本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种重组弱毒肠炎沙门氏菌。
技术背景
传染性法氏囊病(Infection bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。发病率高，病程短。该病主要侵害3-12周龄的雏鸡与青年鸡，破坏法氏囊的B淋巴细胞，导致不同程度的免疫抑制，并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败，从而使病鸡增加对并发和继发性病毒和细菌感染的易感性，是近几年来严重威胁我国养鸡业的重要传染病之一。
目前，在IBD的防制中，主要使用传统活疫苗和灭活疫苗。传统的灭活疫苗经历了一个由弱毒疫苗向强毒疫苗、由单一毒株疫苗向多毒株疫苗发展的过程。采用中毒力或强毒力毒株研制疫苗尽管可以提高鸡体的IBD抗体滴度，但易损伤靶器官法氏囊组织导致免疫机能低下、免疫抑制，进而对其它疫病的易感性增高或对其它疫苗的免疫应答能力降低，易继发其它疫病；多毒株疫苗，从理论上忽略了Ⅰ型疫苗毒对同是Ⅰ型的超强毒及变异株的交叉保护作用，忽略了不同毒株同时在相同靶细胞中增殖时发生重组的可能性，忽略了由此产生的对生态安全的危害，疫苗的研发中应该避开这些误区。灭活疫苗多由鸡胚或细胞适应毒制备，成本较高，制约了它的使用。因此发展广谱、高效、实用的新型疫苗成为迫切需要。
在新型疫苗的研究使用中，发现直接应用克隆表达的抗原蛋白作为疫苗的免疫保护效果还不理想。这是因为新型疫苗中的可溶性抗原往往免疫原性较弱，无法激起有效地粘膜免疫。解决这一问题最成功的策略是使用疫苗载体来运送抗原到达粘膜表面，而在疫苗载体中，沙门氏菌凭借自身的优势获得了广泛的研究和应用。但目前存在着缺少稳定的沙门氏菌弱毒株，不能稳定表达外源蛋白，从而引起有效的免疫反应等问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种弱毒肠炎沙门氏菌，以及用该弱毒肠炎沙门氏菌作为宿主所构建的重组肠炎沙门氏菌弱毒株，可用于制备疫苗。
本发明首先提供一种弱毒肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)rSD株，于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCC NO.13346。
本发明所提供的弱毒肠炎沙门氏菌用于制备重组疫苗株；
所述的重组疫苗株，是将外源的免疫抗原基因转入到上述的弱毒肠炎沙门氏菌中制备的；
作为本发明实施例的优选，所述的免疫抗原基因为IBDV的VP2基因；
本发明另一个方面提供一种重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株，其基因组中包含IBDV的VP2基因。
上述的重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株命名为肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)△VP2(salmonella)株，于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC NO.13251。
本发明提供的重组沙门氏菌活载体疫苗菌株可用于制备疫苗。
本发明提供的弱毒肠炎沙门氏菌作为宿主所构建的重组疫苗株遗传稳定性好，在普通培养基连续传代20代，插入的外源基因没有发生任何突变；重组菌不含任何抗性，这符合现代细菌活疫苗的发展趋势，安全性好，不用考虑抗生素残留。重组菌生长繁殖性能良好，没有因为外源基因的插入而影响细菌的增殖。
附图说明
图1野生菌株SD株、弱毒菌株rSD株与重组菌株△VP2(salmonella)的生长曲线图。
具体实施方式
本发明筛选获得了肠炎沙门氏菌弱毒株，用该弱毒株来构建弱毒沙门氏菌疫苗株，构建的重组弱毒沙门氏菌疫苗株不仅毒力弱，安全性好，而且稳定，表达效率高，诱导产生的抗体可有效地提供免疫保护作用；从而促成了本发明。
实施例1、肠炎沙门氏菌弱毒株的筛选
申请人将从临床分离的疑似沙门氏菌进行生化试验、血清学试验和测序鉴定后，确定为肠炎沙门氏菌，命名为SD株。在经过传代筛选后获得了肠炎沙门氏菌重组菌株rSD株。通过生长曲线的测定发现基因缺失后没有影响细菌的生长速度，通过雏鸡攻毒试验等确定其为弱毒株。将rSD株作为母本菌株进行下一步的研究。
