一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。

背景技术：

烟草花叶病是由烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）引起的，它是第一个被鉴定的单链正义病毒（Beijerinck MW, Uebereincontagiumvivumfluidumalsursachederfleckenkrankheit der tabaksblatter.VerhKonAkadWetensch, 1898, 5: 3-21），属于花叶病毒家族（Dawson WOand Lehto KM, Regulation of tobamovirus gene expression, Adv. Virus.Res., 1990, 8: 307-342），具有传染活性（Erickson FL,Holzberg S,Calderon-Urrea A,Handley V,Axtell M,Corr C,and Baker B, The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defense response in tobacco. Plant J., 1999,18: 67-75）。因其宿主主要为包括烟草在内的茄科作物，严重影响烟叶的产量和品质，因此，对烟草产业造成巨大经济损失。因此，选育抗病品种、提高烟草本身的抗病性是防治TMV的根本途径。

N基因起源于烟草野生种粘毛烟草(Nicotianaglutinosa)，是一个显性单基因（Gerstel DU, Inheritance in Nicotianatabacum.XIX. Identification of the tabacum chromosome replaced by one from N. glutinosa in mosaic-resistant holmessamsoun tobacco, Genetics, 1945, 30: 448-454），属于TIR-NBS-LRR类抗病基因，介导烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的抗性，通过转座子标签法得到克隆（Whitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, HehlR,Corr C and Baker B, The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the Interleukin-1 Receptor, Cell , 1994, 78:1101-1115）。N基因很容易进入育种程序且能够很快在选育品种中稳定下来，仅仅导入N基因就可使烟草具有TMV抗性（Ternovsky M F, Methods of breeding tobacco varieties resistant to tobacco mosaic and powdery mildew, The A.I. Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & Indian Tob.Ind. Krasnodar Publ, 1945, 143: 126-141），因此，通过选择具有N基因的育种材料可选出有抗性的基因型(Wernsman EA, Sources of resistance to virus diseases, Coresta Inf. Bull., 1992, 3: 113-119)。基于烟草普通花叶病抗性基因N的基因组序列，国内外的研究者成功的开发出多个用于检测烟草TMV抗性的分子标记（Lewis R S, Milla S R, and Levin J S, Molecular and genetic characterization of Nicotianaglutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus resistant tobacco accessions, Crop Sci., 2005, 45(6): 2355-2362；袁清华, 陈俊标, 李淑玲, 马柱文, 邱道寿, 张振臣,抗TMV烟草种质资源的N基因片段序列研究, 广东农业科学, 2011, 1(29): 96-99；陈爽, 朴世领, 金爱兰,烟草抗TMVN基因及其在分子标记辅助育种中的应用, 延边大学农学学报, 2012, 34(4): 355-361；张玉, 罗成刚, 殷英, 胡小波, 戴培刚, 张波,烟草N基因及其在烤烟遗传育种中的应用, 中国农学通报, 2013, 29(19): 89-92），同时建立了相应的检测体系（刘磊, 郭兆奎, 万秀清, 颜培强, 乔婵, 刘丹, N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用, 分子植物育种, 2010, 8(1): 167-171），并将其中的部分检测标记及方法申请了专利（CN101892304B；CN102140546B；CN103866038B）。但上述所有基于N基因开发的分子标记均是显性标记，其在实际的烟草育种实践中存在着严重的缺陷：1）不能区分材料中N基因的全部基因型，也即上述显性标记只能分辨出材料中是否含有抗性基因N，而无法进一步的区分出纯合抗性（NN）和杂合抗性（Nn）；2）无法确保其检测结果的准确性，即利用上述的显性标记在进行N基因检测时，若无特征（目的）条带出现时，并不能确定检测材料是感病的，极有可能存在实验因素造成的PCR扩增失败；3）检测体系繁琐，有部分标记是基于N基因的全长cDNA进行设计的，因而在实际检测中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及长片段DNA的PCR扩增等过程。鉴于此，开发一种能解决上述问题的方法是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于提供所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。

为了简便、高效选择抗TMV病烟草品种，有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料，本发明提供一种用于检测烟草抗TMV病基因N的分子标记TM508-007和TM508-118，该分子标记采用分离群体分组分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，筛选获得与烟草普通花叶病（TMV）N基因连锁的共显性SSR标记，可以用于烟草TMV抗性基因N的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗病品种选育的效率。

本发明利用Coker176（抗病亲本，其TMV抗性由N基因控制）和Y3（综合性状优良但易感TMV）构建回交一代（BC1F1）作图群体，采用分离群体分组分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，筛选与烟草普通花叶病（TMV）N基因连锁的共显性SSR标记，加速分子标记辅助选择（Marker Assistant Selection， MAS）在烟草TMV抗性品种选育中的利用。

