本发明属于基因功能领域，具体涉及Alb-uPA-teton慢病毒载体，还涉及该载体的制备方法和应用。
背景技术：
：除人和灵长类动物外，人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主，这严重阻碍了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型，但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶(urokinaseplasminogenactivator，uPA)小鼠肝损伤模型，是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠，子代新生死亡率高、筛选难度大，大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。公开号为CN102628063A的中国专利公开了PAlb-uPA慢病毒载体，该载体在小鼠细胞水平能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA，但是经过大量动物原核注射实验验证，由该载体获得转基因小鼠的子代(founder0)未能筛选出携带目的片段的转基因小鼠，即在小鼠体内不能表达目的基因的生物学功效。产生的原因可能如下：(1)构建的携带目的基因的慢病毒质粒，经原位注射到受精卵转入到小鼠体内后发生了溃解，不能完整或者完全重新随机地插入到小鼠基因组中，致使目的片段无法表达；(2)构建的携带目的基因的慢病毒质粒，经小鼠受精卵细胞原位注射，随机方式整合到小鼠基因组中，目的片段排列顺序发生了改变，不能按照原来设计的要求表达目的片段的生物学效能；(3)可能排列顺序并没有发生改变，只是目的片段之间的排列受到基因组空间结构的影响，干扰了目的片段的表达。因此，急需对现有的pAlb-uPA慢病毒载体进行改进，能够获得子代携带目的片段的转基因小鼠，从而制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，提供携带人肝组织的受体小鼠。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有独立建系能力的Alb-uPA-TetOn慢病毒载体；本发明的目的之二在于提供Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的制备方法；本发明的目的之三在于提供Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备转基因小鼠中的应用；本发明的目的之四在于提供制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体含有反向连接的白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，所述白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达，所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达；所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQIDNO.34所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；所述四环素反式激活子rtTA的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示；所述PTight启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示。本发明中，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的白蛋白启动子PAlb和PTight启动子的5’端连接有绝缘子。本发明中，终止尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的终止子为兔β球蛋白PolyA，终止四环素反式激活子rtTA表达的终止子为牛生长激素基因polyA。最优选的，所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示。2、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将克隆尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA、兔β球蛋白PolyA和牛生长激素基因polyA通过SLIC技术连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pTRETight质粒上，得到1969-pTRE-uPA-PA过渡载体；(2)将白蛋白启动子Alb和四环素反式激活子rtTA通过SLIC技术连接到经内切酶AscI酶切的1969-pTRE-uPA-PA过度载体上，得1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb过度载体；(3)将1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb过度载体经Xhol和Sacll酶切后回收5549bp片段，然后将回收产物与带Xhol和Sacll酶切粘性末端的绝缘子连接，即得Alb-uPA-TetOn慢病毒载体。优选的，尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA的克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物进行扩增获得；兔β球蛋白PolyA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示序列为引物进行扩增获得；牛生长激素基因polyA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示序列为引物进行扩增获得；白蛋白启动子Alb克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示序列为引物进行扩增获得；四环素反式激活子rtTA克隆方法如下：以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示序列为引物进行扩增获得。3、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备转基因小鼠中的应用。4、所述Alb-uPA-TetOn慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。