一种人MAP3K7IP2多肽及其抗体制备方法与流程

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

2.

背景技术：

1)MAP3K7IP2功能：先天性心脏病(Congenital heart defects(CHDs))是胎儿期因心脏及大血管发育异常而致的先天畸形，其发病率在活产婴儿中为0.4-1.2％，具体发病原因目前仍不清楚。初步研究发现，病人在第6号染色体q25区上有一个约850kb大小的关键位点缺失，同时揭示这个区域是转化生长因子β激酶1/MAP3K7结合蛋白2(TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2gene(TAB2))的基因所在。MAP3K7IP2抗体是针对TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2蛋白的特异性抗体，此发明对了解该蛋白的含量，功能及在先天性心脏病发生、发展过程中的作用及预防有着及其重要的意义(Am J Hum Genet.2010Jun；11：86(6)：839-49)。

2)MAP3K7IP2抗体产品信息：经检索，市场上有MAP3K7IP2蛋白的多克隆抗体，但是这些抗体的抗原表位跟我公司的抗原表位不同。

3)MAP3K7IP2抗体的应用：初步研究发现，先天性心脏病病人转化生长因子β激酶1/MAP3K7结合蛋白2(TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2gene(TAB2))的基因缺失，可能是致病的原因之一。MAP3K7IP2抗体是针对TGF-beta-activated kinase 1/MAP3K7binding protein 2蛋白的特异性抗体，此发明对研究该蛋白的含量，功能及在先天性心脏病发生、发展过程中的作用，以及今后的预防有着及其重要的意义。

3.

技术实现要素：

本发明提供了一种MAP3K7IP2多肽，其序列为：STRYLYGEGDLNFS。用此多肽制备的抗MAP3K7IP2抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然MAP3K7IP2蛋白。

抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤获得的：

步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对MAP3K7IP2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定MAP3K7IP2蛋白50-63位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为STRYLYGEGDLNFS。

步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将MAP3K7IP2多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤三：多肽免疫和抗血清制备：将交联后的MAP3K7IP2-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。

步骤四：抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用心脏取血，分离抗血清，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。

抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤鉴定的：

步骤一：免疫印迹：将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的天然MAP3K7IP2蛋白相互作用，可用于免疫印迹试验。

步骤二：免疫组化：将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗，采用标准的免疫组化方法，用于检测组织芯片(9种人肿瘤组织)，确认该抗体能够与具有天然结构的MAP3K7IP2蛋白相互作用，可用于免疫组化试验。

4.附图说明

图1为免疫印迹图(Western blot)

图2为免疫组化(IHC)图

图3为免疫组化(IHC)图

5.具体实施方式

1.多肽序列的分析和设计

利用DNAstar软件对MAP3K7IP2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定MAP3K7IP2蛋白50-63位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为STRYLYGEGDLNFS。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为C-STRYLYGEGDLNFS。

2.多肽合成和交联

采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4小时，-70℃冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。

3.多肽免疫和抗血清制备

将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫3周后，将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。第二次免疫3周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶60000以上，采用心脏取血，标准方法获得抗血清。

4.抗体亲和纯化

(1)、TIgG纯化：用移液器将50％的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。

(2)、肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的MAP3K7IP2多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml IgG及3ml PBS，室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm×35min离心除沉淀，收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。

抗MAP3K7IP2抗体是通过以下步骤鉴定的：

1.免疫印迹分析

按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的细胞或者组织裂解液依次加样，恒压80V约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的MAP3K7IP2抗体作为一抗，采用浓度为1μl/ml与上述转膜得到的抗原芯片在室温下杂交1小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。

2.免疫组织化学分析

将4％甲醛溶液固定的人肿瘤组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块，乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟，62℃石蜡浸蜡2小时后，在组织包埋机上将9种人肿瘤组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上，在烤片机60℃烤片1小时，然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法，室温下用100μl 10％羊血清于湿盒中封闭切片30分钟，加入100μl浓度为2-4μg/ml的MAP3K7IP2抗体，湿盒中4℃过夜，PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟，然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液，湿盒中37℃孵育30分钟，洗片后1％DAB显色，苏木素复染，复蓝，脱水，透明，封片，镜检，检查结果并拍照。