本发明涉及向日葵茎溃疡病菌的PCR检测，具体涉及一种单粒向日葵种子上向日葵茎溃疡病菌的检测方法和试剂。
背景技术：
向日葵茎溃疡病(Diaporthe helianthi Munt.-Cvetk.,Mihaljc.et M.Petrov)于1980年夏在前南斯拉夫的伏伊伏丁那地区首次被发现，随后扩展到欧美地区。向日葵茎溃疡病在发生初期首先侵染叶片，在叶尖或叶边缘形成棕色或褐色的坏死斑，病斑扩展至中脉后可扩展至叶柄和茎秆。在向日葵茎秆上产生淡褐色斑点，随病情发展迅速扩展为枯黄色至淡褐色大型病斑，病斑逐渐扩展并包围茎秆，导致茎秆上部干枯，易折断，茎秆和叶柄的髓部腐烂坏死。花盘受害后发育不良，不能形成成熟的种子或干枯败育。向日葵茎溃疡病发病严重时可导致整个植株死亡，造成向日葵籽产量和产油量严重下降。该病严重危害可导致向日葵产量降低50％，含油量降低超过25％，损失达1.5吨/公顷，被认为是欧洲向日葵生产的主要限制因素之一。鉴于其严重危害性，我国已将向日葵茎溃疡病菌列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(中华人民共和国农业部公告第862号，2007)，以防止其传入。目前检测向日葵茎溃疡病菌的方法局限于形态学检测和PCR检测等，由于技术缺陷性，难以实现对单粒向日葵种子上向日葵茎溃疡病菌的准确检测鉴定。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速简单、特异性强、灵敏度更高、交叉污染低的单粒种子上向日葵茎溃疡病菌的检测方法和试剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为两步：
第一步为向日葵单粒种子DNA快速提取的方法，具体方法主要包括：冷冻、破碎和提取步骤。将单粒向日葵种子装入2.0ml塑料离心管，再放入直径7mm钢珠1颗，在超低温冰箱冷冻10分钟后，采用组织研磨仪破碎向日葵种子，频率设定为30次/秒，时间1分钟。通过利用DNA提取试剂盒，进行DNA提取。
第二步为一种向日葵茎溃疡病菌的荧光PCR检测试剂，包括引物和探针，其引物和探针的核苷酸序列如下所示：
正向引物DHF：GCTCGACACG CGAAAAGG；
反向引物DHR：CCAGAGATGG TTTGCCTGAA G；
探针DHP：5’-FAM-TGGCTCGTAG TCTCG-MGB-3’，该探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子；扩增目标片段的核苷酸序列为：GCTCGACACG CGAAAAGGCT GGCTCGTAGT CTCGATGCTG ACCCCGGCTC TTCAGGCAAA CCATCTCTGG。
与现有技术相比，本发明的优点在于：该方法简单便捷，无需对向日葵种子进行特殊处理，能够快速高效提取单粒向日葵种子上DNA，满足向日葵种子上向日葵茎溃疡病菌的需求。具有检测速度快、成本低、结果可靠和可大批量处理的优点。向日葵茎溃疡病菌的荧光PCR检测试剂，具有特异的一对引物和灵敏度更高的一条探针，具有快速简单：只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR步骤，即可得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的探针制备、电泳等处理过程；特异性强：采用一对向日葵茎溃疡病菌的特有引物进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；灵敏度更高：由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度，在25μL反应体系中，DNA检测低限是1pg。交叉污染低：整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染。使用该方法和试剂能够对单粒向日葵种子上的向日葵茎溃疡病菌进行快速检测鉴定。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1、单粒向日葵种子DNA的提取
将单粒向日葵种子装入2.0ml塑料离心管，再放入直径7mm钢珠1颗，在超低温冰箱冷冻10分钟后，采用组织研磨仪破碎向日葵种子，频率设定为30次/秒，时间1分钟。将向日葵种子打碎后，经DNA提取试剂盒(购自Tiangen公司)提取DNA，具体操作见试剂盒说明书。
实施例2、检测向日葵茎溃疡病菌的专用引物和探针的设计
通过测定实验室收集向日葵茎溃疡病菌及其近似种β-微管蛋白的基因序列，结合从GenBank调出向日葵茎溃疡病菌及其近似种β-微管蛋白的基因序列，利用DNAMAN6.0.40软件进行比对分析，找出向日葵茎溃疡病菌的保守基因序列，根据引物和探针设计的原则，用软件Primer Express 3.0设计引物和TaqMan-MGB探针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为：
正向引物DHF：GCTCGACACG CGAAAAGG；
反向引物DHR：CCAGAGATGG TTTGCCTGAA G；
探针DHP：5’-FAM-TGGCTCGTAG TCTCG-MGB-3’，该探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
实施例3、实时荧光PCR检测向日葵茎溃疡病菌的特异性试验
具体过程包括以下步骤：
一、样品来源
向日葵茎溃疡病菌纯培养样品、Diaporthe apiculata纯培养样品、Diaporthe arecae纯培养样品、Diaporthe biguttusis纯培养样品、Diaporthe ellipicola纯培养样品、Diaporthe fusicola纯培养样品、Diaporthe hongkongensis纯培养样品、Diaporthe mahothocarpus纯培养样品；
