一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

随着我国饲料工业和养殖业的迅速发展，一些常规饲料，尤其是蛋白质饲料严重缺乏。蛋白质饲料资源紧缺已成为当今我国饲料行业的一个突出问题，并将长期成为我国畜牧业及养殖业发展的瓶颈。寻求非常规蛋白质饲料对我国畜牧业的发展起着非常重要的作用。我国是一个产棉大国，年产棉籽量达到1100万吨，年产棉粕量在600万吨以上，占蛋白粕总量的10.7％。棉籽饼粕是棉花作物的重要副产品，是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用己烷浸出油后，所剩余的副产品。棉籽饼中营养丰富，内含蛋白质40％以上(与豆饼接近)，粗纤维11-15％，赖氨酸1.59％，蛋氨酸0.52％，以及较多的维生素B，硫胺素和有机磷等，是畜禽饲料中非常有价值的一种原料。然而，棉籽饼中含有棉酚、环丙稀脂肪酸、单宁等有毒物质，制约了其在畜牧业中的应用，其中最主要的是棉酚。

棉酚(gossypol)俗称棉毒素，占普通棉籽的0.7％-4.8％，是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物，存在棉花的根、茎、叶和籽实的色素腺体中，尤其是籽实棉仁的球状腺体中含量较多。最早是由英国化学家Longmore从棉籽中分离出来的，是一种黄色的色素物质。棉酚纯品是由俄国人Marehiewski于1899年最先从棉籽油的下脚料中分离出来的，棉酚纯品为黄色结晶，能溶于低沸点石油醚和水，熔点181-185℃，分子式为C₃₀H₃₀O₈，分子量518.55。棉籽体内棉酚的存在形式有两种，即结合棉酚和游离棉酚。结合棉酚在机体消化系统中不被吸收，可很快随粪便排出体外，毒性很低。游离棉酚分子结构中的活性基团(醛基和羧基)对动物毒性很大，游离棉酚含量在0.02％时无毒，0.02％-0.05％时轻微毒性，高于0.15％时具有强毒性。棉籽饼粕在饲料中的用量只有40％左右，极大限制了棉粕在畜禽饲料中的应用。长期饲喂动物过多的棉粕饲料，尤其是未将棉粕进行脱毒处理时，棉酚含量会在动物体内蓄积，引发中毒。导致动物出现急性呼吸窘迫临床症状，厌食乏力，甚至死亡等。因此有必要寻求一种有效方式来利用棉籽粕，降低棉酚含量，这对解决我国蛋白资源严重短缺发挥巨大作用。

目前，降解棉酚的方法主要有化学法、物理法和微生物发酵法等，其中微生物发酵法是对棉籽饼粕中棉酚进行降解的一种新方法，该方法不仅能降解棉籽粕中的游离棉酚，而且还可改善棉籽粕粗饲料的营养价值和饲用价值，增加适口性和采食量，提高棉粕的利用率，是目前普遍认为的成本低、效果好、较安全的脱毒方法。但不同微生物菌种对棉酚的降解能力有较大的差异，筛选优良的微生物菌种是影响棉籽饼粕脱毒效果和营养价值的首要步骤。目前报道的用于棉籽饼粕脱毒的菌株种类较少，且主要集中于酵母菌和霉菌。而对于降解棉酚的枯草芽孢杆菌，相关的研究主要有：“高效降解棉酚菌株的筛选鉴定及毒性试验”(中国农学通报，2012，28(12)：112-117)和“棉酚降解菌株的分离及对棉饼的脱毒效果”(江苏农业科学，2012，40(11)：220-224)。上述研究分别从保定某棉花田地和保定某地棉籽榨油厂内的土壤中筛选得到具有降解棉酚作用的枯草芽孢杆菌菌株M-9和菌株M-4，上述菌株M-9和菌株M-4虽然对棉酚具有较高的降解活性，但仍存在一些不足，如：在对棉籽饼粉进行发酵脱毒时，需要额外加入碳源(蔗糖等)，增加了棉酚降解的成本；而且菌种的接种量大(10％)、降解所需时间长(60h以上)。上述不足限制了其在棉酚脱毒中的应用，因此，筛选新的具有快速、高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，即为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016663。

该菌株是从新疆棉籽饼粕中分离得到的，将菌株BLCC1-0039的纯培养物接种于芽孢杆菌培养基平皿，37℃培养20h，形成灰白色菌落，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状。光学显微镜下观察，革兰氏阳性，杆状。

