本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法。
背景技术：
：(R)‐邻氯扁桃酸是一种重要的手性药物中间体，主要用于合成抗血小板聚集药物氯吡格雷。目前，国内外对于(R)‐邻氯扁桃酸的消费量日益增加，市场需求日益增大。(R)‐邻氯扁桃酸的合成方法主要有不对称合成法和光学异构体拆分法两大类，但以光学异构体拆分法为主，通过拆分外消旋的邻氯扁桃酸来获得。但由于光学异构体拆分法需要的手性拆分剂价格昂贵，且拆分后会得到副产物对映体，原子经济性不高。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，该方法的反应条件温和，并且原料邻氯扁桃腈具有较高的转化率。为达到上述目的，本发明的解决方案是：一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将邻氯扁桃腈溶液流加入转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应8‐12h，停止流加并继续反应1‐4h，得到(R)‐邻氯扁桃酸；其中，上述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。MG腈水解酶是由J2315腈水解酶突变而来的，具体来说是突变了两个氨基酸位点，使得MG腈水解酶对于邻氯扁桃腈的催化活力比J2315腈水解酶更高，同时ee值也更高。MG腈水解酶与J2315腈水解酶的不同已在Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》中报道过。其中，邻氯扁桃腈在流加之前采用溶剂配制成邻氯扁桃腈溶液。溶剂为醇类、酯类、酮类或烷烃类中的一种以上。其中，醇类包括甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇等；酯类包括乙酸乙酯，丁酸甲酯等；酮类包括丙酮等；烷烃类包括正己烷等。邻氯扁桃腈溶液的浓度可以为1‐6M，优选为3‐6M，最优选为5‐6M。在上述的方法中，流加反应的时间为8‐12h，流加之后继续反应的时间为1‐4h，因此，总反应的时间为9‐16h。本发明在整个流加过程(8‐12h)中均采用同一流加速度，该流加速度可以为1‐85gL‐1h‐1，优选为5‐50gL‐1h‐1，进一步优选为8‐16gL‐1h‐1，最优选为10gL-1h-1。在申请号为201510334809.2的中国专利中，造成J2315腈水解酶酶活降低的主要因素是扁桃腈，在本发明由于需要用有机溶剂溶解邻氯扁桃腈，从而将其配制成溶液进行流加，造成有机溶剂对酶的活性也有影响，这是因为在底物流加过程中，反应液中的有机溶剂浓度不断地增加，导致在流加阶段之后再降速继续流加得意义不大。在本发明的优选实施例中，转化pH可以优选为7‐8.5，还可以进一步优选为7.95‐8.10。在本发明的优选实施例中，转化温度可以优选为25‐35℃，还可以进一步优选为30℃。在上述步骤中，转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为7.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。其中，在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏10‐80gL‐1、蛋白胨10‐70gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、NaCl1‐10gL‐1、MgCl21‐5gL‐1、ZnCl21‐5gL‐1。在步骤(1)中，培养的条件为：于37℃，pH＝7.2条件下培养，OD600达到30后采用IPTG进行诱导，之后于30℃，pH7.2继续培养16h。在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度为5‐500gL‐1，可以优选为10‐200gL‐1，还可以更优选为15‐100gL‐1，可以最优选为20‐50gL‐1。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。步骤(2)中还可以添加邻氯扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐30％的甲醇、体积分数为1％‐30％的乙醇、体积分数为1％‐30％的异丙醇、体积分数为1％‐30％的正己烷或其他任何常用有机溶剂中的任意一种或几种。进一步地，步骤(2)中的缓冲液的浓度还可以为20‐200mM，助溶剂的体积分数还可以为5％‐20％。由于采用上述方案，本发明的有益效果是：本发明的方法以邻氯扁桃腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞(用于分泌MG腈水解酶)为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的MG腈水解酶和邻氯扁桃腈的流加工艺相结合来生产(R)‐邻氯扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且能够通过不断控制邻氯扁桃腈的加入量来实现(R)‐邻氯扁桃酸的高浓度积累，使单批次反应(R)‐邻氯扁桃酸积累浓度高达600mM，ee值大于98％，邻氯扁桃腈转化率大于99％，，从而具有良好的工业化应用前景。