一种弯曲假单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体涉及一种弯曲假单胞菌及其应用。
背景技术：
：原油是未经加工的石油，是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种粘稠的黑色或深棕色的液体或固体，一般情况下大多存在于地下或海底，且带有刺激性气味，主要成分是碳氢原子结合形成的链状化合物，其对水体环境具有极大的危害。水环境中维持生命所需的最小溶解氧量约为2mg/L，石油或含油废水排入水体后一方面会漂浮在水面上，阻隔氧气的进入，影响气体交换，另一方面部分靠石油提供碳源繁殖的微生物也会消耗氧气，导致水中溶解氧的缺乏。同时又会使厌氧生物迅速繁殖使水体水质恶化。同时芳香烃类化合物产生的毒性也影响藻类的生长，进而对食物链造成影响。此外，石油中的有毒成分也会影响水生生物的生长繁殖，它会沾附在鱼鳃上使其窒息死亡或影响其卵化，多环芳烃会破坏水生生物的内分泌系统，当存在极低的浓度的多环芳烃时，鱼类都会产生鱼臭味，直接影响了鱼类的正常生存，严重破坏了水环境中水生生物的多样性。目前，对石油污染的水体的修复技术主要有物理修复技术、化学修复技术、光催化修复技术和生物修复技术；生物修复技术是一个具有政策、经济和技术吸引力的处理方法，被认为是最具发展潜力的技术方法，并且逐步发展成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种弯曲假单胞菌，该菌种可用于降解修复原油污染水体。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。提供一种可用于降解原油污染水体的弯曲假单胞菌，将该菌种直接投加入污染水体中，达到较好的降解效果，实现原油污染的治理。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。(一)一种弯曲假单胞菌，已于2016年09月12日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13004；命名为弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。将所述弯曲假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株3在牛肉膏蛋白胨的平板上起初呈淡黄色，随着菌龄的增加，颜色越来越深，最后呈黄色。该菌落特征为针尖大小的淡黄色菌落，呈规则圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，革兰氏染色后，不易着色。菌体细胞呈短杆、棒状，大小为(1-1.5)μm×0.5μm，为革兰氏阴性菌。所述弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示。(二)一种弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在降解原油污染水体中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的弯曲假单胞菌不但易于规模化生产，而且降解效率高，环境适应性强。所提供的弯曲假单胞菌能在大量有机物存在的条件下顺利生长，以原油为碳源，达到较好的降解效果。该菌能在原油浓度达1mL/100mL的原油污染水体中体现出较优的降解效果，实现原油污染水体的修复处理，在原油污染废水的生物修复中展现了良好的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为本发明的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落形态图；图2为本发明的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在显微镜下的的菌体形态图，图中，放大倍数为1000倍；图3为本发明实施例3中I号原油的波长-吸光度曲线图；图中，横坐标为波长，单位为nm，纵坐标为吸光度，单位为1；图4为本发明实施例3中I号原油的标准曲线图；图中，横坐标为浓度，单位为mg/L，纵坐标为吸光度，单位为1。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例1菌株的分离纯化(1)菌株来源本发明提供一种弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3，分离自延长石油集团的七里洞采油场集油站落地原油污染土壤中，土壤的理化性质为：铵态氮15.09ppm，硝态氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，钾含量17.45ppm，有机质含量1.43％，pH为7.65。(2)菌株的分离纯化将10g石油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d。其中，富集液体培养基的成分为：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)，pH7.0。牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选菌落进行平板划线纯化分离。将菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。(3)溶油圈法筛选石油降解菌将上述菌种接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10-15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的石油降解能力；其中，含油无机盐固体培养基的成分为NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)。将初步筛选的石油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。实施例2菌株的鉴定(1)菌株的形态特征如图1所示，将所述弯曲假单胞菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃恒温培养24h后观察菌落形态，菌株3起初呈淡黄色，随着菌龄的增加，颜色越来越深，最后呈黄色。该菌落特征为针尖大小的淡黄色菌落，呈规则圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，革兰氏染色后，不易着色。如图2所示，菌体细胞呈短杆、棒状，大小为(1-1.5)μm×0.5μm，为革兰氏阴性菌。(2)生化特性根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对弯曲假单胞菌进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。表1弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的菌株生理生化鉴定结果指标特性革兰氏染色—葡糖糖+麦芽糖+淀粉水解—M.P(甲基红)试验—硫化氢—硝酸盐还原—氧化酶+吲哚+V.P(乙酰甲基甲醇)试验—接触酶+过氧化氢酶+明胶液化+注：“—”表示反应为阴性；“+”表示反应为阳性(3)菌株的16SrDNA鉴定用DNA提取试剂盒提取弯曲假单胞菌3的基因组DNA，然后进行16SrDNA基因克隆、测序，其16SrDNA测序结果如SEQIDNo.1所示，具体如下：之后在GenBank中进行Blast比对，结果显示，与其序列相似度达到98.56％均为弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)，将其归属为单胞菌类并命名为弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。实施例3弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)3对原油污染水体的降解试验方法：(1)弯曲假单胞菌3菌悬液的制备在无菌条件下，挑取分离纯化获得的石油降解菌，接种于100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床扩大培养培养48h；其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。培养基灭菌条件是：温度为121～126℃，时间为25min。(2)I号原油最大吸收波长的测定石油及其产品在紫外光区有一定的吸收特征，石油组分中带有苯环的芳香族化合物波长一般为250～260nm，而带有共轭双键的化合物波长一般在215～230nm之间，有研究表明，在使用紫外分光光法测定时，255nm左右为原油和重质油的选择范围，225nm左右与为轻质油及炼油厂的油品的选择范围。在100mg/L浓度下，依据获得的波长与吸光度数据，绘制供试I号原油的波长-吸光度曲线如图3所示，其中，I号原油采自延长石油集团七里洞采油场集油站，密度为0.65g/mL。(3)I号原油标准曲线的绘制分别取0、2、2.5、5、6、7mgI号原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此时的浓度分别为0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波长下，以石油醚为参比溶液，测定标准浓度的吸光度，横坐标为浓度(mg/L)，纵坐标为吸光度，绘制I号原油的浓度(mg/L)-吸光度(A)的标准曲线如图4所示。(4)原油降解率的测定取扩大培养的弯曲假单胞菌3菌悬液3mL，接种于100mL含油无机盐液体培养基中，含油无机盐培养基的成分是：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油1.5mL，pH7.0；在30℃，120rpm恒温水浴振荡器中培养7d。培养液用5:1(V/V)的硫酸溶液调节pH值为2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后转入50mL容量瓶并定容。将石油醚萃取液经系列稀释后，以石油醚为参比，通过紫外分光光度法测定其相应的吸光度，根据I号原油的浓度(mg/L)-吸光度的标准曲线，确定石油醚提取液相应样品的浓度，依据浓度计算降解效率。原油降解率的计算方法参考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油浓度；Co-对照原油浓度。按照上述计算公式计算得弯曲假单胞菌3-1对原油污染水体的降解率为71.24％。虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTING<110>长安大学<120>一种弯曲假单胞菌及其应用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1319<212>DNA<213>弯曲假单胞菌（Pseudomonasgeniculata）3<400>1AGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAA60TCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACG120GGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTA180GTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAG240CCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG300ACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA360AAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCC420AAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCG480TTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAG540CCCTGGGCTCA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