本发明的第二方面，提供一种菌剂，其活性成分为上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039的发酵产物。

本发明还提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：发酵上述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，得到发酵产物。

上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的组成为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、初始pH 7.0，均为质量百分比。

上述制备方法中，发酵的条件为：35-40℃、罐压0.05MPa、搅拌转速220-260rpm、通气量20m³/h，待芽孢率≥90％时，发酵结束。

本发明的第三方面，提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039和/或菌剂在降解游离棉酚中的应用。

进一步的，上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039和/或菌剂在降低棉籽粕的游离棉酚含量中的应用。

本发明还提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039在发酵棉粕生产中性蛋白酶和酸溶蛋白中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次从新疆棉粕中筛选分离得到一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌，该菌株在只含有棉粕的培养基中即可实现对游离棉酚的降解，无需额外添加碳源，大大降低了棉酚降解的成本；而且，采用本发明的枯草芽孢杆菌，在2％的接种量、固体发酵48h的条件下，即可达到97.81％的棉酚降解率，实现了对游离棉酚快速、高效的降解。

(2)本发明的枯草芽孢杆菌在降解棉酚的同时，还能利用棉粕发酵生产中性蛋白酶和酸溶蛋白，中性蛋白酶的酶活性最高可达4101U/g，酸溶蛋白的含量可达26.96％。

附图说明

图1：BLCC1-0039的菌落培养性状；

图2：BLCC1-0039的菌体形态(油镜观察)；

图3：BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕产中性蛋白酶曲线。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明实施例2和实施例5中所提及的“接种量”是指：每100g物料中接种的菌株种子液的体积，mL/100g。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1试验材料

棉粕由新疆泰昆集团提供；醋酸棉酚购自陕西慈缘生物技术有限公司。

1.2培养基

初筛培养基：醋酸棉酚0.10％、氯化钠0.10％、硫酸铵0.50％、七水硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.10％和琼脂2.0％，吐温-80 0.75％；均为质量百分数。

初筛斜面培养基：醋酸棉酚0.10％、氯化钠0.10％、硫酸铵0.50％、七水硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.10％和琼脂2.0％，吐温-80 0.75％；均为质量百分数。

营养肉汤培养基：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.5％，均为质量百分数。pH值7.2-7.4，121℃灭菌15min备用。

复筛液体培养基：醋酸棉酚0.5％、氯化钠0.10％、硫酸铵0.50％、七水硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.10％，吐温-80 0.75％；均为质量百分数。

芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％，均为质量百分数。pH值7.0，121℃灭菌30min备用。

芽孢杆菌平皿培养基：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％，琼脂1.5％，均为质量百分数。pH值7.0，121℃灭菌30min备用。

1.3试验方法

1.3.1分离样品：新疆棉粕。

1.3.2游离棉酚含量的测定：采用高效液相色谱(HPLC)法测定棉粕中游离棉酚含量。

1.3.3棉酚降解菌株的初筛

取1.0g新疆棉粕放入99mL无菌水的三角瓶中制成1×10^-2的样品稀释液，在30℃，180r/min条件下充分振荡30min，摇匀静置。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中进行一系列梯度稀释，制成1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6不同稀释度的稀释液。然后将4个梯度稀释的稀释液涂布于初筛培养基平板上，于30℃恒温箱倒置培养2-3d，挑取平板上具有明显差异的菌落形态，Z形重复划线接种于初筛培养基上，直至纯化出单菌落，然后转接于初筛斜面培养基上，置于4℃冰箱保存备用。

1.3.4棉酚降解菌株的复筛

将初筛得到的菌株于棉酚复筛培养基上进行筛选，将初筛所得到的候选菌株以营养肉汤培养基活化后接种于100mL复筛液体培养液中，在30℃下180r/min摇床培养72h；培养液离心(4℃，5 000r/min)10min，上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，得到除菌的发酵液；高效液相色谱法分别测定发酵前后发酵液中棉酚的含量并记录，根据发酵液中棉酚的降解率，选取降解游离棉酚效果较好的菌株。

