一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌、生产方法及其应用与流程

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技术领域：
本发明涉及一种棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)及其应用，具体涉及一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌、生产方法及其应用。
背景技术：
：剩余污泥与乳制品废水等废物/废水中含有丰富的蛋白质，但由于其分子量过大而不能直接被微生物用于发酵，需要对此类废物/废水进行水解强化，将蛋白质等大分子转化为较易利用的小分子。大量研究表明，碱性条件能够促进水解，溶出更多的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstance,EPS)，并促进EPS等大分子转化为小分子。具有水解发酵功能的厌氧微生物是发酵过程顺利进行的重要保障，而碱性水解发酵会对剩余污泥中原有微生物的发酵能力产生负面影响，从而导致发酵产物回收效率降低。因此，研究在碱性条件下能高效分解蛋白质的菌株具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是碱性水解发酵会对剩余污泥中原有微生物的发酵能力产生负面影响，从而导致发酵产物回收效率降低，目的在于提供一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6CGMCCNo.12827、生产方法及其应用，在碱性条件下，通过所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6处理含蛋白质废物/废水，可以在缺厌氧条件下同时实现蛋白质的有效去除和固体减量，且成本低，效率稳定。本发明通过下述技术方案实现：一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌，为棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6CGMCCNo.12827，所述菌株SPH6的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。一种所述的具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的生产方法，所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6是从污泥中取样，经驯化、分离及纯化制得。优选地，一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的生产方法，具体步骤包括：步骤1，富集：取污泥样本，接种至装有富集培养液的容器中，对容器进行密封处理，形成缺厌氧环境，制成菌种源，然后，取菌种源接种至装有富集培养液的容器中进行培养，依次进行重复转接；步骤2，分离纯化：挑取出所述步骤1转接后的培养液，在筛选培养基上反复划线分离纯化，直至获得单菌落作为初筛菌种；所述富集培养液的组分包括氯化钠、蛋白胨和酵母膏；所述筛选培养基的组分包括：脱脂牛奶、酵母膏、氯化钠、无水硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、琼脂粉和微量元素溶液；所述微量元素溶液的组分包括：硫酸亚铁、五水合硫酸铜、十二水合硫酸铝钾、硼酸、四水合七钼酸铵、无水氯化钙、七水合硫酸锌、七水合硫酸钴和一水合硫酸锰。一种所述的具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的应用，所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6用于在碱性条件下进行蛋白质的分解。所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6的生长细胞、细胞悬浮液等能在碱性条件下(pH＝9～11)分别以蛋白质为氮源，进行蛋白质的分解。一种所述的具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的应用，所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6用于在碱性条件下分解废水或废物中的蛋白质。通过在富含蛋白质的废物或废水中加入棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6，并且进行缺厌氧处理，即可实现废物或废水中蛋白质的分解。优选地，所述的具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的应用，具体步骤包括：步骤1，富集培养所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6；步骤2，将所述步骤1中富集培养的棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6以1～10％的接种量接种至含蛋白质的废物或废水中，所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6利用废物或废水中的有机物质对蛋白质进行分解。优选地，所述步骤2中，将接种有含蛋白质的废物或废水的温度控制为25～45℃。优选地，所述步骤2中，将接种有含蛋白质的废物或废水的pH值调节为8.0～13.0。优选地，所述步骤2中，将接种有含蛋白质的废物或废水进行搅拌处理，所述搅拌处理的转速控制为70～100rpm。一种所述的具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的应用，所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6作为主要活性成分用于制备微生物菌剂。以棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6为主要活性物质的菌剂制备，应用领域包括但不限于本发明所述的含蛋白质的废水/废物的处理。本发明提供的棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6，已于2016年08月08日，在北京保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其简称为CGMCC，保藏编号为No.12827。