本发明的弱毒肠炎沙门氏菌rSD株，于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCC NO.13346。
实施例2、VP2基因转移载体的构建
根据质粒pkD3中Cat基因的序列和克隆载体pBluescript KS(+/-)的多克隆酶切位点，利用Primer 5.0软件设计Cat基因的特异性引物：上游引物pKD3-II P1:CACGGATCCgtgtaggctggagctgcttc加入了BamH I酶切位点；下游引物pKD3-II P2:CAGGAATTCcatatgaatatcctccttag加入了EcoR I酶切位点。以质粒pkD3为模板进行PCR扩增，并用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因。回收的目的基因片段与载体pBluescript KS(+/-)一起进行双酶切反应，核酸电泳，用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因后，用T4DNA连接酶进行连接获得重组质粒。将该重组质粒转入大肠杆菌JM109，测序鉴定，并命名为pBlu-pKD3。
PCR扩增VP2基因，上游引物：VP2-P1：CAGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC加入了EcoR I酶切位点，下游引物：VP2-P2：GACAAGCTTTTACCTTATGGCCCGGAT加入了HindⅢ酶切位点。回收目的基因，与质粒pBlu-pKD3一起进行双酶切反应，1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因后，用T4DNA连接酶进行连接获得重组质粒。将该重组质粒转入大肠杆菌JM109，测序鉴定，并命名为pBKV。
实施例3、打靶片段的制备
用于同源重组的引物由两部分组成，5'端大写的50nt的序列与靶基因两翼序列同源，3'端小写的20nt的序列与转移载体cat抗性基因或目的基因两侧序列同源。上游引物：VP2-D1：AGTGGACTAACAACATCGGTGATGCCAACACCATCGGCACCCGTCCGGACgtgtaggctggagctgcttc；下游引物：VP2-D2：CAGAGCAAAAAACCCCGCGACGCGGGGTTTTTTATCAGACGGAAACTTAAttaccttatggcccggat。以重组质粒pBKV为模板，PCR扩增打靶片段，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带，回收产物用Dpn I消化处理。1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，测定DNA浓度。
实施例4、感受态细胞的制备
将质粒pKD46转化至氯化钙法制备的弱毒沙门氏菌感受态中，于氨苄青霉素平板上30℃培养过夜，挑取单个菌落接种于含氨苄的LB培养基30℃震荡培养过夜。取400ul培养物接种10mL含Amp的LB培养基，220rpm振荡培养至OD600＝0.6，冰浴10min，4℃、4000rpm离心10min收集细菌，沉淀用冰浴预冷的10％甘油洗3遍，用40uL预冷的10％甘油重悬，即为感受态细胞。
实施例5、电击转化及抗性基因的消除
取2uL打靶片段(约100ng)与40uL感受态细胞混合，转入1mm的BioRad电极杯，冰浴2min，在2KV的参数下电击5ms，立即加入1mL普通LB培养基，转入15mL试管，120rpm 37℃振荡培养3h，取200uL涂布于含氯霉素(Cm)的LB平板上37℃培养过夜，筛选CmR转化子。挑取单克隆43℃培养，进行Amp抗生素试验筛选辅助质粒pKD46丢失株，获得只有氯霉素抗性的突变株，命名为△V P2：Cat(salmonella)。
将质粒pCP20电转至△V P2：Cat(salmonella)，取200ul涂布于含Amp和Cm双抗性的LB平板，30℃培养筛选阳性转化子。挑取单个克隆43℃培养，筛选无抗性的重组菌，命名为△V P2(Salm onella)。
实施例6、生长曲线的测定
挑取野生菌株SD株、母本菌株rSD株及重组菌株的单个菌落分别接种于液体LB培养基，在37℃恒温摇床中振荡培养过夜。将细菌悬液用10mL液体LB调节OD600＝0.1，37℃220rpm振荡培养，每隔1h测定菌液的OD600，连续测定8h，绘制细菌的生长曲线。
