致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株及其制备方法和应用与流程

本发明涉及致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株技术领域，尤其涉及一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株及其制备方法和应用。

背景技术：

肠球菌是人类和动物肠道的正常菌群重要成员，但近年来医学临床研究已证实了肠球菌的致病性。在需氧革兰阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要的院内感染致病菌。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌，其中粪肠球菌和屎肠球菌在临床分离率最高。研究表明肠球菌致病除了其耐药性以外，更重要的是其携带众多的毒力因子。目前已发现的毒力因子包括胶原蛋白黏附素(ace)、心内膜炎抗原(efa)、溶血素激活因子(cylA)、明胶酶(gelE)、聚合物质(asa1和asa373)、表面蛋白(esp)、两种新推测的表面蛋白(EF0591和EF3314)等十余种。在全世界范围内虽然投入大量的人力和物力，但肠球菌的致病机制还不清楚。因此毒力因子的详细研究是阐明肠球菌独特致病机制的关键。在兽医临床中，肠球菌感染的研究处于起步阶段，只有一些由肠球菌引起畜禽感染的临床报道，均缺乏深入系统的研究。近年来，新疆北疆部分地区发生以神经症状和败血症为主要特征的羔羊脑炎，引起大批羔羊死亡，从病死羔羊的大脑内分离鉴定到了粪肠球菌，命名为XJ05。通过对XJ05全基因组精细图的测定结果显示该菌共有3412个预测基因，在这些基因除了已经研究和发现的与致病有关的基因外是否还存在其他的致病的基因还不得而知。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05(E.faecalis XJ05)株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)的制备方法，主要目的是提供一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株。

为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株，其保藏编号为CCTCC NO:M2016503。

另一方面，本发明实施例提供了一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株的制备方法，包括如下步骤：

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05培养及基因组DNA提取；

根据EF0591基因序列设计引物，PCR扩增及回收纯化；

将提取的pTX4577质粒用Kpn I与Sal I进行双酶切，用胶回收试剂盒回收pTX4577载体大片段，用T4连接酶与回收的纯化目的片段过夜连接；连接产物按常规方法转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化成功的重组细菌能在LK平板上生长；挑取生长良好的单个菌落，LK液体培养基增菌后，提取质粒用Kpn I与Sal I双酶切，经电泳鉴定正确后，将重组质粒测序，重组质粒命名为pTX4577-△0591；

采用电转化的方法将重组穿梭质粒pTX4577-△0591转化入新鲜制备的E.Faecalis XJ05感受态细菌中，重组后的细菌用含有pTX4577质粒的T7启动子上部分序列(GTAATACGACTCACTATAGGGC)作为上游引物，用插入片段的下游序列(ATTTATAAAAATGGTATTGAA)作为下游引物进行PCR扩增；成功构建致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)。

作为优选，致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05接种在BHI固体培养基上，37℃培养过夜，5000rpm/min离心5min，取沉淀按细菌基因组DNA小量抽提试剂盒说明书操作进行。

作为优选，根据EF0591基因序列设计引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)和EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)，并在引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)引入内切酶Kpn I的酶切位点，在EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)引入内切酶Sal I的酶切位点；以提取的DNA为模板，以EF0591C1和EF0591C2为引物进行PCR扩增；PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性90s，58℃退火90s，72℃延伸1min，共30个循环,最后1个循环结束后72℃延伸5min；反应结束后，电泳进行鉴定，经鉴定正确后按胶回收试剂盒提供的步骤进行片段回收。

制备电转化用E.faecalis XJ05感受态细胞的具体步骤如下；

挑取粪肠球菌单个菌至BHI(脑心浸液肉汤)-蔗糖培养液中37℃轻微振荡培养20小时，BHI和蔗糖的质量比为1:2；

将菌液于分装于离心弃上清，沉淀用电击转化缓冲液重悬，冰浴后4℃，4000g离心15分钟，重复一次；

弃上清，沉淀用管内残留的电击转化缓冲液悬浮，将受体菌分装于eppendorf管中，置于冰浴中立即使用或-80℃冻存备用。

作为优选，电转化的具体步骤如下；

加重组穿梭质粒pTX4577-△0591到E.Faecalis XJ05感受态细胞中，混合均匀将其转移到预先处理过的电转杯中；

调整电转仪为1.5kv，5ms，电击3次，完毕后立刻加入1ml BHI培养基，37℃放置60min；

8000r/min离心5min，弃上清，将剩余细菌吹打后均匀涂布于含卡那霉素的BHI平板上，37℃温箱中培养24h；

待平板上长出单个菌落后，挑取单菌落到BHI液体培养基中(含卡那霉素10μg/mL)，然后37℃条件下摇床中培养24h。

作为优选，构建致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株时PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸l0min。

另一方面，本发明实施例提供了一种致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株在确定表面蛋白EF0591在粪肠球菌XJ05在导致羔羊脑发生中的作用中的应用。

