本发明涉及一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，适用于化妆品原料刺激性的评价，尤其适用于表面活性剂的眼刺激性评价。
背景技术：
：表面活性剂是一种重要的精细化工产品，在国内外被广泛应用，它被誉为“工业味精”，能使溶液表面张力显著下降。表面活性剂广泛应用于化妆品调制、食品加工、农药和医药加工、纺织印染及洗涤剂生产等许多工业领域。表面活性剂用于生产化妆品或洗涤剂时，与消费者眼睛接触的几率大大增加，往往对消费者的眼睛存在一定刺激性甚至腐蚀性。家兔眼刺激试验(Draizetest)是检测化学物眼刺激性的经典方法，近年来，随着实验动物使用3R原则的倡导与实施以及生物医学研究模式的转变，替代动物实验的体外模型研究已经成为毒理学评价的趋势。根据体内眼损伤发生的机理，目前尚在开发的眼刺激替代方法可分为细胞系统、鸡胚、人工角膜和离体器官四类，与其它三类相比，细胞系统标准化程度最高、成本最低而且快速。细胞系统替代内动物实验的原理是基于大多数具有眼刺激作用的物质也具有细胞毒性，因此可根据化学物质对细胞膜损伤和对细胞质内蛋白质大分子破坏的相关性建立体外方法。用于体外测试的细胞包括成纤维细胞、血细胞、犬肾细胞等，目前基于标准化实验动物小鼠肾细胞系统建立的体外方法还未见相关专利和文献报道。技术实现要素：为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，该方法准确性高、快速、简便、成本低、对检测仪器无特殊要求。本发明所提供的利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，是通过检测暴露于受试物后荧光素钠漏出单/多层小鼠肾细胞的荧光素量来评价受试物的刺激性。其中，用于定量评价受试物对小鼠肾细胞损伤的指标为荧光素漏出量，其可用荧光分光光度计(激发光波长485nm，发射光波长530nm)定量测定。本发明的目的通过下述方案实现：一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，包括以下步骤：一、小鼠肾细胞的制备取小鼠肾脏上皮，剪碎，研磨后用培养液冲洗，收集液体，经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞，加1g/L胶原酶I消化培养，37℃消化，每隔5min振荡1次，15min后加等体积含有10％牛胎血清的培养液终止消化，吹打分散细胞后静置5min，1000r/min离心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培养液，置于培养箱培养(37℃、5％CO2)至细胞长满培养皿的85％以上，消化、冻存备用；二、小鼠肾细胞生长培养膜的制备取步骤一中冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞，调节细胞浓度为4×105～10×105个/mL，取0.5mL加入到插入式培养皿中的微孔滤膜表面上培养72～96h(37℃、5％CO2)，待细胞完全融合(细胞铺满整个微孔滤膜表面)后，得到小鼠肾细胞生长培养膜；三、荧光素渗漏试验3.1检测范围确定实验将0.4mL，0.01g/100mL、0.1g/100mL、1g/100mL、10g/100mL、20g/100mL、50g/100mL受试物溶液(受试物用PBS缓冲液稀释，w/v)到步骤二中的插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上，每个受试物浓度设置3孔平行对照，作用5～20min后，用Hank’s液轻轻冲洗细胞生长培养膜至其表面没有受试物；然后再将清洗之后的带有小鼠肾细胞生长培养膜的插入式培养皿放入另一含新鲜的10％牛胎血清的培养液的培养皿中，加入5～20μg/mL的等体积的荧光素钠溶液到插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上，37℃继续培养10～30min，然后用Hank’s液轻轻清洗细胞生长膜至其表面没有受试物，用荧光分光光度计检测含10％牛胎血清的培养液的培养皿中每孔培养基中的荧光素量(激发光波长485nm、发射