1.3.5菌株鉴定

(1)形态学鉴定

挑取降解游离棉酚效果最好的菌株的纯培养物种接于芽孢杆菌培养基平皿，37℃培养20h，观察菌落形态。

(2)分子生物学鉴定

将目的菌株接种于新鲜的芽孢杆菌液体培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：

1492r：5，-ggttaccttgttacgactt-3，；

27f：5，-agagttgatcctggctcag-3，。

PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。测序结果如SEQ ID NO.1所示。

2试验结果

2.1菌株的分离筛选：将从新疆棉粕中分离得到的形态特征不同的单菌落经纯化后并分别接种到以醋酸棉酚为唯一碳源的初筛培养基平板上，共分离得到6株能够在初筛培养基上生长的菌株；然后经过醋酸棉酚复筛培养基的筛选，得到对棉酚耐受性最强的1株候选菌株，编号为BLCC1-0039。

2.2BLCC1-0039菌株的鉴定

2.2.1形态学鉴定

菌株BLCC1-0039在37℃培养20h，形成灰白色菌落，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状(如图1)。光学显微镜下观察，革兰氏阳性，杆状(如图2)。

2.2.2分子生物学鉴定

菌株BLCC1-0039的16S rDNA PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1500bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致，并进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。将测序序列与http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行比对，结果表明，菌株BLCC1-0039与已报道的Bacillus subtilis(EU346662.1、HQ317166.1和KF836543.1等)的序列同源性为99％。鉴定BLCC1-0039菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

上述获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016663。

实施例2：不同芽孢杆菌的降解棉酚的能力和产酶活性比较

1材料与方法

1.1材料

1.1.1发酵基料：棉粕，由新疆泰昆集团有限公司提供。

1.1.2菌种：本发明实施例1筛选得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039。

芽孢杆菌BLCC1-0090、BLCC1-0157、BLCC1-0169，均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心分离保存。

1.2方法

称取一定量的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比为1：0.4(g/mL)，装量100g/瓶，搅拌均匀后，按2％接种量分别接入本实施例“1.1.2”的菌种，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为对照，于37℃培养箱中需氧发酵，分别于发酵24h和48h取样，测定发酵样芽孢杆菌活菌数、中性蛋白酶活性、酸溶蛋白含量及棉酚含量。

上述指标的测定方法如下：

(1)芽孢杆菌活菌数的测定

准确称取发酵新疆棉粕10.0g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至芽孢杆菌平皿培养基中，37℃培养24h，根据菌落数计算样品中芽孢杆菌活菌数，结果用cfu/g发酵料表示。

(2)中性蛋白酶活性的测定

取发酵棉粕1.0g，采用福林-酚试剂法测定样品中中性蛋白酶活性。

中性蛋白酶酶活定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g表示。

(3)酸溶蛋白含量的测定

准确称取2.00g样品于25mL具塞试管中，加入15％三氯乙酸溶液10mL，混合均匀，静止5min。定容至25mL，每隔2min混匀一次，共计时30min。将溶液定量转移，抽滤，取滤液10mL，转入消化管中，加入3g混合催化剂(硫酸钾：无水硫酸铜＝15:1)，与滤液混合均匀，再加入7-8mL浓硫酸，将消化管置于消化炉中420℃消化，待消化液呈透亮的蓝绿色时，继续消化40min，按照凯氏定氮法测定上清液中可溶性蛋白质含量。

酸溶蛋白含量％＝(上清液中可溶性蛋白质含量×25/10)/样品中粗蛋白含量。

(4)棉酚含量的测定

棉酚标准溶液的配制：准确称取棉酚标准品用乙腈溶解得1.23mg/mL的标准品贮备液，贮备液再用乙腈稀释成123μg/mL的标准品工作液。用流动相将标准品工作液逐级稀释得到浓度分别为61.5μg/mL、12.3μg/mL、6.15μg/mL和1.23μg/mL的标准工作液，浓度由低至高进样测定，以峰面积和浓度作图，得到标准曲线回归方程，为：Y＝0.00000545X+0.160525(R²≥0.9999652)，线性范围为1.23-123μg/mL。

待测样品游离棉酚的提取：准确称取待测样品3.00g，加入丙酮30mL，超声提取30min，3000r/min 25℃离心10min，重复提取3次，合并上清液。全部转移至蒸发瓶中，旋转蒸发至干，用乙腈-0.2％磷酸(体积比为85:15)溶液溶解，多次超声清洗转移至25mL容量瓶，定容，过0.22μm滤膜后供HPLC测定。

高效液相色谱(HPLC)法测定棉酚含量：色谱条件为色谱柱Intertsil○R ODS-2(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.2％磷酸(体积比为85:15)溶液，流速1.0mL/min，紫外检测波长235nm，进样量20μL，柱温25℃。

