用于靶向递送基于核酸的疗法的组合物的制作方法

相关申请

本申请要求2015年7月24日提交的标题为“compositionfortargeteddeliveryofnucleicacidbasedtherapeutics”的美国临时专利申请序列第62/196,634号的权益和优先权，其整体公开内容在此通过引用并入。

本发明涉及基因活化的原纤维组合物和使用单一系统中的基因疗法和组织工程(tissueengineering)的组合治疗临床状况的方法。本文描述了能够编码至少一种感兴趣的多肽的基因活化的原纤维组合物以及用于其设计、制备、制造和/或配制的方法、工艺、装置。本发明还提供了一种治疗受试者中的疾病、紊乱和/或状况的方法，所述方法通过将基因活化的原纤维组合物施用至所述受试者来增加至少一种感兴趣的多肽的水平。

背景

将核酸载体(vector)(例如，hgf-mrna-和hgf-pdna)掺入纳米级的具有受控制的构造(organization)的支架中具有增强细胞与细胞外环境之间相互作用的巨大潜力，因为将基因材料递送至特定位点以空间和时间方式将信号和指令(cues)引入至细胞以用于组织生长和维持。因此，治疗性载体可以增强组织构建体的掺入以及其在周围组织中的生长和同化。此外，用于递送载体的纳米原纤维(nanofibrillar)基质特别地胶原基质不仅可以用作靶向运载体和载体的络合剂(atargetedcarrierandvectorcomplexingagent)，而且还可以用作用于组织工程应用的结构支架。单一系统中的基因疗法和组织工程的该组合能够实现用于再生医学的新的更全面的方法。使用基因活化的基质的局部基因递送系统整合了这两种策略，充当具有治疗性基因表达的体内局部生物反应器并且提供结构模板以填补病变缺陷用于细胞粘附、增殖和细胞外基质合成。

几乎二十年以来，已经付出较多努力来开发基于核酸的疗法。然而，这种基于核酸的疗法的临床应用被低效率、脱靶效应、毒性和低效递送阻碍。通过本文提出的靶向递送系统和高转染效率的修饰的mrna(mmrna)载体，这些限制被克服。增加所提出的组合物的转染效率的另外的因素可以是递送基质促进载体渗透到细胞内的能力。因此，排列的(aligned)原纤维基底能够实现固态转染。

核酸是带负电荷的分子，使得它们通常不会穿过细胞膜[akhtar,等,adv.drugdeliveryrev.2007,59,(2-3),164-182]。裸露的核酸与阴离子型的细胞膜表面之间的静电排斥可以防止胞吞[akhtar,等,adv.drugdeliveryrev.2007,59,(2-3),164-182]。因此，需要选择性递送系统以进行核酸的有效运输以及其在靶向的细胞内的释放。最常用的基因递送系统可以分为生物(病毒)和非生物(非病毒)系统。

生物运载体(carrier)和病毒具有并且提供核酸转移的效率，但难以制备并且是有毒的[thomas,等,nat.rev.genet.2003,4,(5),346-358]。这些限制意味着开发用于核酸递送的非生物系统仍然是重中之重。非病毒递送系统包括具有正电荷的肽、脂质(脂质体)、树状聚合物和线性或支链聚合物[duncan,等,adv.polym.sci.2006,192,(polymertherapeuticsi),1-8]，所述具有正电荷的肽、脂质(脂质体)、树状聚合物和线性或支链聚合物通过静电相互作用与带负电荷的核酸相互作用[el-aneed,j.controlledrelease2004,94,(1),1-14]。在非病毒递送系统中，树状聚合物具有以下的优势：具有良好定义的结构、尺寸、稳定性和生物相容性[duncan,等,adv.drugdeliveryrev.2005,57,(15),2215-2237]。然而，树状聚合物的多步骤合成以及在合成的每一步骤的费力的纯化以及因此地高制备成本限制了它们的应用。合成生物医学聚合物的现有技术方法依赖于逐步生长缩合聚合方案(astep-growthcondensationpolymerizationprotocol)，其可能产生具有高多分散性、不受控制的功能性、拓扑学和组成的不良定义的聚合物，这对于核酸递送是不理想的。