保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。棒状杆菌的鉴定：所述棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6是从四川省成都市西航港污水处理厂贮泥池取样，经富集、分离、纯化得到的一株革兰氏阳性菌。所述棒状杆菌菌株具有以下特征：(1)所述菌株的16SrRNA基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，在Genbank中的登录号为KP276149，序列长度为1379bp；(2)所述菌株的形态特征：所述棒状杆菌菌株在30～40℃温度条件下，营养琼脂培养基上培养36～72h后，菌落凸起，全缘光滑，通过革兰氏染色后在显微镜下成阳性，菌体呈短杆状，大小为(0.4～1.1)μm×(0.7～2.1)μm，栅状排列，没有芽孢；(3)所述棒状杆菌的部分生理生化特征：接触酶反应结果为阳性，氧化酶、脲酶反应结果为阴性，VP结果呈阳性，能够在8％的盐度条件下生长。将纯种菌株送交中国科学院微生物研究所进行鉴定，测序结果见SEQIDNO:1所示，根据细菌细胞形态、生理生化特征、基因序列等综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》及InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology有关研究论文，最终鉴定菌株为棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)，命名为SPH6。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌、生产方法及其应用，所述的棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)SPH6能够高效的分解蛋白质、处理含蛋白质废物/废水，成本低，效率稳定，并且可以在缺厌氧条件下同时实现蛋白质的有效去除和固体减量。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明菌株SPH6的扫描电镜图；图2为实验组和对照组分解蛋白质的OD600曲线图；图3为实验组和对照组分解蛋白质的COD曲线图；图4为实验组和对照组分解蛋白质的氨氮浓度曲线图；图5为实验组和对照组分解蛋白质的蛋白质浓度曲线图；图6为实验组和对照组处理污泥的COD曲线图；图7为实验组和对照组处理污泥的蛋白质浓度曲线图；图8为不同接种量对菌株SPH6的比降解速率的影响曲线图；图9为不同温度对菌株SPH6的比降解速率的影响曲线图；图10为不同pH值对菌株SPH6的比降解速率的影响曲线图；图11为不同转速对菌株SPH6的比降解速率的影响曲线图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例1一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌的生产方法，具体步骤如下：步骤1，从四川省成都市西航港污水处理厂贮泥池取样，接种到装有100mL富集培养液的250mL锥形瓶中，每1L富集培养液含氯化钠10g、蛋白胨10g、酵母膏5g，富集培养液的pH值为7.0左右，最后用玻璃塞塞好瓶口，并用封口膜封好；步骤2，以步骤1制备菌液为菌种源，取出10mL接种至新鲜的装有100mL富集培养液的锥形瓶中，培养条件相同，每隔5d转接一次；步骤3，所述步骤2中转接3次后，用接种环挑取培养液，在筛选培养基上划线分离。筛选培养基的成分为：每筛选培养基1L含脱脂牛奶10mL、酵母膏3g、氯化钠0.5g、无水硫酸镁0.5g、硫酸铵6.7g、磷酸氢二钾1.2g、磷酸二氢钾0.7g、琼脂粉20g和微量元素溶液1mL；用3mol/L的氢氧化钠调节筛选培养液的pH值为9.0～10.0；所述的微量元素溶液的成分为(g/L)：硫酸亚铁0.01g、五水合硫酸铜0.01g、十二水合硫酸铝钾0.018g、硼酸0.01g、四水合七钼酸铵0.01g、无水氯化钙0.07g、七水合硫酸锌0.18g、七水合硫酸钴0.2g和一水合硫酸锰0.26g，所述微量元素溶液的pH值为5.5；步骤4，从平板上挑选形状不同的菌落反复划线纯化，并进行显微镜观察直至获得单菌落作为初筛菌种。由此分离出一株高效的具有碱性蛋白质分解能力的棒状杆菌，命名为SPH6。对菌株SPH6的扫面电镜图如图1所示，菌体呈短杆状，大小为(0.4～1.1)μm×(0.7～2.1)μm，没有芽孢。实施例2棒状杆菌菌株SPH6对蛋白质分解能力测定：将实施例1制备的菌株SPH6接种于装有120mL富集培养基(已灭菌)的锥形瓶中，于30℃、80rpm、pH值为7.0的条件下培养24h，再于30℃、8rpm、pH值为10.0的条件下培养48h。富集培养基的成分为(g/L)：氯化钠10g、蛋白胨10g和酵母膏5g。培养后，在4000rpm条件下离心15min，弃去上清液后以无菌水重悬三次，以获得富集的棒状杆菌菌株SPH6。将富集后的棒状杆菌菌株SPH6以5％的接种量接种至一个装有250mL以蛋白质作为唯一氮源的测试培养基(已灭菌)的锥形瓶中，控制pH值为9.0～10.0，30℃、80rpm条件下培养，考察菌株SPH6对蛋白质的分解能力，同时设置未接种的培养液作为对照组。蛋白质分解能力测试培养基的成分为(g/L)：牛血清白蛋白0.6g、葡萄糖5g、氯化钠0.5g、无水硫酸镁0.5g、硫酸铵0.6g、磷酸氢二钾1.2g、磷酸二氢钾0.7g和微量元素溶液1mL，用3mol/L的氢氧化钠调节pH值为9.0～10.0。微量元素溶液的成分为(g/L)：硫酸亚铁0.01g、五水合硫酸铜0.01g、十二水合硫酸铝钾0.018g、硼酸0.01g、四水合七钼酸铵0.01g、无水氯化钙0.07g、七水合硫酸锌0.18g、七水合硫酸钴0.2g和一水合硫酸锰0.26g，pH值为5.5。试验过程中，样品经8000rpm和4℃离心10min，每隔1d取上清液测定OD600、溶解性COD(快速消解法)、氨氮(纳氏试剂分光光度法)、蛋白质(Lowry法)含量，并与未接种的培养液的值进行对照。综合比较图2～5中所示对照组(未接种菌株SPH6)与实验组(接种菌株SPH6)的结果，可得，随着菌株SPH6的生长，培养基中的碳源和氮源逐渐被消耗，说明SPH6具有分解蛋白质的能力。实施例3棒状杆菌菌株SPH6处理污泥测定：将实施例2富集培养后的菌株SPH6以10％的接种量接种至污泥中，在温度为37.5℃，pH值为10.5，转速为80rpm的条件下培养3d。设置控制和平行实验。