一种葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测的专用引物和方法与流程

文档序号:12250097阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测的专用引物,其特征在于,包括引物GFkV23和引物GFkV24;其中,所述引物GFkV23的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述引物GFkV24的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,通过PCR扩增、克隆获得阳性质粒标准品,然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应,作出标准曲线,用于测算出待测样品中的病毒含量。

3.根据权利要求2所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)提取GFkV毒源材料的总RNA,用Oligo(dT)反转录得到cDNA,以该cDNA为模板,以GFkV23和GFkV24为引物进行PCR扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收,连接克隆载体,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选并挑取含阳性克隆的大肠杆菌进行培养,提取质粒得到阳性质粒标准品;

2)阳性质粒标准品分别梯度稀释至108,107,106,105,104copy/μL为模板,以GFkV23和GFkV24为引物进行荧光定量PCR扩增,以Ct值为纵坐标,以质粒拷贝数为横坐标,绘制得到标准曲线;

3)提取待测样品的总RNA,以Oligo(dT)为引物反转录得到cDNA,以该cDNA为模板,按照与步骤2)中完全相同的条件进行荧光定量PCR扩增,所得Ct值代入标准曲线公式得到待测样品中GFkV基因组RNA的含量。

4.根据权利要求3所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,在步骤1)中,所述PCR反应体系为:2×Ex Taq Mix 12.5μL,10μMGFkV23和GFkV24引物各1.0μL,cDNA 2.0μL,双蒸水补足至25μL。

5.根据权利要求3所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,在步骤1)中,所述PCR反应条件为:94℃3min;94℃30s,60℃30s,72℃20s,35cycles;72℃10min。

6.根据权利要求3所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,在步骤2)中,阳性质粒标准品拷贝数与浓度的换算方式按照如下公式:拷贝数=浓度×10-9×6.02×1023/(质粒碱基数×660),其中,拷贝数的单位为copy/μL,浓度的温单位为ng/μL。

7.根据权利要求3所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,在步骤2)中,所述荧光定量PCR反应体系为:2×SYBR Green qPCR Mix10.0μL,10μM GFkV23和GFkV24各1.4μL,模板1.0μL,双蒸水补足至20μL。

8.根据权利要求3所述的葡萄斑点病毒荧光定量PCR检测方法,其特征在于,在步骤2)中,所述荧光定量PCR反应条件为:94℃3min;94℃5s,60℃15s,72℃20s,read,40cycles;65℃to 94℃,0.5℃/10s,read。

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