一种单细胞基因表达定量分析的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种单细胞基因表达定量分析的方法。

背景技术：

传统的基因表达分析方法如qPCR、Microarray、RNA-seq等，通常以群体细胞为研究对象。这类分析的结果，忽视了群体细胞中的异质性。世界上没有两个完全一样的细胞，而单个细胞是生命体基因组调控的根本单元。近几年，单细胞水平的基因表达分析技术，成为了世界范围的研究热点。这项技术正对生命科学的研究和重大疾病的诊断，产生着革命性的影响，改变着基础和临床试验的基本方式和思路。

然而，现有的单细胞分析技术，如单细胞RNA-seq等，需要复杂的技术流程，和昂贵的仪器设备。市场上常见的单细胞qPCR试剂，通常只能分析单个基因在单个细胞中的表达，细胞被分析后便不复存在。

技术实现要素：

为此，我们研发了一套简单、实用、灵敏的高通量单细胞基因表达定量分析系统(SSA体系)。能够一步扩增单细胞转录组中的多达500个特定基因位点。扩增后的产物可用任何荧光定量PCR系统，对已扩增的基因位点进行qPCR定量分析。

具体来说，本发明采用了以下技术方案：

一种单细胞基因表达定量分析的方法，其特征在于，所述方法包括：在反应容器中加入单细胞，裂解该单细胞，在反应容器中加入反应体系，执行多位点RT，以该多位点RT获得的cDNA为模板执行多位点PCR扩增，最后以多位点PCR扩增获得的序列为底物，加入特异性引物执行特异性定量PCR来分析该单细胞中特定基因的表达量，其中在反应容器中加入的反应体系包括反应混合物、引物池、逆转录酶/聚合酶及无核酸酶去离子水，引物池中包含至多500对的多对引物，其中所述反应混合物包括缓冲体系、dNTP和特异性增强因子。

其中优选地，执行多位点RT与执行多位点PCR所用的反应体系为向反应容器中加入的同一套反应体系，并且该两个反应是在一个步骤中同时执行。

反应中的关键组分反应混合物包括以下成分或者是由以下成分组成：50-100mM Tris-HCl pH8.5，10-50mM KCl，10-50mM(NH₄)₂SO₄，2-5mM MgCl₂，适量dNTP和特异性增强因子。优选地，所述反应混合物中的缓冲体系包括：50-100mM Tris-HCl pH8.5，10-50mM KCl，10-50mM(NH₄)₂SO₄，2-5mM MgCl₂，浓度以终反应体积计。

反应混合物中包含的特异性增强因子是针对RT-PCR、pre-PCR检测特别优化的复合型PCR添加剂，有效提高了检测的灵敏度和均一性。该特异性增强因子是由以下成分组成：0.2-0.4M海藻糖+0-0.2M甜菜碱+1％-3％甘油+0-20mM山梨醇+0-50mM精氨酸，浓度以终反应体积计。在更优选的情况下，所述反应混合物中的特异性增强因子是由以下成分组成：1％-3％甘油+0.2-0.4M海藻糖+0-25mM精氨酸，浓度以终反应体积计。

进一步，反应体系中每一个引物的浓度为0.1μM，反应的过程为50℃60min、95℃3min，然后执行20个循环，每个循环为95℃15sec、60℃15min。

在上述方法中，单细胞的裂解优选是在加入反应体系后封口冷冻裂解，然后离心以释放细胞内容物。

进一步，冷冻裂解条件为在反应容器中加入反应体系后加入单细胞，封口，置于-80℃下5分钟，然后3000rpm离心2分钟。

本发明巧妙地利用了SSA反应体系实现了单细胞的裂解和多达500个基因位点的一步法预扩增。在获得充足扩增产物后，便可对多达500个基因进行单独的qPCR定量分析。该方法能够有效的获取单个细胞中的大量基因表达及基因突变信息，实现普通RT-qPCR无法实现的高通量和高灵敏度。