污泥初始性质：pH值为6.36，MLSS为15.49g/L，MLVSS为10.25g/L，SCOD为206mg/L，TCOD为16060mg/L，蛋白质含量为52.3mg/L。以一定时间间隔取样，测定溶解性COD和蛋白质的含量。综合比较图6～7中所示(未接种菌株SPH6)与实验组(接种菌株SPH6)的结果，可得，整个实验过程中，实验组的SCOD溶出量是对照组的2倍，蛋白质溶出量是对照组的1.5倍。说明SPH6能够促进污泥中有机物质(特别是蛋白质)的溶出。棒状杆菌菌株SPH6处理富含蛋白质废水的能力测定：将实施例2富集培养后的棒状杆菌菌株SPH6以1～10％的接种量接种至250mL含有蛋白质的人工配水废水中。在温度为25～45℃，pH值为8.0～13.0，转速为70～100rpm的条件下培养84h。设置控制和平行试验。人工配水废水的成分(g/L)为：牛血清白蛋白0.6g、葡萄糖5g、氯化钠0.5g、无水硫酸镁0.5g、硫酸铵0.6g、磷酸氢二钾1.2g、磷酸二氢钾0.7g和微量元素溶液1mL，用3mol/L的氢氧化钠调节pH值为9.0～10.0。微量元素溶液的成分为(g/L)：硫酸亚铁0.01g、五水合硫酸铜0.01g、十二水合硫酸铝钾0.018g、硼酸0.01g、四水合七钼酸铵0.01g、无水氯化钙0.07g、七水合硫酸锌0.18g、七水合硫酸钴0.2g和一水合硫酸锰0.26g，pH值为5.5。其中以一定时间为间隔取样，测定OD600、溶解性COD、牛血清白蛋白(BSA)以及氨氮的含量用于计算比降解速率(q)。整个试验过程中菌株SPH6的比降解速率(q)最大可达0.0238mg/(mgcells·h)。操作参数接种量、温度、pH值和转速对菌株SPH6处理蛋白质废水的影响因素测定具体实施方案如实施例4～21所示：表1实施例4～21中菌株SPH6处理蛋白质废水的影响因素实施例接种量(％)温度(℃)pH值转速(rpm)45.5％37.588055.5％37.59.28065.5％37.510.58075.5％37.511.78085.5％37.5138095.5％2510.580105.5％32.510.580115.5％37.510.580125.5％4510.580135.5％37.510.570145.5％37.510.580155.5％37.510.590165.5％37.510.510017137.510.580183.237.510.580195.537.510.580207.837.510.580211037.510.580综合考察图8～11的结果，可得，随着接种量、温度、pH值和转速的增加，菌株SPH6的比降解速率均呈现先增大后降低的趋势，并且，在实验条件范围内，比降解速率达到最大的最优条件是接种量为5.5％、温度为37.5℃、pH值为10.5、转速为80rpm。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>四川大学<120>一种具有分解蛋白质性能的棒状杆菌、生产方法及其应用<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1379<212>DNA<213>棒状杆菌（Corynebacteriumsp.）<400>1acatgcagtcgaacggaaaggccccgcttgcggggtactcgagtggcgaacgggtgagta60acacgtgggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccgg120ataggacccctctttagtgtggggggtggaaagttttttcggtgtgggatgagcccgcgg180cctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgag240agggtggacggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtg300gggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggcc360ttcgggttgtaaacctctttcgctagggacgaagcttttgtgacggtacctagataagaa420gcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccgga480attactgggcgtaaagagctcgtaggtggtttgtcgcgtcgtctgtgaaattccggggct540taacttcgggcgtgcaggcgatacgggcaatacttgagtgctgtaggggagactggaatt600cctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtct660ctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccct720ggtagtccatgccgtaaacggtgggcgctaggtgtaggggtcttccacgacttctgtgcc780gtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagg840aattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaaga900accttacctgggcttgacatacaccggaccgggccagagatggtctttcccttgtggctg960gtgtacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccg1020caacgagcgcaacccttgtcttatgttgccagcacgtagtggtggggactcatgagagac1080tgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcc1140agggcttcacacatgctacaatggtcggtacaacgcgttgcgacactgtgaggtggagct1200aatcgctgaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcgg1260agtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacac1320accgcccgtcacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccagtggcccaacccttgtgg1379当前第1页1 2 3