本发明的有益效果在于：本发明公开了Alb-uPA-TetOn慢病毒载体，该载体通过在现有PAlb-uPA慢病毒载体上进行改进，将目的片段pAlb与uPA进行反向连接，并在整个目的片段的两端分别加上绝缘子，以阻断因随机插入位点不同引起的相互影响，该载体具有独立建系能力，将Alb-uPA-TetOn慢病毒载体原位注射后慢病毒质粒能正常表达uPA生物学活性，因此能够用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型；对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究具有重要意义。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为1969-pTRE-uPA-PA载体酶切验证结果(图中1、2、3、4分别为挑选出来的四个阳性克隆；DL表示markerDL2000；T表示markerT14)。图2为1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb载体PCR检测图(图中DL表示MarkerDL2000，1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，1-7，1-8，2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，3-1，3-2，3-3，3-4，3-7，3-8，4-2，4-3，4-4，4-7和4-8分别表示不同的阳性单克隆，目的片段530bp)。图3为1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb载体分别用EcoRl、ApaLl和Sacl进行酶切结果(1-4，1-8表示不同菌株质粒，DL表示markerDL2000；T表示markerT14)。图4表示1969-Alb-uPA-teton-final质粒图谱。图5为1969-Alb-uPA-teton-final质粒PCR检测结果(图中DL表示MarkerDL2000，1-1，1-5，1-6，2-2，2-4，2-5，3-1，3-2，3-3，3-4，3-6，3-7，4-2，4-3，4-6表示不同的阳性单克隆)。图6为1969-Alb-uPA-teton-final质粒ApaLl、Sphl和EcoRl酶切结果(DL表示markerDL2000；T表示markerT14，3-1，3-2，3-3和3-4表示不同菌株质粒)。图7为预实验转基因小鼠PCR检测结果(15，17表示阳性转基因鼠，P表示为阳性对照，B6为阴性对照，N为空白；下图为β-actin内参)。图8为预实验转基因小鼠PCR检测结果(21，25，27，28，30，38，39，47，49，50，54和67表示阳性转基因鼠，P表示为阳性对照，B6为阴性对照，N为空白；下图为β-actin内参)。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1、质粒构建1、PrimerSTARPCR扩增相关片段以PAlb-uPA慢病毒载体为模板，表1所示序列为引物对进行PCR扩增克隆尿激酶型纤溶蛋白酶基因uPA、白蛋白启动子Alb(pAlb)、四环素反式激活子(rtTA)、兔β球蛋白PolyA(RabbitbetaglobinPolyA和牛生长激素基因polyA(bGHPA)，其中白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQIDNO.34所示；尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；四环素反式激活子rtTA的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示；PCR反应体系如表2所示，PCR反应条件如表3所示。表1.PCR反应使用的引物表2.PCR反应体系反应成分单个反应加入量(μl)5×Tapbuffer10dNTPMix，2.5mMeach4上游引物1下游引物1模块DNA(50ng/μL)1PrimeSTARDNA聚合酶0.5无核酸酶的水32.5总体积50表3.PCR循环条件将扩增产物进行电泳，回收目的片段，备用。(2)构建1969-pTRE-uPA-PA过渡载体将pTRETight质粒使用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，然后将克隆的uPA、RabbitbetaglobinPolyA、bGHPA通过SLIC技术连接到pTRETight质粒上，连接体系如表4所示。表4.TRE-uPA-PA连接体系反应成份单个反应加入量(μl)PTRE载体7.3UPA7.1Rabbit-globin-PA1SLIC3.6bGHPA1总体量20将连接产物转化至DH5α感受态细胞，并涂布在含有氨苄青霉素(AMP)抗性的LB琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中倒置培养16小时，挑取阳性克隆，然后扩大培养后提取质粒进行用ApaLI、Sac和EcoRI进行酶切鉴定，电泳结果如图1所示。将酶切验证正确的命名为1969-PTRE-uPA-PA。(3)构建1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb过渡载体将构建的1969-PTRE-uPA-PA载体用ASCI内切酶进行酶切37℃过夜，然后利用SLIC技术将rTTA及pAlb到1969-PTRE-uPA-PA载体上，连接成功的载体命名为：1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb，连接体系见表5所示。将连接成功的1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb载体转化DH5α感受态细胞，并涂布在含有氨苄青霉素(AMP)抗性的LB琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中倒置培养16小时，挑取单克隆。表5PTRE-uPA-PA连接体系反应成份单个反应加入量(μl)1969-PTRE-uPA-PA8RTTA2ALB-Promoter2SLIC8总体积20将挑取的单克隆进行扩大培养，然后使用如下引物进行PCR检测：1969Alb-TF1:5’-ggatgctgtaacgcaggtta-3’(SEQIDNO.11)；1969PTRE-TR1:5’-tcactgcattctagttgtgg-3’(SEQIDNO.12)；PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min/kb，循环30次；72℃后延伸5min，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。