采用本发明的方案具有如下优点：

1、操作步骤简单，重复性好；

2、灵敏度高；

3、分析通量高，最多可达500个基因；

4、分析成本低；

5、兼容各类下游分析系统，无昂贵平台要求；

6、应用广泛，适用于1-10000个细胞的样品或10pg-100ng RNA的样品。

附图说明

图1为本发明的方案的技术原理图；

图2为本发明方案的技术路线图；

图3至6是优化前后qPCR检测的扩增曲线；

图7是验证实验的热图结果；

图8是小鼠胚胎干细胞和小鼠成纤维细胞的单细胞表达水平的检测结果的热图。

具体实施方式

本发明的技术原理如图1和2所示。参见图1和图2，本发明巧妙地利用了SSA反应体系实现了单细胞的裂解和多达500个基因位点的一步法预扩增。在获得充足扩增产物后，便可对多达500个基因进行单独的qPCR定量分析。该方法能够有效的获取单个细胞中的大量基因表达及基因突变信息，实现普通RT-qPCR无法实现的高通量和高灵敏度。

在一个示例性实施方案中，采用本发明的方案的具体实验步骤如下：

1、0.1μM分析引物池准备

混合1μL所有准备分析的100μM的引物(至多混合500对，共1000个引物)后用不含核酸酶的水补齐至1mL(此时每个引物的终浓度为0.1μM)。

2、预扩增

1)配制RT-PreAmp Master Mix(SSA体系)

2)加样、预扩增反应

取5μL RT-PreAmp Master Mix到8连管或96孔板的每一孔中。利用口吸管或流式分选仪向每孔中加入单细胞样品，立即用8连管盖或封口膜封口并置于-80℃5分钟，取出后3000rpm离心2min，确保封口紧密后立即置于PCR仪上进行如下反应：

3、样品稀释

预扩增反应结束之后，每个样品加入20μL无核酸酶水(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

4、qPCR分析(96孔qPCR仪)

混匀，3000rpm离心2min，立即进行如下反应：

(扩增产物也可用384孔板qPCR仪，或Fluidigm Biomark进行分析)

下面进一步结合具体实施例来对本发明的方案进行更详细的说明。应了解，虽然以下给出了具体实施例，并且各实施例中对反应条件、各相关参数给出了具体的数值或参数，但是业内相关技术人员应该了解的是，所给出的数值和参数仅仅是作为用来对本发明具体说明的示例，而不应理解为对本发明的具体限制，因此不应对本发明的保护范围造成限制，本发明的保护范围只受权利要求书限定。

实施例1.多位点逆转录、预扩增条件优化(2×反应混合物优化)特异性增强因子筛选和组合

常见的RT、pre-PCR反应体系可以分步实现逆转录和预扩增过程，但是不能实现一步法从细胞到dsDNA的过程，更加不能保证反应的灵敏度与均一性。而本发明中的SSA体系不仅克服了传统工艺的复杂步骤，实现了一步法反应即可得到目的ds DNA；而且在原有基础上了提高了反应均一性，可以实现同时扩增1-10000个细胞或10pg-100ng RNA样品的500个基因。

(1)检测灵敏度的优化

2×反应混合物包含：100-200mM Tris-HCl(pH8.5)，20-100mM KCl，20-100mM(NH₄)₂SO₄，0.4mM dNTP，4-10mM MgCl₂和特异性增强因子。根据文献报道，海藻糖能够提高酶的热稳定性，提高产量，同时促进高GC片段的扩增；甜菜碱能够降低DNA的Tm值，提高PCR扩增效率和特异性；甘油能增加酶的热稳定性，提高产量，减少非特异性扩增。另外，有科学家发现山梨醇和精氨酸在维持蛋白结构稳定性方面具有良好的作用，为了提高反应的灵敏度和均一性，本发明率先在PCR反应中测试山梨醇和精氨酸两种物质，并且发现其可以显著提高PCR的反应性。

海藻糖测试浓度范围为：0-0.8M；甜菜碱的测试浓度范围为：0-0.4M；甘油测试的浓度范围为：0-6％；山梨醇测试的浓度范围为：0-40mM；精氨酸测试的浓度范围为：0-100mM。本发明对以上5种不同浓度梯度的添加剂进行正交，配制成324种2×反应混合物。

96对与小鼠早期胚胎发育相关的引物被用来制作0.1μM引物池：100μM的每个引物各取1μL混在一起，共192μL，后补808μL无核酸酶水至1mL(每个引物的终浓度为0.1μM)。

0.01pg/μl的小鼠杂交瘤细胞RNA被用作扩增模板。按以下体系配制RT-PreAmp Master Mix，并加入1μL RNA样品。

将加好样的8连管置于PCR仪上进行如下反应：

预扩增反应结束之后，每个样品加入20μL无核酸酶水(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min，取5ul加入45ul DDW进一步稀释(1:10稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

qPCR分析(384孔qPCR仪)