光波长530nm)；3.2荧光素渗漏试验从范围确定实验的结果得到使荧光素渗漏的效应发生的大概浓度范围，根据上述范围进行合理的间隔，按照几何对数或者最少设置六个浓度梯度，从而得到精确的评估荧光素漏出量的受试物初浓度，并依次确定以下指标：(1)受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的确定；(2)不加受试物的溶剂对照组的荧光素漏出量的确定；(3)无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的确定；(4)受试物浓度-荧光素漏出率标准曲线的确定；(5)使荧光素漏出率为20％时的受试物浓度的确定；(6)接触受试物溶液后使荧光素漏出率为20％时的肾细胞生长培养膜继续培养4h、24h、36h、72h后的荧光素漏出率的确定；3.3荧光素渗漏试验结果分析实验获得反应小鼠肾细胞受损情况相关的三个参数：(1)FL(％)；代表不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比，按以下公式计算不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比：FL(％)＝(m-y)/(z-y)×100m表示受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的平均值，y表示同一块插入式培养皿不加受试物的溶剂对照组的荧光素钠漏出量的平均值，z表示同一块插入式培养皿无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的平均值；(2)D值[mg/100mL]：表示使不同百分比的荧光素漏出的受试物浓度，根据不同受试物浓度值和其相对应的荧光素漏出百分比，统计得出受试物浓度-荧光素漏出百分比标准曲线，然后得出使20％的荧光素漏出的受试物实际浓度，即D20值[mg/100mL]；(3)FL20HY：表示接触受试物后引起20％荧光素漏出的肾细胞生长培养膜在含10％牛胎血清的培养液中继续培养Y小时(4h或24h或36h或72h)后的荧光素漏出百分比在标准曲线上所对应的受试物浓度(mg/100mL)，根据3.2得到的荧光素漏出率为20％时的肾细胞生长培养膜继续培养Y小时后的荧光素漏出率，将其代入受试物浓度-荧光素漏出百分比标准曲线，得出此时对应的受试物浓度，即FL20HY；四、分类和判断根据上述预测模型对受试物眼刺激性及程度做出判断：根据预测模型实验得到的上述3个参数，根据以下分类标准，直接判断受试物的眼刺激性及其程度，(1)当FL(％)＝20时，FL20HY＞15g/100mL，无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜25；(2)当FL(％)＝20时，3g/100mL＜FL20HY≤15g/100mL，中度刺激性，相当于25＜MMAS＜55，(3)当FL(％)＝20时，FL20HY≤3g/100mL，重度刺激性，相当于动物实验MMAS＞55。步骤一中所述的小鼠可为AKR/J小鼠或BALB/c小鼠；步骤一、二、三中所述的培养液均为无酚红低糖含谷氨酰胺DMEM培养液，购自于Gibco公司，胎牛血清购自于Gibco公司；步骤一中所述的胶原酶I用于上皮细胞的分离，来源于市售，如Gibco公司I型胶原酶，Sigma公司的I型胶原酶；步骤二中所述的插入式培养皿孔径为0.4μm，微孔滤膜直径为6.4mm，如美国康宁公司的Millicell插入式细胞培养皿；步骤二中小鼠肾细胞生长培养膜为小鼠肾细胞完全融合得到的无间隙的细胞膜，细胞长满微孔滤膜，培养小鼠肾细胞的培养基不能污染，细胞不能变色，否者不能使用。步骤三中所述的PBS缓冲液含有以下组分：以1L缓冲液计算，氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、无水磷酸氢钾0.2g、无水磷酸氢二钠1.15g、葡萄糖1.8g、剩余为去离子水，该PBS缓冲液pH为7.2～7.4。