本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草TMV病抗病育种中N基因分子标记辅助选择的应用。

附图说明

图1 是与烟草TMV抗性基因N连锁的共显性SSR标记在5份材料中的PCR扩增产物凝胶电泳图；

其中，A，共显性SSR标记TM508-007；B，共显性SSR标记TM508-007；RB，抗病池；SB，感病池；RP，抗病亲本（Coker176）；SP，感病亲本（Y3）；F1，两亲本间的杂交子一代；M，500bp DNA ladder，长度片段分别为：100bp，150bp，200bp，300bp，400bp，500bp；

图2 是共显性SSR标记TM508-007在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图；

其中，编号70（带黑色星星）为单交换单株；1-123为BC1F1单株编号；编号1-66，感病单株编号；编号67-123，抗病单株编号；RP，抗病亲本Coker176；SP，感病亲本Y3；F1，杂交子一代；

图3是共显性SSR标记TM508-118在123个BC1F1单株中的PCR扩增产物凝胶电泳图；

其中，编号69（带黑色星星）为单交换单株；1-123为BC1F1单株编号；编号1-66，感病单株编号；编号67-123，抗病单株编号；RP，抗病亲本Coker176；SP，感病亲本Y3；F1，杂交子一代；

图4是共显性SSR标记T508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N的连锁关系；

其中，左侧为标记（基因）名称；右侧为标记与N基因间的遗传距离（单位为：cM）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM508-007和TM508-118，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：

TM508-007序列为TM508-007F：5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’，

TM508-007R：5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’；

TM508-118序列为TM508-118F：5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’，TM508-118R：5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。

本发明所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草抗TMV病基因N中的应用。

所述的与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TM508-007序列的引物和TM508-118序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯和基因NN；如果PCR扩增产物中分别含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为不含有烟草抗TMV病的纯和基因NN，而含有其感病的纯合等位基因nn；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，同时含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即为含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。

以TM508-007序列的引物进行PCR扩增的反应体系为： 20uL，其中包含2.0 μL 的1× buffer （10 mM Tris-Cl, PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O补齐20uL，反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

以TM508-118序列的引物进行PCR扩增的反应体系为： 20uL，其中包含2.0 μL 的1×buffer （10 mM Tris-Cl, PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O补齐20uL，反应条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

利用分离群体分组分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记

一、实验材料

以综合性状优良但易感TMV的烤烟Y3为母本，以抗TMV烤烟材料Coker176（其抗性由N基因控制）为父本。2014年种植抗、感TMV亲本材料，经杂交，获得F1。2015年种植F1和两亲本，以Y3为轮回亲本，杂交获得回交一代（BC1F1）群体。2016年种植两亲本、F1和BC1F1世代材料。

二、亲本及BC1F1分离群体TMV抗性鉴定

试验材料成苗后移栽至大田，行株距为100cm × 50cm；移栽3周后进行人工接种。接种时将带TMV的病叶片磨碎后用水稀释至1%，采用高压喷枪接种病毒稀释液，喷射压力为1.5-2kg/cm²。

现蕾前开始调查病情，7天调查1次发病情况，取最后一次的调查数据进行以下分析，根据“TMV病害分级标准”进行分级。

0级：全株无病；

1级：心叶脉明或轻微花叶，植株无明显矮化；

3级：上部少于1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4以上；

5级：1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3-3/4；

7级：1/2-2/3叶片花叶，或变形或主脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2-2/3；

9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3-1/2。

把0-1级定为抗病植株，3-9级定为感病植株。

三、SSR标记分析

在烟草幼苗长到4片叶左右时，采用改良的CTAB法（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012, 131: 674-680）提取所有参试材料的全基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定提取后的DNA浓度和纯度。

SSR-PCR的体系配制、产物扩增及扩增产物的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%-non-PAGE）检测，参照童治军等（童治军等.普通烟草及其祖先种基因组SSR位点分析.中国农业科学, 2015, 48(11): 2108-2117）提供的方法进行。SSR标记（引物）由两部分构成，共18764对，其中，PT系列引物5119对（Bindler, et al. A high density genetic map of tobacco (NicotianatabacumL.) obtained from large scale microsatellite marker development.Theor. Appl. Genet., 2011, 123(2): 219-230），TM系列引物13645对（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012, 131: 674-680；Tong ZJ, et al. Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco. Breeding Science, 2016, 66: 381-390）。

四、 抗、感病基因组池的构建

采用分离群体分组分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA），选取BC1F1分离群体中的极端抗病（0级抗病）单株和极端感病（9级感病）单株各15株的基因组DNA，等量混合构建抗、感池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析。

在苗期按实施例1所述方法，利用18764对SSR引物对抗病亲本Coker176、感病亲本Y3、两亲本间杂交子一代（F1）、抗病池和感病池共5份材料进行PCR扩增，筛选与烟草抗TMV基因N连锁的共显性SSR标记。筛选的结果如图1所示：共显性SSR标记TM508-007和TM508-118分别与烟草TMV抗性基因N连锁，标记TM508-007和TM508-118在感病池与感病亲本中的带型完全一致，仅出现一条220bp（序列如SEQ ID NO.3）和230bp（序列如SEQ ID NO.4）的特异性条带；在抗病池与F1中的带型完全一致，呈现出共显性的两条特异性条带（同时具有抗、感亲本的特异性条带，也即，同时呈现如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列）。其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列长度分别为228bp和190bp，分别是共显性SSR标记TM508-007和TM508-118在含有N基因的抗TMV品种中的特异性PCR扩增条带。

