，优选步骤(2)中合并浸提液，真空浓缩至60^。Brix，即得到甘露三糖样液。

所述的提取方法，优选步骤(4)中过滤后在60℃条件下浓缩样液至60^。Brix；

所述的提取方法，优选步骤(5)中将浓缩液稀释到10^。Brix，然后再过色谱柱。

所述的提取方法，优选步骤(4)中将步骤(3)得到的醇沉部分用水稀释10倍。

本发明的有益效果：

1)对鲜地黄直接进行高温加工炮制，而不经过生地黄的操作，大大的减少了鲜地黄加工的工艺步骤，炮制后甘露三糖含量丰富，并且，从收率数据看，也具有积极的影响；

2)水浸提时温度为70-80℃，而不是惯常使用的沸水浸提，对提高收率具有显著影响；

3)采用高温蒸制后经树脂和凝胶联用得到甘露三糖，总收率达到4.0％以上，纯度高于98.0％，为高纯度甘露三糖的制备提供了一条环保、便捷和经济的方法；

4)制备工艺简洁且所用溶剂环保经济，产品质量稳定可控。

附图说明

图1：鲜地黄，

图2：鲜地黄HPLC，

图3：济南建联药店生地黄HPLC，

图4：济南建联药店熟地黄HPLC，

图5为对比例1中的生地黄的HPLC，

图6为对比例1中的熟地黄的HPLC，

图7为实施例1中鲜地黄经高温加工炮制后的HPLC，

图8：高纯度甘露三糖单体HPLC。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1一种由鲜地黄制备高纯度甘露三糖的方法，由如下步骤组成：

(1)鲜地黄高温加工炮制：取采收后的鲜地黄25.0g，弃去霉烂部位，洗净后切片，切成厚度为3cm的切片，密闭加热至90℃保持6h；

(2)甘露三糖样液制备：按质量比为1:2的比例将步骤(1)得到的鲜地黄加工炮制品加入70℃的水中浸提0.5h，残渣按上述工艺继续浸提1次，合并浸提液，真空浓缩至60^。Brix的糖液，即得到甘露三糖样液。

(3)醇沉得甘露三糖样液醇沉部分：按体积比为1:2的比例将乙醇加入甘露三糖样液，在温度80℃保温30min，自然降温静置24h，得甘露三糖样液醇沉部分；

(4)除杂脱色浓缩得甘露三糖样液：将步骤3所得到的醇沉甘露三糖样液用水稀释10倍，用0.5％的活性炭或大孔吸附树脂(上样液重量与树脂体积比例为450g/L)脱色，过滤后在60℃条件下浓缩样液至60^。Brix；

(5)凝胶LH20柱色谱分离得到甘露三糖：将甘露三糖样液稀释到10^。Brix，通过凝胶LH20柱色谱以25％的乙醇洗脱，以TLC检测合并含甘露三糖的馏分，浓缩或冷冻干燥得甘露三糖，浓缩干燥得甘露三糖1.1g，纯度98.5％，总收率4.4％。

实施例2一种由鲜地黄制备高纯度甘露三糖的方法，由如下步骤组成：

(1)鲜地黄高温加工炮制：取采收后的鲜地黄50.0g，弃去霉烂部位，洗净后切片，切成厚度为4cm的切片，密闭加热至95℃保持5h；

(2)甘露三糖样液制备：按质量比为1:2.5的比例将步骤(1)得到的鲜地黄加工炮制品加入80℃的水中浸提1h，残渣按上述工艺继续浸提1次，合并浸提液，真空浓缩至60^。Brix的糖液，即得到甘露三糖样液。

(3)醇沉得甘露三糖样液醇沉部分：按体积比为1:2的比例将乙醇加入甘露三糖样液，在温度80℃保温30min，自然降温静置24h，得甘露三糖样液醇沉部分；

(4)除杂脱色浓缩得甘露三糖样液：将步骤3所得到的醇沉甘露三糖样液用水稀释10倍，用1％的活性炭或大孔吸附树脂(上样液重量与树脂体积比例为450g/L)脱色，过滤后在60℃条件下浓缩样液至60^。Brix；

(5)凝胶LH20柱色谱分离得到甘露三糖：将甘露三糖样液稀释到10^。Brix，通过凝胶LH20柱色谱以20％的乙醇洗脱，以TLC检测合并含甘露三糖的馏分，浓缩得甘露三糖，浓缩干燥得甘露三糖2.0g，纯度98.1％，总收率4.0％。

实施例3一种由鲜地黄制备高纯度甘露三糖的方法，由如下步骤组成：

(1)鲜地黄高温加工炮制：取采收后的鲜地黄100.0g，弃去霉烂部位，洗净后切片，切成厚度为3cm的切片，密闭加热至90℃保持6h；

(2)甘露三糖样液制备：按质量比为1:2的比例将步骤(1)得到的鲜地黄加工炮制品加入80℃的水中浸提1h，残渣按上述工艺继续浸提1次，合并浸提液，真空浓缩至60。Brix的糖液，即得到甘露三糖样液。

(3)醇沉得甘露三糖样液醇沉部分：按体积比为1:2的比例将乙醇加入甘露三糖样液，在温度80℃保温30min，自然降温静置24h，得甘露三糖样液醇沉部分；

(4)除杂脱色浓缩得甘露三糖样液：将步骤3所得到的醇沉甘露三糖样液用水稀释10倍，用1％的活性炭或大孔吸附树脂(上样液重量与树脂体积比例为450g/L)脱色，过滤后在60℃条件下浓缩样液至60^。Brix；

(5)凝胶LH20柱色谱分离得到甘露三糖：将甘露三糖样液稀释到10^。Brix，通过凝胶LH20柱色谱以20％的乙醇洗脱，以TLC检测合并含甘露三糖的馏分，浓缩得甘露三糖，浓缩干燥得甘露三糖4.3g，纯度98.3％，总收率4.3％。

对比例1

步骤(1)中鲜地黄中60℃烘焙为生地黄，生地黄蒸锅中蒸制16小时后进行第2步操作，后续操作同实施例3相同。纯度98.4％，总收率0.9％。

对比例2

同实施例3相比，步骤(2)中的水浸提操作中水为沸水，其余操作同实施例3相同。纯度98.2％，总收率2.5％。

图1为鲜地黄的图片，图2为鲜地黄的HPLC，HPLC检测方法如下：

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱及Agilent Chem Station工作站。蒸发光散射检测器为Alltech ELSD 2000ES。乙腈(色谱纯)购于Honeywell Burdick&Jackson，实验用水由Milli-Q Integral 3超纯水处理器制备。色谱柱:Thermo Aps-2 Hypersil NH₂(4.6mm×250mm,5μm)，流动相:乙腈-水(75:25)，流速:1mL/min。蒸发光散射检测器漂移管温度为94℃，载气空气流速为2.2L/min，柱温25℃，进样量10μL。样品均精密称定，加水适量溶解成1mg/mL溶液。

图3和4分别为从济南建联药店购买的生地黄和熟地黄的HPLC，图5和6分别为对比例1中的生地黄和熟地黄的HPLC，图7为实施例1中鲜地黄经高温加工炮制后的HPLC，图8为高纯度甘露三糖单体HPLC。从图2-8中可以看出，从市面上方便买到的生地黄和熟地黄中甘露三糖的含量都比较低，对比例1中炮制方法得到的生地黄和熟地黄中甘露三糖的含量也比较低，而本申请实施例1中的炮制方法得到的熟地黄中，甘露三糖含量较高，为提高收率提供了物质基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。