步骤三中所述的Hank′s液为无酚红含钙镁Hank’s平衡盐溶液，如Gibco公司的Hank′s液；本发明步骤三中所述的检测荧光素量采用荧光分光光度计检测，检测条件为激发光波长485nm，发射光波长530nm；本发明步骤三的3.1中所述受试物作用时间优选为10～15min；本发明步骤三中3.2中继续培养Y小时后的荧光素漏出率的确定是为了判断受试物作用于细胞后，细胞经一定时间的恢复程度或继续损伤程度，优选为继续培养4h。本发明的机理：完全融合紧密连接的小鼠肾细胞膜在荧光素钠作用时，荧光素不会渗漏过细胞。若受试物对细胞无刺激性，细胞膜的整体形态不会改变，细胞与细胞之间紧密连接，荧光素作用时荧光素漏出量很低甚至无荧光素漏出；若受试物对细胞产生刺激作用，细胞受到刺激，细胞收缩，完全融合的细胞膜受到破坏，荧光素作用于受损的细胞膜时根据漏出的荧光素量间接反映细胞膜的破坏程度，从而表征受试物的刺激性大小。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明所用受试材料来源于标准化实验动物小鼠，遗传背景清楚、种群稳定、来源可靠；经小鼠肾上皮消化得到的小鼠肾上皮细胞传代培养稳定，不易分化，为实验的稳定性提供保证；(2)本发明使用的小鼠肾上皮细胞与其他细胞相比融合速度快，容易形成细胞生长培养膜，为试验的稳定性提供保证；(3)本发明建立的实验方法适用于表面活性剂眼刺激性损伤评价，与兔眼动物实验的结果相关性好。附图说明图1为受试物浓度-荧光素漏出百分比的标准曲线图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。实施例1一、实验材料1、实验试剂级仪器牛胎血清(Gibco公司)，实施例中所用培养液均指无酚红低糖含谷氨酰胺的DMEM培养液(Gibco公司)，荧光素钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，插入式细胞培养皿(康宁公司的Millicell插入式细胞培养皿，24孔)，胶原酶I(Gibco公司)，氯化钠，氯化钾，无水磷酸氢钾，无水磷酸氢二钠，葡萄糖，去离子水，荧光分光光度计(上海仪电-分析仪器总厂，970CRT)；2、受试物根据OECD的数据库(参考文献：Eyeirritation.Referencechemicalsdatabank(Secondedition)[1998])，选择5类已知眼刺激性分级的表面活性剂，详见表1。表1受试物列表编号名称1吐温202聚乙烯二醇单月桂酸盐315％SDS4月桂酸钾510％苯扎氯铵二、荧光素漏出实验1、小鼠肾细胞的制备取小鼠肾脏上皮，剪碎，研磨后用培养液充分冲洗，收集液体，经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞，加1g/L胶原酶I消化培养，37℃消化，每隔5min振荡1次，15min后加等体积含有10％牛胎血清的培养液终止消化，吹打分散细胞，后静置5min，1000r/min离心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培养液，置于培养箱培养(37℃、5％CO2)至细胞长满培养皿的85％以上，消化、冻存细胞，备用；2、小鼠肾细胞生长培养膜的制备取步骤一种冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞，调节细胞浓度为4×105个/mL，取0.5mL加入到插入式培养皿中的微孔滤膜表面上培养96h(37℃、5％CO2)，待细胞完全融合(细胞铺满整个微孔滤膜表面)后，得到小鼠肾细胞生长培养膜。3、荧光素渗漏试验(1)根据使荧光素渗漏的效应发生的浓度范围，取0.4mL，浓度分别为20g/100mL、10g/100mL、5g/100mL、1g/100mL、0.1g/100mL受试物溶液(受试物用PBS缓冲液稀释，w/v)，加入到步骤2中的小鼠肾细胞生长培养膜中，每个受试物浓度设置3孔平行对照，作用15min后，用Hank’s液轻轻冲洗细胞生长培养膜至其表面无受试物；(2)将清洗干净的带有小鼠肾细胞生长培养膜的插入式培养皿放入另一含新鲜10％牛胎血清的培养液的培养皿中，加入0.4mL、10μg/mL的荧光素钠溶液到微孔滤膜表面，37℃继续培养30min，用Hank’s液轻轻清洗细胞生长培养膜，至其表面没有受试物，然后用荧光分光光度计检测含新鲜10％牛胎血清的培养液的培养皿