二、样品DNA的提取
对步骤一中的样品经DNA提取试剂盒(购自Tiangen公司)提取DNA，具体操作见试剂盒说明书；
三、特异性检测
以步骤二获得的DNA为模板，即：向日葵茎溃疡病菌DNA、Diaporthe apiculataDNA、Diaporthe arecaeDNA、Diaporthe biguttusisDNA、Diaporthe ellipicolaDNA、Diaporthe fusicolaDNA、Diaporthe hongkongensisDNA、Diaporthe mahothocarpusDNA，水为空白对照，进行实时荧光PCR反应，即在25μL反应体系中加入12.5μLUniversal PCR Master Mix(购自ABI公司)，0.5μL引物DHF(20μmol/L)，0.5μL引物DHR(20μmol/L)，0.25μL探针DHP(20μmol/L)，灭菌双蒸水补至25μL。反应条件为：50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。结果表明所设计的引物和探针有较强的特异性，结果仅能检出向日葵茎溃疡病菌，其它病菌不能检出；
实施例4、实时荧光PCR反应体系的优化
以实施例3中步骤二获得的向日葵茎溃疡病菌的DNA为模板，分别对实时荧光PCR检测体系中的引物浓度和探针浓度进行优化，具体步骤如下：
一、引物浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，将引物终浓度从0.1μM至1.0μM以0.1μM递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当引物终浓度为1.0μM时，ΔRn值达最大、Ct值最小。经过三次重复实验，最后确定1.0μM为引物最佳浓度；
二、探针浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，固定优化后的引物浓度，将探针终浓度从0.1μM至1.0μM以0.1μM递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当探针终浓度为0.5μM时，ΔRn值最大。经三次重复实验，最好确定0.5μM为最佳探针浓度；
三、优化后的实时荧光PCR体系
经步骤一、二优化，确定最优的实时荧光RT-PCR体系为：25μL反应体系中引物DHF和DHR的终浓度为1.0μM、探针DHP终浓度为0.5μM。
实施例5、实时荧光PCR检测向日葵茎溃疡病菌的灵敏度试验
以实施例3中步骤二获得的向日葵茎溃疡病菌的DNA为模板，用核酸蛋白分析仪测OD260及OD280，计算DNA的浓度，并将其稀释为25μL反应体系中，DNA分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg，以实施例3中步骤三获得的最优体系进行实时荧光PCR反应。反应条件按实施例3中步骤三的条件进行。结果表明，实时荧光PCR检测，其检测低限是1pg。
实施例6、接种样品检测
室内培养向日葵幼苗3周后将在PDA平板上培养10d的向日葵茎溃疡病菌菌落用直径4mm打孔器在菌落边缘打出菌饼后，将菌饼接种在幼苗茎上，菌丝面贴向幼苗茎，共接种18个幼苗茎。无菌菌饼接种三个幼苗茎作为对照，25℃温室条件下进行隔离培养。接种30d后按实施例2步骤二对发病幼苗茎提取DNA，以实施例3中步骤三获得的最优体系进行实时荧光PCR反应。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，接种的18株向日葵样品均检出向日葵茎溃疡病菌。
实施例7、单粒向日葵种子上向日葵茎溃疡病菌的检测
采用实施例1方法，对收集的400粒向日葵种子充分混合后，取其中200粒分别提取其单粒种子DNA，采用实施例2中的试剂，根据优化后的实时荧光PCR检测方法进行向日葵茎溃疡病菌检测。取另外200粒种子利用PDA平板进行分离培养，并对分离培养获得真菌进行鉴定。结果表明，采用实时荧光PCR检测方法从200粒种子中检出带有向日葵茎溃疡病菌种子15粒，而采用分离培养法未能检测出向日葵茎溃疡病菌。
序 列 表
<110>宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种单粒向日葵种子上向日葵茎溃疡病菌的检测方法和试剂
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 18
<212>DNA
<213> 人工合成
<220>
<223>向日葵茎溃疡病菌PCR检测的正向引物序列
<400> 1
GCTCGACACG CGAAAAGG 18
<210>2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223>向日葵茎溃疡病菌PCR检测的反向引物序列
<400>2
CCAGAGATGG TTTGCCTGAA G 21
<210>3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223>向日葵茎溃疡病菌PCR检测的探针
<400>3
FAM-TGGCTCGTAG TCTCG-MGB 15
<210>4
<211> 70
<212> DNA
<213> 基因
<220>
<223>向日葵茎溃疡病菌PCR检测扩增的目标片段
<400>3
GCTCGACACG CGAAAAGGCT GGCTCGTAGT CTCGATGCTG 40
ACCCCGGCTC TTCAGGCAAA CCATCTCTGG 70