作为优选，所述应用为细胞黏附、侵染能力确定中的应用。

作为优选，所述应用为生物被膜形成能力确定中的应用。

作为优选，所述应用为毒力确定中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明实施例通过构建E.faecalis XJ05-△0591，确定表面蛋白EF0591能增强细菌对Hela细胞黏附、增强对小鼠巨噬细胞RAW264.7的侵染能力以及使小鼠脏器载菌增加，同时能明显增强XJ05株生物膜的形成能力，使小鼠LD50 升高一个数量级，进一步确定了EF0591基因功能，进而阐述表面蛋白EF0591在粪肠球菌XJ05在导致羔羊脑发生中的作用，同时也为动物肠球菌感染机制的研究奠定坚实基础。

保藏说明

本发明实施例的致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株已于2016年9月20日由位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M2016503，分类命名为粪肠球菌XJ05-△0591(Enterococcus faecalis XJ05-△0591)。

附图说明

图1为本发明实施中插入片段扩增结果；

图2为本发明实施中pTX4577-Δ0591酶切结果；

图3为本发明实施例中E.faecalis XJ05-Δ3813突变株鉴定结果；

图4为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在1h和2h黏附HeLa细胞的数量；

图5为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591侵染小鼠巨噬细胞后的细菌数；

图6a至图6e分别为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在小鼠心脏、脑组织、左肾、肝小叶及脾脏的载菌量；

图7为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591形成生物膜的OD595；

图8A至图8H分别为E.Faecalis XJ05和E.Faecalis XJ05-Δ0591在不同时间形成的生物膜；

图9A至图9F分别为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591不同时间的多糖形成量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明实施例中所需原料来源如下：致羔羊脑炎粪肠球菌E.faecalis XJ05由石河子大学动物科技学院预防兽医学实验室从发生羔羊脑炎病羊大脑中分离鉴定得到并提供。Taq plus DNA聚合酶、dNTP Mix购自上海东盛公司；pfu taq酶购自康为公司，琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自诺维森公司；质粒提取试剂盒购自天庚公司；限制性内切酶(KpnI和SalI)购自大连宝生物(TaKaRa)公司；甘氨酸、氨苄青霉素和卡那霉素、溶菌酶购自promega公司；试剂BHI培养基购自BD公司。

致羔羊脑炎粪肠球菌E.Faecalis XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)的制备方法，具体步骤如下：

1)E.faecalis XJ05培养及基因组DNA提取

E.faecalis XJ05接种在BHI固体培养基上，37℃培养过夜；5000rpm/min离心5min，取沉淀按细菌基因组DNA小量抽提试剂盒说明书操作进行。

2)设计引物，EF0591基因插入片段的PCR扩增及回收纯化

根据EF0591基因序列设计引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)和EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)，在引物EF0591C1(GAAAACAAGAAATCCTGAA)引入内切酶Kpn I的酶切位点，在引物EF0591C2(CCGATAATTACTGATGCTG)引入内切酶Sal I的酶切位点，以DNA试剂盒提取的的DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性90s，58℃退火90s，72℃延伸1min，共30个循环，最后1个循环结束后72℃延伸5min。反应结束后，电泳进行鉴定，经鉴定正确后按胶回收试剂盒提供的步骤进行片段回收(见图1，图中，M为DNA分子质量标准；1、2、4、5为插入片段)。

3)pTX4577-△0591的构建

将提取的pTX4577质粒(大理学院吴利先教授提供，也可商业购得)用Kpn I与Sal I进行双酶切，用胶回收试剂盒回收pTX4577载体大片段，用T4连接酶与2中纯化目的片段过夜连接。连接产物按常规方法转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中。转化成功的重组细菌能在LK平板上生长。挑取生长良好的单个菌落，LK液体培养基增菌后，提取质粒用Kpn I与Sal I双酶切，经电泳鉴定正确后，将重组质粒测序。重组质粒命名为pTX4577-△0591(见图2，图 中为DNA Marker，1-3为pTX4577-Δ0591双酶切结果)。