2结果

2.1不同芽孢杆菌发酵对新疆棉粕品质的影响

表1不同芽孢杆菌发酵新疆棉粕对酸溶蛋白、活菌数和中性蛋白酶含量的影响

由表1可知，24h时，在芽孢杆菌活菌数方面各菌株间差异不显著，均在几十亿水平。酸溶蛋白含量以BLCC1-0039最高，其次是BLCC1-0157。中性蛋白酶活性方面以BLCC1-0039最高，酶活性达到4111.40U/g发酵料，其次是BLCC1-0157，均显著高于BLCC1-0090和BLCC1-0169；

48h时，和对照组相比，各菌株均显著提高酸溶蛋白含量，其中BLCC1-0039菌株发酵时最高。芽孢杆菌活菌数各菌株间差异不显著，均能够成功发酵棉粕。中性蛋白酶活性方面以BLCC1-0039最高，酶活性达到3983.24U/g发酵料，其次是BLCC1-0157，两菌株间差异不大。

综上可知，菌株BLCC1-0039发酵新疆棉粕可以显著提高酸溶蛋白和中性蛋白酶活性。

2.2不同芽孢杆菌发酵新疆棉粕对棉酚含量的影响

表2不同芽孢杆菌发酵新疆棉粕对棉酚含量的影响

注：棉酚降解率＝[(对照样品棉酚含量-发酵样棉酚含量)/对照样品棉酚含量]×100％；

由表2可知，发酵24h时以菌株BLCC1-0039棉酚含量最低，降解率达到93.89％，其次是菌株BLCC1-0157；菌株BLCC1-0039发酵新疆棉粕48h时棉酚含量为1.82μg/g，降解率为96.67％，显著高于其余三株菌株发酵时。综合可知，四株芽孢杆菌中以菌株BLCC1-0039发酵新疆棉粕降棉酚效果最好。

实施例3：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039菌粉的制备

1基础培养基

枯草芽孢杆菌BLCC1-0039菌株菌粉的生产采用芽孢杆菌培养基为基础培养基。

2菌种：选用本发明的枯草芽孢杆菌BLCC1-0039；

斜面培养：将枯草芽孢杆菌BLCC1-0039冻干粉菌种接种于芽孢杆菌固体斜面培养基上，37℃培养24h；

一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于100mL芽孢杆菌液体培养基中，在37℃条件下，180rpm/min培养24h，制得一级种子液；

3 50L种子罐发酵

3.1培养基

葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％，均为质量百分数，初始pH 7.0，装量为30L。

3.2灭菌、发酵

灭菌：空消，121℃30min；

实消：夹层加温，121℃30min完成实消。

接种：待培养基温度降至50℃接种，按照1％(体积百分数)接种量接入一级种子液。

发酵：接种后37℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速260rpm培养16h制得二级种子液。

4发酵：500L发酵罐发酵

4.1培养基：同50L种子罐发酵，装量为300L。

4.2灭菌

空消，121℃30min；

实消：夹层加温，121℃30min完成实消。

4.3接种

待培养基温度降至50℃接种，按1％(体积百分数)接种量接入二级种子液。

4.4发酵及发酵过程控制

接种后37℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速220rpm，通气量20m³/h。

发酵期间每2h取样一次，镜检，待芽孢率≥90％时放罐。

5后处理

发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。

实施例4：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039安全性试验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株：本发明实施例3制备的枯草芽孢杆菌BLCC1-0039菌粉。

1.1.2试验动物：昆明系小白鼠，体重20±2g，购自山东鲁抗医药股份有限公司。

1.1.3试验设计：选择体重20±2g健康昆明种小鼠100只，雌雄各半。基础日粮预饲一周后随机分为5组，每组20只，雌雄各10只，分笼喂养，其中一组为对照组，其余四组为试验组，分别灌胃1×10⁸cfu/mL、10×10⁸cfu/mL、100×10⁸cfu/mL和1000×10⁸cfu/mL。

1.1.4给药

给药方式为灌胃，各组小鼠禁食16h后，对照组灌胃生理盐水，其余4个试验组分别灌胃生理盐水稀释好的菌粉，按照0.4mL/20g体重的受试样品量进行灌胃给样，连续灌胃两天，每次灌胃后密切观察2小时，2h后常规饮食，连续观察14天，每天定时观察记录。