然后随机选择PCR检测呈阳性的克隆，然后分别用EcoRl、ApaLl和Sacl进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。(4)构建1969-Alb-uPA-teton-final目的载体采用限制性内切酶Xhol和Sall双酶切1969-PTRE-uPA-rTTA-Alb，37℃水浴过夜，得到5549bp及2705bp两条带，回收5549bp片段；同时用相同的Xhol和Sacll双酶切带Xhol和Sacll酶切位点的HS4insulator(GenBank：U78775.2)。将回收的5549bp片段与酶切后的HS4insulator进行连接，将连接正确后载体命名为1969-Alb-uPA-teton-final，其结构如图4所示。将连接成功的1969-Alb-uPA-teton-final载体转化DH5α感受态细胞，并涂布在含有氨苄青霉素(AMP)抗性的LB琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中倒置培养16小时，挑取单克隆。将挑取的单克隆进行扩大培养，然后使用如下引物进行PCR检测：1969Alb-TF1:5’-ggatgctgtaacgcaggtta-3’(SEQIDNO.13)；Insulator-tF1:5’-tccaggacggagtcagtgaggcg-3’(SEQIDNO.14)；PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min/kb；72℃后延伸5min，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。然后随机选择PCR检测呈阳性的克隆，然后分别用ApaLl、Sphl和EcoRl进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。结果表明，目的片段成功连入载体中，成功获得1969-Alb-uPA-teton-final载体。构建载体完成后需进行测序鉴定，测序使用引物如表6所示。表6.测序中使用的相关引物经测序验证正确后用于下一步，其中1969-Alb-uPA-teton-final载体测序显示核苷酸序列如SEQIDNO.26所示，简称为Alb-uPA-TetOn慢病毒载体。该载体白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA反向连接，其中白蛋白启动子PAlb调控四环素反式激活子rtTA表达并由牛生长激素基因polyA终止表达，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA由PTight启动子调控表达并由兔β球蛋白PolyA终止表达，在四环素反式激活子rtTA和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达；白蛋白启动子PAlb上游连接有白蛋白增强子，白蛋白启动子PAlb和PTight启动子的5’端还连接有绝缘子，pAlb与uPA反向链接处分别连有两个可供PCR检测识别片段PA-1(HAtag)和PA-2(Histag)，绝缘子内侧增加双E1/E2标示酶，有利于southernbolt检测uPA的表达。实施例2、动物体内表达检测1、Alb-uPA-teton转基因小鼠培育选用非肥胖糖尿病(NOD/LtJ)小鼠作为实验平台，该鼠繁殖能力较强，建立在该鼠平台上多种免疫缺陷鼠可供后期杂交挑选，为转基因小鼠的深度培育奠定基础。具体选择NOD/ShiLtJNju小鼠(南京大学模型动物研究所)作为培育鼠。2、实施原核注射原核注射分为两步：(1)预实验:将1969-Alb-uPA-teton-final质粒用I-CeuI内切酶进行酶切，电泳分离、回收目的片段sequence(2239-10325)，进行DNA纯化，然后原核注射，子代产17只仔鼠。断奶后，取小鼠尾巴进行PCR扩增和测序鉴定小鼠基因型，获得1只阳性小鼠。(2)正式实验：按预实验方法使用纯化DNA片段进行原核注射，子代产59只仔鼠，存活58只。断奶后，取小鼠尾巴进行PCR扩增和测序鉴定小鼠基因型，获得13只阳性小鼠(首建鼠founder0)。3、Alb-uPA-teton：转基因小鼠(首建鼠founder0代)筛选对预实验中原核注射后，产17只新生子代小鼠进行剪尾巴(5g/只)，收集血液进行mRNA提取、PCR扩增、电泳及测序鉴定，检测引物如表7所示，扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃后延伸2min，最后16℃保存。表7.转基因小鼠PCR检测引物扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。由图可以看出，预实验17只子鼠中，只有15号uPA-seqR1产物778bp和Alb-gtR1产物540bp两个PCR扩增片段为阳性。按照相同的方法检测正式实验转基因小鼠，结果如图8所示。结果表明，正式实验中，58只子鼠中具有uPA-seqR1产物778bp和Alb-gtR1产物540bp两个PCR扩增片段为阳性的有的15#，21#，25#，27#，28#，30#，32#，38#，39#，47#，49#，50#，54#和67#号。P表示阳性对照，B6为阴性对照，N为空白；内参为β-actin。因此选到21#,25#,27#,28#,30#,32#,38#,39#,47#,49#,50#,54#,67#为阳性鼠。上述结果表明，本发明构建的1969-Alb-uPA-teton-final载体能够获得携带目的基因的转基因小鼠，具备独立建系的能力。按照相同的方法适用公开号为CN102628063A的中国专利公开了PAlb-uPA慢病毒载体并不能获得携带目的基因的转基因小鼠，只能在在细胞水平获得表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA的小鼠肝细胞。