中每孔培养基中的荧光素量(激发光波长485nm、发射光波长530nm)；同时，每块插入式培养皿另外设不加受试物的溶剂对照组和无细胞生长培养膜对照组各3孔，以了解受试物对细胞紧密连接的影响；根据所测的培养皿中每孔培养基中的荧光素量，按以下公式计算不同浓度下的荧光素漏出百分比FL(％)值：FL(％)＝(m-y)/(z-y)×100m表示受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的平均值，y表示同一块插入式培养皿不加受试物的溶剂对照组的荧光素钠漏出量的平均值，z表示同一块插入式培养皿无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的平均值；根据不同的受试物浓度D值与其相对应的荧光素漏出百分比，统计得出受试物浓度-荧光素漏出百分比标准曲线，所得曲线图如图1所示；(3)根据受试物浓度-荧光素漏出百分比的标准曲线计算出使荧光素钠漏出百分比为20％时的受试物浓度，然后在此浓度附近继续重复步骤(1)和步骤(2)，直至得到实际荧光素钠漏出百分比为20％，此时对应的受试物浓度即D20，然后将此时的肾细胞生长培养膜连同插入式培养皿置于10％牛胎血清的培养液中继续培养4小时后，再用Hank’s液轻轻清洗细胞生长膜至其表面没有受试物，用荧光分光光度计检测含10％牛胎血清的培养液的培养皿中每孔培养基中的荧光素量(激发光波长485nm、发射光波长530nm)，计算出此时的荧光素钠漏出百分比(FL(％)值)，将其代入浓度-荧光素漏出百分比的标准曲线中，所得的受试物浓度值即FL20H4[mg/100mL]值。4、结果分析使20％荧光素钠漏出的各受试物的实际浓度D值和继续培养4h后的受试物浓度FL20H4值详见表2；表2小鼠肾细胞系统评价方法D值和FL20H4值结果编号名称D20值(mg/100mL)FL20H4(mg/100mL)1吐温2026.825.122聚乙烯二醇单月桂酸盐16.518.21315％SDS0.640.854月桂酸钾2.591.63510％苯扎氯铵0.120.06备注：表2中D值和FL20H4值为3次平均值，D值为接触受试物溶液后使20％荧光素钠漏出的受试物溶液的实际浓度值，FL20H4值为在D20情况下继续培养4h后的荧光素漏出率在标准曲线上相对应的受试物浓度。5、分类和判断根据上述模型对受试物眼刺激性及程度做出判断：根据预测模型实验得到的上述D值(mg/100mL)和FL20H4值(mg/100mL)两个参数，按以下分类标准判断受试物的眼刺激性，将得到的刺激性结果再与参考物质Draizetest已知的等级分类做比较，可得到本发明利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法与Draizetest的方法相关性。分类标准：①当FL(％)＝20时，FL20HY＞15g/100mL，无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜25；②当FL(％)＝20时，3g/100mL＜FL20HY≤15g/100mL，中度刺激性，相当于25＜MMAS＜55，③当FL(％)＝20时，FL20HY≤3g/100mL，重度刺激性，相当于动物实验MMAS＞55；5个已知刺激性分类的参考物质经小鼠肾细胞系统评价试验得出的结果如表3所示：表3已知参考物受试物用小鼠肾细胞系统评价试验刺激分级结果与Draizetest结果比较表编号名称D20值FL20H4MMAS值1吐温20＞10＞1002聚乙烯二醇单月桂酸盐＞10＞103.3315％SDS＜2＜2594月桂酸钾＜2＜238510％苯扎氯铵＜2＜2108从表3中可以看出吐温20、聚乙烯二醇单月桂酸盐为轻或无刺激性，15％SDS、月桂酸钾、10％苯扎氯铵为重度刺激性，与Draizetest结果吐温20、聚乙烯二醇单月桂酸盐为轻或无刺激性，15％SDS、10％苯扎氯铵为重度刺激性，月桂酸钾为中度刺激性比较，结果相关性为80％以上。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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