1.1.5观察指标

①肉眼观察详细记录被毛和皮肤、眼睛和粘膜，呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体活动和行为等改变。特别注意是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状。应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间。

②小鼠体重于试验开始时、7d和14d分别对每组雌雄小鼠进行称重，比较其体重情况。

③病理学检查14d时对各组小鼠取5只进行尸检，观察脏器器官病变，对观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。

2试验结果

2.1各组小白鼠的生长和死亡情况

表3 BLCC1-0039菌粉对各组雌性小鼠生长和死亡情况的影响

由表3可知，在14d观察期内，雌性小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况。解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。

表4 BLCC1-0039菌粉对各组雄性小鼠生长和死亡情况的影响

由表4可知，在14d观察期内，雄性小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况。解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。

2.2各组小白鼠的器官指数

表5 BLCC1-0039菌粉对各组小鼠器官指数的影响

由表5可知，BLCC1-0039菌粉对各试验组小白鼠的脾脏指数和肝体比没有显著性影响。

综上，本发明制备的BLCC1-0039菌粉使用安全，无毒副作用。

实施例5：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039在降低棉籽粕的游离棉酚含量以及发酵棉粕生产中性蛋白酶和酸溶蛋白中的应用

5.1不同接种量和发酵时间对游离棉酚降解的影响

从BLCC1-0039斜面上挑取一环接种至装有50mL芽孢杆菌液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、190r/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用；

配料：称取一定量的粉碎后可以过50目的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比为1:0.4(g:mL)，装量100g/瓶，分别按2％、4％、8％和10％接种量分别接入培养好的BLCC1-0039种子液，以不接种任何菌株的空白料为对照，每个接种量设3个平行，均置于37℃培养箱进行需氧固体发酵，分别于发酵0h、12h、24h、36h、48h和60h取样，测定棉酚含量，结果如表6所示。

表6接种量和发酵时间对棉酚含量的影响(μg/g)

由表6可知，2％接种量时，随发酵时间的延长棉酚含量呈下降趋势，发酵12h、24h、36h、48h和60h时棉酚降解率分别为59.18％、94.67％、96.15％、97.70％和98.30％，其中发酵24h棉酚降解率即可达到90％以上，能够实现对棉酚的快速降解。

5.2BLCC1-0039菌株发酵新疆棉粕对游离棉酚含量、中性蛋白酶活性和酸溶蛋白含量的影响

从BLCC1-0039斜面上挑取一环接种至装有50mL芽孢杆菌液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、190r/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用；

配料：称取一定量的粉碎后可以过50目的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比为1:0.4(g:mL)，装量100g/瓶，设3个平行，分别按2％接种量分别接入培养好的BLCC1-0039种子液，以不接种任何菌株的空白料为对照，均置于37℃培养箱进行需氧固体发酵，分别于发酵0h、6h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h和48h取样，测定中性蛋白酶活性、棉酚含量和酸溶蛋白含量。中性蛋白酶结果如图3所示，由图3可知，BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕至12h，可以测得中性蛋白酶活，但活性低于1000U/g，之后随发酵时间的延长中性蛋白酶活性增加，24h中性蛋白酶活性达到3900U/g，之后中性蛋白酶活性维持一个相对稳定水平，36h中性蛋白酶活性达到最高，为4101U/g。

BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕对棉酚含量的影响结果见表7。

表7 BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕对棉酚含量的影响(μg/g)

由表7可知，菌株BLCC1-0039固体发酵新疆棉粕12h时，棉酚降解率达到58.83％，且随着时间延长，棉酚降解率呈现增加趋势，发酵24h时棉酚含量仅为2.87μg/g，降解率达到94.63％，随发酵时间延长棉酚含量呈现下降趋势，直至48h棉酚含量仅为1.17μg/g，棉酚降解率为97.81％。说明菌株BLCC1-0039发酵新疆棉粕后能够在短时间内大大降低了游离棉酚的含量。

BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕对酸溶蛋白含量的影响结果见表8。

表8 BLCC1-0039菌株固体发酵新疆棉粕对酸溶蛋白含量的影响(％)

由表8可知，酸溶蛋白含量随发酵时间延长呈现增加趋势，48h时酸溶蛋白最高，为26.96％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司

<120> 一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢杆菌及其应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> 菌株BLCC1-0039

<400> 1

agaatgcggg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttatggagc cagccgccga 1440

aggtgacaga ttt 1453