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院；<120>Alb-uPA-teton慢病毒载体及其制备方法和应用<160>34<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>uPA上游引物<400>1caccgggaccgatccagcctatgaaagtctggcgag36<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>uPA下游引物<400>2tcagaaggccagacctttct20<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>兔β球蛋白PolyA上游引物<400>3agaaaggtctggccttctgagatctttttccctctgccaa40<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>兔β球蛋白PolyA下游引物<400>4agtagtcaggagaggaggaa20<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>bGHPA上游引物<400>5ttcctcctctcctgactacttaagggttccgcaagctcta40<210>6<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>bGHPA下游引物<400>6gatccccgggtaccgagctcccgcggggcgcgccctagagctcgctgatcagcc54<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>rTTA上游引物<400>7ggctgatcagcgagctctagttacccggggagcatgtcaa40<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>rTTA下游引物<400>8atgtctagactggacaagag20<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>Alb上游引物<400>9ctcttgtccagtctagacattttgccagaggctagtgggg40<210>10<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>Alb下游引物<400>10gatccccgggtaccgagctcccgcggtagcttccttagcatgacgt46<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969Alb-TF1<400>11ggatgctgtaacgcaggtta20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969PTRE-TR1<400>12tcactgcattctagttgtgg20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969Alb-TF1<400>13ggatgctgtaacgcaggtta20<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Insulator-tF1<400>14tccaggacggagtcagtgaggcg23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969PTRE-TF1<400>15gagctcgtttagtgaaccgt20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969uPA-seqF1<400>16aattcactgaggtggagaac20<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Rabit-PA-F<400>17agaaaggtctggccttctgagatctttttccctctgccaa40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Rabit-PA-F<400>18ggctgatcagcgagctctagttacccggggagcatgtcaa40<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Rabit-PA-F<400>19agaaaggtctggccttctgagatctttttccctctgccaa40<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Alb-seqF1<400>20agcgagtttccttgtcgtca20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Alb-seqF2<400>21cctctgaacatctgctcaca20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969-Alb-seqF3<400>22tcagcaagcaataccatgac20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969PTRE-TR1#<400>23tcactgcattctagttgtgg20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969Alb-uPA-seqR1<400>24ggtcaaaacagcgtggatgg20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1969Alb-uPA-seqR1<400>25gtagtgtagtctaggaacag20<210>26<211>10761<212>DNA<213>人工序列<220><223>1969-Alb-uPA-teton-final载体序列<400>26gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggttt60cttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttt120tctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaat180aatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttt240ttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatg300ctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaaga360tccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgc420tatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatac480actattctca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