结果显示，野生菌株、重组菌株与母本菌株的生长速度无明显差异，证明对野生菌株进行基因改造、在减毒沙门氏菌基因组中插入VP2基因没有影响细菌的生长(图1)。
实施例7、体外稳定性试验
挑取弱毒菌rSD株和重组菌△V P2(salmonella)株的单个克隆分别接种于15mL试管，于37℃振荡培养12h，将上述培养物再按1:1000的量接种于普通LB液体中培养12h，如此连续传代20次。取400ul连续传20代后的菌液，煮沸裂解法提取DNA。PCR分别扩增rSD株基因缺失的部分，以及△V P2(salmonella)株基因插入和缺失的部位。1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接pMD 19-T载体，鉴定后测序。测序结果显示，两株细菌中，缺失基因的部位没有发生基因回复，插入目的基因的部位也没有发生任何基因的突变、缺失等。表明构建的两株重组菌都是稳定的。
实施例8、细菌的体外增殖试验
三株细菌(SD株，rSD株以及△V P2(salmonella)株)，分别挑取单个克隆接种于15mL试管，于37℃振荡培养12h，分别将上述培养物再按1:1000的量接种于20mL普通LB液体培养基中继续培养过夜。各取100uL菌液倍比稀释至10-8后，分别用10-6、10-7和10-8三个稀释度的菌液各取100uL涂板计数，测定细菌含量，每种菌株重复3次。结果显示，过夜培养的三株细菌，每毫升含菌量没有差异，均是约为8×109CFU，这与生长曲线的测定结果一致。
实施例9、野生菌SD株、弱毒菌rSD株及重组菌△V P2(salmonella)的攻毒试验
三株沙门氏菌在LB平板上37℃静置培养12h，各挑取单个菌落接种于15mL试管，摇菌过夜，分光光度计调节菌液浓度。
1日龄SPF鸡随机分成3大组，三株菌的攻毒组各一个大组。每个大组再分为4个小组，其中3个小组为试验组攻毒，1个小组为对照组，每小组8只。攻毒组每只小鸡各口服0.5mL菌液，分为1011CFU、1010CFU和109CFU三个梯度的剂量进行攻毒。阴性对照组每只鸡口服0.5mL的液体LB。连续观察两周。
试验结果显示，弱毒菌rSD株及重组菌△V P2(salmonella)试验组中，在两周的观察期内，小鸡没有死亡，没有出现拉稀、羽毛被乱、活动异常等不良反应，攻毒组与对照组小鸡的状态无差异；而野生菌SD株试验组中，接种1011CFU、1010CFU和109CFU剂量的小组各死亡7只、4只和3只小鸡，剩余存活的小鸡生长发育不良，拉稀，消瘦等，而对照组没有任何死亡或发病症状。这证明经过改造的弱毒菌rSD株和重组菌△V P2(salmonella)株对SPF鸡是安全的。
实施例10、重组肠炎沙门氏菌△V P2(salmonella)株的雏鸡免疫试验
1日龄SPF鸡随机分为三组，两组免疫组，一组阴性对照组，每组8只。过夜培养的细菌计数后，调整菌液浓度。免疫组中，第一组每只口服0.5mL(109CFU)的重组菌△V P2(salmonella)株，第二组每只口服相同剂量的弱毒沙门氏菌rSD株，对照组口服相同剂量的LB。分别在免疫后一周、二周、三周和四周采血，分离血清。采用琼脂扩散试验测定抗体，检测抗原为原核表达的VP2蛋白。
结果显示，重组菌△V P2(salmonella)株免疫组一周后即可产生抗体，二周后100％的小鸡都能产生抗体，四周后抗体水平逐渐开始下降；弱毒菌rSD株免疫组和LB免疫组均不能产生抗体。
表1：重组菌△V P2(salmonella)株免疫组抗体水平监测
实施例11、免疫攻毒保护试验
免疫方法和剂量同实施例10，两组免疫组和一组对照组均为8只。免疫3周后对鸡滴鼻、点眼接种本室分离的强毒IBDV WF株(105TCID50/0.2mL)。对照组、免疫组隔离饲养，每天观察小鸡的状态，死亡鸡只进行解剖观察。
结果显示，LB和弱毒菌rSD株免疫组在攻毒第三天开始发病，羽毛被乱，采食量减少，不愿走动，排奶油状稀便，LB组在第四天死亡2只，第五天死亡3只，第六天死亡2只；弱毒菌rSD株免疫组在第四天死亡2只，第五天死亡3只，第六天死亡1只。免疫重组菌△V P2(salmonella)株的鸡只表现正常，没有出现拉稀、死亡。解剖法氏囊发现，重组菌△V P2(salmonella)免疫组法氏囊没有肿大、出血现象，而其它两组鸡只法氏囊均出现肿大、出血，有的出现紫葡萄样病变。结果表明，△V P2(salmonella)可以对IBDV的侵染提供很好的保护作用。