混匀，3000rpm离心2min，立即进行如下反应。

qPCR反应结束后分析比较324种2×反应混合物的Ct值和溶解曲线，获得了4组灵敏度和特异性俱佳的组合，分别为：0-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-20mM山梨醇，2％-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-50mM精氨酸，0.2-0.8M海藻糖+0.2-0.4M甜菜碱+50-100mM精氨酸，0.4-0.8M海藻糖+20-40mM山梨醇+0-0.2M甜菜碱。

(2)检测均一度的优化

在保证检测灵敏度的同时，本发明在检测均一性上也有很好的表现，根据上述灵敏度优化的结果，选择灵敏度和特异性较好的4种2×反应混合物进行检测均一度的比较和优化。

96对与小鼠早期胚胎发育相关的引物被用来制作0.1μM引物池：100μM的每个引物各取1μL混在一起，共192μL，后补808μL无核酸酶水至1mL(每个引物的终浓度为0.1μM)。

100pg的小鼠胚胎成纤维细胞RNA被用来做1：10的逐级稀释，最后稀释到0.01pg RNA。每份稀释的RNA取1μL并混合5μL RT-PreAmp Master Mix。

配制RT-PreAmp Master Mix

将加好样的8连管置于PCR仪上进行如下反应：

预扩增反应结束之后，每个样品加入20μL无核酸酶水(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min取5ul加入45ul DDW进一步稀释(1:10稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

qPCR分析(96孔qPCR仪)

混匀，3000rpm离心2min，立即进行如下反应。

图3-6所示为2％-6％甘油+0.4-0.8M海藻糖+0-50mM精氨酸的扩增曲线，具有较好的均一度，扩增效率在0.9-1.1之间。

实施例2.RNA稀释实验验证SSA体系的灵敏性。

96对与小鼠早期胚胎发育相关的引物被用来制作0.1μM引物池：100μM的每个引物各取1μL混在一起，共192μL，后补808μL无核酸酶水至1mL(每个引物的终浓度为0.1μM)。

8ng/μl的小鼠胚胎成纤维细胞RNA被用来做1：4的逐级稀释，最后稀释到0.03pgRNA。每份稀释的RNA取1μL并混合9μL RT-PreAmp Master Mix(SSA体系)。

配制RT-PreAmp Master Mix(SSA体系)

将加好样的8连管置于PCR仪上进行如下反应：

预扩增反应结束之后，每个样品加入40μL无核酸酶水(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

qPCR分析(96孔qPCR仪)

混匀，3000rpm离心2min，立即进行如下反应。

实验结果参见如图7所示的热图，该热图示出了Log2基因表达量(背景Ct＝35减去特定基因的检测Ct值)。

这一结果表明：本发明的SSA基因表达定量分析系统有极高的灵敏性，能够检测到少于1pg的RNA样品，而且具有较好的动态量程。

实施例3.利用SSA体系检测小鼠胚胎干细胞和小鼠成纤维细胞的单细胞表达水平。

1、准备引物池

96对与小鼠早期胚胎发育相关的引物被用来制作0.1μM引物池：100μM的每个引物各取1μL混在一起，共192μL，后补808μL无核酸酶水至1mL(每个引物的终浓度为0.1μM)。

2、预扩增

1)配制RT-PreAmp Master Mix(SSA体系)

2)加样、预扩增反应

取5μL RT-PreAmp Master Mix到8连管的每一孔中。利用口吸管加入小鼠胚胎干细胞或小鼠胚胎成纤维细胞的单细胞样品，立即封口并置于-80℃2分钟，取出后离心1min，并立即置于PCR仪上进行如下反应：

3、样品稀释

预扩增反应结束之后，每个样品加入20μL无核酸酶水(1:5稀释)，涡旋混匀，3000rpm离心2min。

4、qPCR分析(96孔qPCR仪)

混匀，3000rpm离心2min，立即进行如下反应：

实验结果参见图8所示的热图，该热图示出了Log2基因表达量(背景Ct＝35减去特定基因的检测Ct值)，及小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的单细胞表达谱分析。

以上结果表明，本发明的SSA单细胞基因表达定量分析系统，不仅能够从单细胞水平上区分小鼠的胚胎干细胞和小鼠的成纤维细胞，还能够发现这两类细胞中的异质性，如Nanog在胚胎干细胞中的异质性表达。

上面结合附图和具体实例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。