4)电转化用E.faecalis XJ05感受态细胞的制备

(1)挑取粪肠球菌单个菌BHI培养液至l新鲜配制的BHI 2蔗糖培养液中37℃轻微振荡培养20小时；

(2)将菌液于分装于离心弃上清，沉淀用电击转化缓冲液重悬，冰浴后4℃，4000g离心15分钟，重复一次；

(3)弃上清，沉淀用管内残留的电击转化缓冲液(约原菌液的体积的1％)悬浮将受体菌分装于eppendorf管中，置于冰浴中立即使用或-80℃冻存备用。

5)电转化

采用电转化的方法将重组穿梭质粒pTX4577-△0591转化入新鲜制备的E.faecalis XJ05感受态细胞中，具体如下：

(1)加重组穿梭质粒pTX4577-△0591到E.faecalis感受态细胞中，混合均匀将其转移到预先处理过的电转杯中；

(2)调整电转仪为1.5kv，5ms，电击3次，完毕后立刻加入1ml BHI培养基，37℃放置60min；

(3)8000r/min离心5min，弃上清将剩余细菌吹打后均匀涂布于含卡那霉素的BHI平板上，37℃温箱中培养24h；

(4)待平板上长出单个菌落后，挑取单菌落到BHI液体培养基中(含卡那霉素10μg/mL)，然后37℃条件下摇床中培养24h。

6)同源重组株的鉴定

取上述菌液，用含有pTX4577质粒的T7启动子上部分序列(GTAATACGACTCACTATAGGGC)作为上游引物，用插入片段的下游序列(ATTTATAAAAATGGTATTGAA)作为下游引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸l0min(见图3，图中M为DNA分子质量标准；1为突变株PCR产物)。成功构建致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株(E.faecalis XJ05-△0591)。

按照上述实施例进行多次重复操作均能得到本发明实施例的目的菌株(E.faecalis XJ05-△0591)。

本发明实施例中的致羔羊脑炎粪肠球菌E.faecalis XJ05可由石河子大学动物科技学院提供，也可从发生羔羊脑炎病羊大脑中分离得到。

下面通过上述实施例得到的致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株确定表面蛋白EF0591在粪肠球菌XJ05在导致羔羊脑发生中的作用，确定了EF0591基因功能，同时也为动物肠球菌感染机制的研究奠定坚实基础。

细胞黏附、侵染能力

向培养好的HeLa细胞中加入菌悬液孵育一定时间，裂解细胞后进行计数，以野毒株为对照，统计结果见图4，图4为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591在1h和2h黏附HeLa细胞的数量。从图4可以看出，E.faecalis XJ05-△0591对HeLa细胞黏附数量下降，统计学比较差异显著(P＜0.05)。

向培养好的RAW264.7细胞中加入菌悬液，培养一定时间，裂解细胞后进行计数，0小时、3小时和24小时的结果见图5。通过图5可以发现本发明实施例得到的突变株对小鼠RAW264.7细胞的侵染数量明显下降，统计学比较差异显著(P＜0.05)。

将制备好的菌悬液腹腔注射小鼠，在不同时间取小鼠脑组织、心脏、左肾肝小叶和脾脏进行匀浆计数，结果见图6a至图6e。结果显示E.faecalis XJ05-△0591在小鼠肝小叶、心脏、脾脏和肾脏中的载菌量下降，统计学比较差异显著(P＜0.05)；在脑组织中细菌数量有变化，但差异不显著。

通过上述试验可以看出，E.faecalis XJ05-△0591细胞黏附、侵染能力下降，小鼠脏器载菌量升高。

生物被膜形成能力

E.faecalis XJ05-△0591及E.faecalis XJ05亲本株分别在相同条件下培养，结晶紫染色后测其不同时间点的OD595值，结果见图7。结果显示各个时间点的生物膜形成量都明显低于E.faecalis XJ05亲本株，且差异显著(P＜0.05)。

将突变株和野毒株置于放有细胞爬片的六孔板中培养，分别用结晶紫和FITC-ConA及PI染液染色，在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察不同时间点的生物膜。光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察发现E.faecalis XJ05形成的生物膜网状结构较多，形态较致密，膜内细菌数也更多。结果见图8和图9， 其中图8A至图8H分别为E.Faecalis XJ05和E.Faecalis XJ05-Δ0591在不同时间形成的生物膜；图9A至图9F分别为E.faecalis XJ05和E.faecalis XJ05-△0591不同时间的多糖形成量。图8中，图8A至图8D分别为E.Faecalis XJ05在12h、24h、36h和48h形成的生物膜；图8E至图8H分别为E.Faecalis XJ05-Δ0591在12h、24h、36h和48h形成的生物膜。图9中，图9A至图9C分别为E.Faecalis XJ05在12h、24h和72h的多糖形成量；图9D至图9F分别为E.Faecalis XJ05-Δ0591在12h、24h和72h的多糖形成量。

通过上述试验可以看出，E.faecalis XJ05-△0591生物被膜形成能力的下降。

E.faecalis XJ05-△0591LD50的测定

取体重为18-20g的健康鼠36只，随机分为6组,每组6只，其中1-5组按10倍梯度接种E.faecalis XJ05-△0591(2*10¹²-2*10⁹)cfu菌液，腹腔接种，第6组为空白对照组。重复测定一次。根据10d内死亡比例,按Reed-Munch法计算2次试验测定的平均值，LD50为5.47*10¹¹cfu。比原始菌株XJ05的LD50高了一个数量级，即E.faecalis XJ05-△0591毒力下降。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 石河子大学

<120>致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株EF0591基因缺失株及其制备方法和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF0591C1

<400>1

GAAAACAAGA AATCCTGAA 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> EF0591C2

<400>2

CCGATAATTA CTGATGCTG 19