以上结果表明，标记TM508-007和TM508-118分别与烟草抗TMV基因N连锁，且该标记为共显性标记。PCR扩增产物中分别含有如ID NO.1（220bp）和SEQ ID NO.2（190bp）所示序列即为含有烟草抗TMV病的纯合基因NN；PCR扩增产物中分别含有如ID NO.3（220bp）和SEQ ID NO.4（230bp）所示序列即含有其感病的纯合等位基因nn；PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或同时含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列即含有烟草抗TMV病的杂合基因Nn。

实施例2

共显性连锁标记的图距及其在BC1F1群体单株中的验证

一、数据分析

首先，按实施例1所述方法进行烟草基因组DNA提取、纯化，BC1F1群体单株TMV抗性鉴定和SSR标记分析。其次，利用通过BSA法筛选获得的标记TM508-007和TM508-118对BC1F1群体中的123个单株进行基因型分析。最后，对各个单株的带型进行数据统计，抗病杂合条带标记做“H”，感病条带标记做“A”，条带不清晰或者无扩增条带的记做“U”。

二、共显性连锁标记遗传距离的计算

利用JoinMap 4.0软件并结合BC1F1群体单株的TMV抗性鉴定数据，对共显性SSR标记在BC1F1分离群体中的基因型数据进行遗传连锁分析，计算出其连锁距离并绘制连锁图。

BC1F1群体单株TMV抗性鉴定的结果为：123个单株中，感病单株有66个，抗病单株有57个，其中，感病单株编号为1-66，抗病单株编号为67-123。

以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果如图2所示：前66个单株（编号为1-66）仅含有长度为220bp的条带，其序列如SEQ ID NO.3所示，即该66个单株感TMV病，且基因型为nn；后57个单株（编号为67-123）中除一个单株（编号为70）外，其余56个单株中同时含有228bp和220bp两条带，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.1所示的序列（228bp）而抗TMV病，且基因型为Nn。

以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，对123株BC1F1单株基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果如图3所示：前66个单株（编号为1-66）仅含有长度为230bp的条带，其序列如SEQ ID NO.4所示，即该66个单株感TMV病，且基因型为nn；后57个单株（编号为67-123）中除一个单株（编号为69）外，其余56个单株中同时含有190bp和230bp两条带，其序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示，即该56个单株中因含有如SEQ ID NO.2所示的序列（190bp）而抗TMV病，且基因型为Nn。

由上述两个共显性连锁标记对123个BC1F1单株的基因型分析可知：两个标记中均有1个单株（编号分别为70和69）则呈现出单交换，即抗性鉴定的结果为抗性单株，而基因型分析的结果却为感病（仅出现感病基因型的特异条带）。因此，利用Joinmap 4.0 作图软件计算可知，该两个共显性标记TM508-007和TM508-118与烟草TMV抗性基因N的紧密且位于N基因的两侧，其各自与N基因间的遗传距离均约为0.41 cM，如图4所示。

结论：利用上述两个共显性标记既可简便、快捷、稳定地检测烟草TMV抗性基因N存在，又可清晰地鉴定出抗TMV纯合基因型NN、抗TMV杂合基因型Nn及感TMV纯合基因型nn，也可有针对性的、特异性的选择含N基因的后代材料并大大提高选择抗TMV病烟草品种的效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记及其应用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> TM508-007-1

<400> 1

caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60

aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tatatatatg aaatactaac 120

ataaatggtt tttacttctg gaagttctag aaagtgaaaa ttagttcaaa aaagaattgt 180

ttatactgca taagacagga tcagcgacat tgcctttttg cattttgc 228

<210> 2

<211> 190

<212> DNA

<213> TM508-118-1

<400> 2

accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60

aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt 120

tatccctaat tctactatcg gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc 180

ttttcctcgc 190

<210> 3

<211> 220

<212> DNA

<213> TM508-007-2

<400> 3

caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60

aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tgaaatacta acataaatgg 120

tttttacttc tggaagttct agaaagtgaa aattagttca aaaaagaatt gtttatactg 180

cataagacag gatcagcgac attgcctttt tgcattttgc 220

<210> 4

<211> 230

<212> DNA

<213> TM508-118-2

<400> 4

accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60

aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taaataaata aataaataaa taaataaata 120

aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt tatccctaat tctactatcg 180

gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc ttttcctcgc 230

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-007F

<400> 5

caccatggtt tggctttcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-007R

<400> 6

gcaaaatgca aaaaggcaat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-118F

<400> 7

accaacatgg ccaaacctta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-118R

<400> 8

gcgaggaaaa gccagtaaaa 20