本发明涉及基因工程及肿瘤学领域，具体涉及一种筛选肾癌血清/血浆外泌体miRNA标志物的方法及miRNA标志物。
背景技术：
肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，全称为肾细胞癌，又称肾腺癌，简称为肾癌。包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞癌亚型，但不包括来源于肾间质的肿瘤和肾盂肿瘤。肾癌约占成人恶性肿瘤的2％～3％，占成人肾脏恶性肿瘤的80％～90％。世界范围内各国或各地区的发病率各不相同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市地区高于农村地区，男性多于女性，男女患者比例约为2∶1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50～70岁。据全国肿瘤防治研究办公室和卫生部卫生统计信息中心统计我国试点市、县肿瘤发病及死亡资料显示我国肾癌发病率呈逐年上升趋势，至2008年已经成为我国男性恶性肿瘤发病率第10位。
外泌体是由细胞膜内陷后通过一系列复杂的机制形成多囊泡小体(MVB)，然后MVB与细胞膜融合，释放外泌体至细胞外。这些外泌体的大小为30-100nm，内含蛋白质、核酸以及脂类物质，外泌体可以作为这些物质的运输及存储工具，存在于很多体液中，包括血液、尿液、唾液及腹水等，被靶细胞内呑后其内容物通过多种机制发挥功能。外泌体在肿瘤中具有强大的作用。外泌体是由脂质双分子层结构包裹而成的微囊泡，相对于游离的RNA而言，血液循环中存在于外泌体中的等功能性的RNA由于有了外泌体外衣的保护，可避免迅速被降解从而保持稳定性，进而更为有效地发挥远距离信号传递功能，为肿瘤远处转移提供条件。
MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化上高度保守，数量约占基因组的1％，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋白质编码基因的表达：通过与其靶基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降解或抑制其翻译。人类基因组约30％的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还涉及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
目前已有研究证实外泌体中存在多种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，有可能会成为一种潜在的早期诊断和监测预后的新标志。但是，由于外泌体miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前外泌体miRNA在肿瘤临床检测中亟待解决的问题。然而，目前还没有用于肾癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出肾癌异常表达的外泌体miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国肾癌的诊断现状必将是一次有力的推动。
技术实现要素：
为了解决现有技术中对于肾癌的诊断仍然需要组织学检查，给患者造成痛苦并且不能及早诊断的缺陷，本发明提供了一种筛选肾癌外泌体miRNA标志物的方法。基于这种方法，本发明提供了一种肾癌外泌体miRNA标志物及其检测试剂盒。
本发明提供的筛选肾癌外泌体miRNA标志物的方法，包括以下步骤：
S1血浆外泌体分离后，外泌体的miRNA测序分析，具体分析包括序列比对、全基因组Reads分布图谱，miRNA分类与注释、miRNA表达量分析、新miRNA预测、样品(组)间miRNA表达差异分析和聚类分析、差异表达miRNA靶基因预测、差异miRNA靶基因的KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，最后对样品间相关性分析；筛选出综合分析结果最优的1种或多种miRNAs作为候选miRNAs；
S2高质量提取不同级别肾癌血浆的外泌体总RNA，利用吉玛公的Hairpin-itTM MicroRNA定量分析试剂盒定量检测差异表达miRNA在血浆的表达量。筛选miR-424-5p跟肾癌病理分型密切相关。
S3根据miR-424-5p在肾癌患者血中的表达情况，采用卡方检验方法分析miR-424-5p表达水平与肾癌患者各临床指标的相关性，包括年龄、肿瘤浸润深度、肿瘤大小、肿瘤分化、TNM分期、Fuhrman分级及患者生存率。采用单因素、多因素COX回归分析法和Kaplan-Meier生存曲线检验miRNA表达水平与患者生存率之间的相关性。统计分析由SPSS软件完成。统计学差异P值小于0.05设为有显著性差异。
本发明提供的一种肾癌血浆外泌体miRNA标志物，其为miR-424-5p。
本发明的创新在于确定了血浆外泌体miRNA可作为诊断标志物，而且是无创的，可以用于未来的临床诊断。
本发明还提供了上述肾癌血浆外泌体miRNA标志物在制备肾癌诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种肾癌诊断试剂盒，其包括miR-424-5p检测引物探针、PCR逆转录试剂和PCR荧光定量试剂。探针序列的5’端需标记荧光基团，3’端需标记淬灭基团，以适合进行TaqMan probe-based qRT-PCR方法检测。
本发明提供的试剂盒，使肾癌的临床诊断简便快捷、诊断结果可靠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
筛选肾癌外泌体miRNA标志物
(1)血浆的分离
EDTA管收集血液样本：a)将全血静置30min(全血离体后的总时间不得超过4h，且要4℃保存)；b)于4℃离心机中1600*g离心10min；c)离心后，取上层血浆于新的EP管中(不可取到中间层)，16000*g离心10min；d)离心后，取上层血浆于新的EP管中(不可取到下层白细胞)。
(2)血浆外泌体分离
分离到的血浆超高速离心法分离外泌体，透射电子显微镜观察所获外泌体的形态；主要方法：100,000g离心2h，弃上清，1×PBS重悬，4℃，100,000g离心2h，弃上清，100μl 1×PBS重悬，取适量用于透射电镜检测外泌体形态，剩余用于RNA提取。
(3)外泌体的miRNA测序分析
a)取上述离心得到的外泌体，各加1ml TRizol，反复吹打数次移至新的EP管，做好标记，24小时内干冰条件下运输至测序公司；b)样品RNA的提取及质量检测由测序公司进行；c)样品质检合格后，利用测序建库用的试剂盒构建外泌体小RNA测序文库，基于illumina技术测序平台，进行单端测序，获得满测序数据。d)测序完成，进行生物信息学分析，具体分析包括序列比对、全基因组Reads分布图谱，miRNA分类与注释、miRNA表达量分析、新miRNA预测、样品(组)间miRNA表达差异分析和聚类分析、差异表达miRNA靶基因预测、差异miRNA靶基因的KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，最后对样品间相关性分析。
(4)实时荧光定量PCR
高质量提取不同级别肾癌血浆的外泌体总RNA，利用吉玛公的Hairpin-itTM MicroRNA定量分析试剂盒定量检测差异表达miRNA在血浆的表达量。按照试剂盒说明书来操作，以管家基因小RNA U6为内参，用ΔΔCT法来计算和分析。在46例肾癌患者中发现，miR-424-5p在肾癌患者血浆中的表达miR-424-5p表达越高，肿瘤恶性程度越高。
实施例2
人肾癌诊断用试剂盒
上述实施例表明，miR-424-5p对肾癌检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此，可基于miR-424-5p制作用于人肾癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括miR-424-5p引物、探针；引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，该试剂盒中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。反应体系包括：0.25uL 20*miRNA检测探针、2.5uL 2*Master Mix、1.25uL双蒸水、1uL稀释后的cDNA,共5uL,每个miRNA检测实施3平行。使用ABI Prism 7500荧光定量PCR仪检测，其反应条件：95°C10分钟、95°C15秒、60°C1分钟，以上阶段进行40个循环。
进一步地，miR-424-5p的序列为cagcagcaauucauguuuugaa。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。