总之，相对于拆分法，本发明利用邻氯扁桃腈的自消旋特性，通过MG腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈，从而一步法即可获得光学纯的R‐邻氯扁桃酸，因此，是一条极具工业价值的工艺路线。附图说明图1为本发明的静息细胞催化水解邻氯扁桃腈合成(R)‐邻氯扁桃酸反应进程曲线图。具体实施方式本发明公开了一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)、将用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在发酵培养基中进行培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集步骤(1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为7.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液；(3)、将邻氯扁桃腈溶液流加入步骤(2)所得的转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为25‐40℃的条件下反应8‐12h(即流加阶段)，然后停止流加，继续反应1‐4h(即反应阶段)，得到(R)‐邻氯扁桃酸。其中，在步骤(1)中，MG腈水解酶是用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌分泌的。MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突变而来的，BCJ2315腈水解酶来自BurkholderiacenocepaciaJ2315。关于该E.coli工程菌，请详见Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的记载。公众可以联系研究者从而获得该菌株。步骤(1)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量如下(如表1所示)：酵母膏10‐80g/L、蛋白胨10‐70gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、NaCl1‐10gL‐1、MgCl21‐5gL‐1、ZnCl21‐5gL‐1。在步骤(1)中，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基。发酵补料培养基的成分如表2所示。在步骤(2)所得的转化液中，静息细胞的浓度为5‐500gL‐1，可以优选为10‐200gL‐1，还可以更优选为15‐100gL‐1，可以最优选为20‐50gL‐1。催化反应所需的MG腈水解酶是通过静息细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是MG腈水解酶的浓度。而MG腈水解酶的浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内邻氯扁桃腈的转化量越高。理论上随着静息细胞的浓度的提高，流加速度是可以成比例增加的，即流加速度所需静息细胞的浓度等于在60min内能够完全转化60mM邻氯扁桃腈的静息细胞的浓度。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。步骤(2)中除了添加缓冲液外，还可以添加邻氯扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐30％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。该缓冲液的浓度可以为20‐200mM，助溶剂的添加量可以为邻氯扁桃腈溶液体积的5％‐20％，优选为5％‐10％。步骤(3)的原料为邻氯扁桃腈。邻氯扁桃腈被配制成具有一定浓度的溶液，以便实现连续流加。溶剂为醇类、酯类、酮类或烷烃类中的一种以上。其中，醇类包括甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇等；酯类包括乙酸乙酯，丁酸甲酯等；酮类包括丙酮等；烷烃类包括正己烷等。邻氯扁桃腈溶液的浓度可以为1‐6M，优选为3‐6M，最优选为5‐6M。在步骤(3)中，邻氯扁桃腈溶液在流加阶段以恒定的流加速度进行流加。流加速度定义为每小时向每升转化液中流加入的邻氯扁桃腈的质量。本发明在整个流加过程(8‐12h)中均采用恒定的流加速度进行流加。邻氯扁桃腈的流加速度理论值为10gh‐1L‐1(每升转化液每小时流加10g邻氯扁桃腈)，实际操作中由于流加的是溶液，例如流加6M浓度的溶液，则实际流加速度为10mlh‐1L‐1(每升转化液每小时流加10ml6M浓度的邻氯扁桃腈溶液)。