一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100‑DLS‑ES及其制备方法与流程

技术特征：

1.一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100-DLS-ES，其特征在于：由E基因，SN基因，PBV2200载体的温控表达原件DLS和E.coli-Pm穿梭载体pPBA1100组成，所得E-15L-SN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

借助15个柔性氨基酸linker采用融合PCR方法实现噬菌体PhiX174的E基因与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN的串联，并构建温控表达载体PBV-ES；以PBV-ES质粒为模板，扩增温控双基因裂解盒DLS-ES，将其插入到E.coli-Pm穿梭载体pPBA1100，构建温控双基因裂解载体pPBA1100-DLS-ES。

2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100-DLS-ES，其特征在于，所述菌影载体为双基因表达载体。

3.如权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100-DLS-ES，其特征在于，PBV220-ES载体的温控双裂解表达盒DLS-ES为PBV220-ES载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列。

4.如权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100-DLS-ES，其特征在于，所述的pPBA1100为载体E.coli-Pm穿梭载体，可同时制备大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌菌影。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种大肠杆菌菌影载体pPBA1100-DLS-ES，其特征在于，所述菌影载体的构建方法包括如下步骤:

1)、以噬菌体PhiX174RF1质粒和金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923的基因组为模板，分别扩增裂解基因E和核酸酶A基因SN，通过15个柔性氨基酸linker采用融合PCR方法实现E与SN基因的串联E-15L-SN，将融合片段E-15L-SN与T载体相连，筛选阳性质粒；

2)、将步骤1)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-ES；

3)、以步骤2)得到的重组质粒pBV220-ES为模板，PCR扩增DLS-ES基因；将DLS-ES片段与T载体相连，筛选阳性质粒；

4)、将步骤3)得到的阳性质粒，亚克隆到E.coli-Pm质粒pPBA1100中，得到重组质粒pPBA1100-DLS-ES；

5)、将步骤4)得到的重组质粒pPBA1100-DLS-ES电转入大肠杆菌电转感受态中，通过升温诱导制备大肠杆菌菌影，菌影冻干保存。

6.权利要求5所述的菌影载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)引物设计与合成

根据GenBank上发表基因序列：E，9626372；SN，685631213，设计引物，通过linker3：G4S将双基因串联，引物序列如下：

2)E，SN和E-15L-SN基因的PCR扩增

以噬菌体Φ174RFI DNA为模板，以E1,E2为上、下游引物，扩增E基因；以E1,E2’为上、下游引物，扩增E-15aalinker。反应条件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存；反应结束后，取5ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；

以金黄色葡萄球菌基因组为模板，以SN1’,SN2为上、下游引物，扩增15aalinker-SN；反应条件94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min；4℃保存；反应结束后，取5ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；

以E-15aalinker和15aalinker-SN为模板，以E1,SN2为上、下游引物，采用降落PCR扩增E-15L-SN基因，反应条件:94℃预变性3min；94℃变性45s,60℃退火90s，每循环降0.5℃，72℃延伸1min，20个循环；再94℃变性45s，55℃退火90s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min；反应结束后，取5ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段；

3)目的基因的鉴定

回收E,SN和E-15L-SN基因，与pMD18-T载体相连，转化筛选阳性重组子提质粒酶切鉴定；阳性重组子送上海生工测序；

4)重组温控表达载体构建

EcoR I和Sal I分别双酶切片段E-15L-SN及PBV220载体，回收目的片段，T4连接酶16℃连接过夜，转化筛选阳性重组子，构建重组表达载体PBV-ES；

5)温控裂解盒的扩增

根据GenBank上λpL/pR-cI857温控启动子序列及pBV220质粒序列设计温控裂解盒上游引物，下游引物即为SN基因下游引物，引物序列如下：

WK-BamHI：5’-CCG GGATCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(BamHI)

SN2：5'-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3'(SalI)

以pBV-ES质粒为模板，以WK-BamHI和SN2为上、下游引物，扩增温控双基因裂解盒DLS-ES；反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃10min；4℃保存；反应结束后，电泳检测后回收目的片段；

6)重组穿梭载体pPBA1100-DLS-ES的构建

BamHI和SalI分别双酶切片段DLS-ES和质粒pPBA1100，回收目的片段，T4连接酶16℃连接过夜，转化筛选阳性重组子，获得重组穿梭载体pPBA1100-DLS-ES；

7)大肠杆菌电转感受态的制备

取一80℃保存的大肠杆菌菌株涂布于LB平板37℃培养24h，挑取单菌落，在5mL LB培养基中37℃,225rpm过夜振荡培养，将此培养液取1mL再接种在100mL新鲜的LB培养基中，1:100，37℃振荡培养至OD介于0.3-0.4之间约2h取出，冰浴30min，10％的灭菌甘油同时置于冰上；

4℃，2500rpm/min离心15min，用30mL冰浴的10％的甘油充分重悬沉淀；

4℃，2500rpm/min离心15min，10％甘油洗涤三次弃上清；最后用1mL冰浴的10％甘油充分重悬沉淀，保持冰浴状态下分装成200ul/份。注意制备的感受态细胞应尽量在当天使用，不宜保存；

8)大肠杆菌菌影的制备

采用电转法将重组穿梭载体pPBA1100-DLS-ES电转入大肠杆菌电转感受态中，通过升温诱导制备大肠杆菌菌影，并以pPBA100，pPBA1100-DLS-E转化大肠杆菌作对照，对其裂解效率做了初步研究和比较，透射电镜观察裂解前后菌体的变化。