若流加的是1M浓度的溶液，则实际流加速度为60mlh‐1L‐1(每升转化液每小时流加10ml1M浓度的邻氯扁桃腈溶液)。整个反应过程中MG腈水解酶的催化效率由于受到邻氯扁桃腈毒性的影响是逐渐降低的，从而导致在每小时中能够转化的邻氯扁桃腈的量是逐渐降低的。邻氯扁桃腈溶液在每小时中流加的物质的量可以认为是在MG腈水解酶的催化效率最高的情况下每小时可以转化的邻氯扁桃腈的量。从整个反应的全局考虑，则只需保证反应结束时邻氯扁桃腈能够达到理论上100％完全转化而不需要考虑反应进程中每个时间节点邻氯扁桃腈是否能够完全转化。静息细胞催化水解邻氯扁桃腈合成(R)‐邻氯扁桃酸反应进程曲线图如图1所示。在步骤(3)中，转化pH还可以为7‐8.5，优选为7.95‐8.10。由于反应过程中(R)‐邻氯扁桃酸不断的生成，反应液的pH是不断下降的，因此需要控制反应液的pH。对转化pH的调节可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液进行。其中，氨水的浓度可以为1M到纯氨水，优选为2‐10M，更优选为4‐8M，最优选为6M。转化温度还可以为25‐35℃，最优选为30℃。转化时pH和温度直接对MG腈水解酶的活力(即MG腈水解酶的催化效率)产生影响。酶的活力在不同的转化温度或者不同的转化pH条件下是不同的。本发明选择的转化温度与转化pH是综合考虑了酶的最佳催化效率的发挥以及酶的催化效率的稳定发挥的基础上设定的。本发明的反应原理如下所示：本发明的测定MG腈水解酶活性的方法和下列实施例中酶活力的单位特定义如下：在pH7.0的50mM的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲体系中，以60mM的邻氯扁桃腈为底物，10mg/ml湿菌体浓度下，30℃下震荡30min，2M盐酸终止反应，HPLC方法检测邻氯扁桃腈转化情况。若邻氯扁桃腈完全转化，则认为该批次细胞酶活力合格，可用于进行后续(R)‐邻氯扁桃酸的制备。针对于邻氯扁桃腈，MG腈水解酶的酶学性质要显著高于已报道的大部分腈水解酶。以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例本实施例公开了一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其包括如下步骤：(1)、取出在‐80℃下保藏的E.coli工程菌菌种，接种于LB琼脂平板，之后于37℃培养过夜；(2)、挑取LB琼脂平板上的单克隆菌落，并将其接种于LB液体培养基中，之后于37℃200rpm培养过夜；(3)、从过夜培养后的LB液体培养基中取适量菌液，接种于LB液体培养基中，于37℃200rpm培养8h，之后接种于发酵培养基(如表1所示)中，于37℃培养至OD600为20，然后加入适量IPTG，降温至30℃继续培养16h，离心收集菌体(取沉淀物)，用pH为8.0的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液洗涤两次，得到静息细胞；在发酵培养的过程中可以视情况添加发酵补料培养基(如表2所示)。发酵补料培养基是为了提高静息细胞的发酵浓度及MG腈水解酶的表达量。(4)、取20g静息细胞加入到1L100mMpH为8.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，然后加入100mL甲醇，搅拌均匀，使静息细胞悬浮在pH为7.0‐9.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，得到转化液；(5)、称取502g邻氯扁桃腈溶于乙醇中并定容至500mL，即配置成浓度约6M的邻氯扁桃腈溶液；(6)、以10gh‐1的流加速度向转化液中流加邻氯扁桃腈溶液，在流加过程中使用6M氨水将pH稳定在7.95‐8.10(即转化pH值为7.95‐8.10)并且保持转化液的温度在30℃(即转化温度为30℃)，同时以400rpm的速度不断搅拌，持续反应10h；(7)、停止向转化液中流加邻氯扁桃腈溶液，其他条件与步骤(6)所述相同，继续反应2h，使总反应时间达到12h，得到(R)‐邻氯扁桃酸。表1发酵培养基的组分含量表组分含量酵母膏10‐80gL‐1蛋白胨10‐70gL‐1甘油1‐500mlL‐1K2HPO424.75gL‐1KH2PO43.47gL‐1NaCl1‐10gL‐1MgCl21‐5gL‐1ZnCl21‐5gL‐1表2发酵补料培养基的组分含量表组分含量酵母膏60gL‐1蛋白胨80gL‐1甘油500ml反应所得到的(R)‐邻氯扁桃酸的浓度如图1所示。经HPLC方法检测可知，本实施例中(R)‐邻氯扁桃酸的生成量达到600mM，ee值大于98％。由此可知，本实施例的制备(R)‐邻氯扁桃酸的方法反应转化率高，单批次产率浓度积累高，生产安全简便，无任何副产物，不污染环境。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3