因此，对容易地产生并且可以用于将核酸有效递送至靶向的生物位置以治疗多种临床状况的核酸递送系统存在需求。使用胶原原纤维运载体/支架的固态转染是一种可能的解决方案，其中带正电荷的胶原原纤维补偿掺入在支架表面上的带负电荷的核酸。

发明概述

本发明的实施方案提供了基因活化的原纤维组合物和使用单一系统中的基因疗法和组织工程的组合治疗临床状况的方法。本文描述了能够编码至少一种感兴趣的多肽的基因活化的原纤维组合物以及用于其设计、制备、制造和/或配制的方法、工艺、装置。

本发明的实施方案还提供了一种治疗受试者中的疾病、紊乱和/或状况的方法，所述方法通过将基因活化的原纤维组合物施用至所述受试者来增加至少一种感兴趣的多肽的水平。

附图简述

并入本文且构成本说明书的一部分的附图阐述了本发明，并且与本说明书一起进一步用于解释本发明的原理并且使相关领域的技术人员能够制备并使用本发明。本发明的实施方案仅以示例性的方式参考附图被描述，在附图中：

图1是显示包封在排列的胶原原纤维的多个超薄层之间的hgf质粒的图；

图2是阐述形成具有位于层之间的核酸的多层构建体的步骤的图；

图3是阐述形成具有位于层之间的核酸的多层构建体的可选步骤的图；

图4a和4b分别是装载有hgf载体的支架的设计和应用的示意性表示；

图5是使用对准系统将载体装载到支架中的方法的示意性图示；

图6a-6e是阐述线状胶原支架(也被称为“biobridge”)和特征的照片；

图7a是线状胶原支架的横截面图像，并且图7b是显示两个水平的支架交联结果的图；

图8a-8c示出了线状胶原支架的多种毛细作用特征；

图9a和9b阐述了不同交联值的biobridge的毛细作用；

图10是示出处于湿态中的biobridge支架的力-位移曲线的图；

图11a和11b是阐述了biobridge通过胶原酶降解的图；

图12a和12b是示出pdna从具有不同水平edc交联的线状胶原支架的释放和从冻干非交联线状胶原支架的释放的图；

图13a和13b是阐述多种实施方案的转染效率的显示图；

图14是阐述细胞迁移测定的准备步骤的示意性图；

图15是阐述根据实施方案的biobridge或其他支架用于在癌症手术包括淋巴结切除术和辐照之后预防乳腺癌相关的淋巴水肿的用途的示意性图；

图16a和16b是通过在排列的胶原支架表面的hgf-mrna和在培养组织塑料表面的hgf-mrna转染的人类成纤维细胞的照片；

图17a和17b示出了微运载体的横截面和具有可注射微运载体的注射器。

详述

最近，已经探索了基于mrna的技术用于药理学和再生使用的应用。基于mrna的疗法的现有和提出的应用包括癌症免疫疗法、其中限速或缺陷内源蛋白被补充或替代的转录物替代疗法、再生医学和基因组编辑。与mrna在再生医学中的有前景的应用一致，已经证明利用基于mrna的技术将体细胞(例如成纤维细胞)成功重编程为胚胎样细胞(ipsc)。此外，mrna的更稳定、可翻译和更少免疫原性的类似物，修饰的mrna(mmrna)，已经被开发出来，并且被证明具有被翻译为功能蛋白的能力，表明mmrna在递送治疗性蛋白方面的深远的临床潜力。mrna超过dna的用于基因转移和表达的优势包括高转染效率、对核定位或转录不存在任何要求、以及递送序列的基因组整合几乎可忽略的可能性。

支架介导的基因递送为基因转移提供了重要的优势，包括治疗性基因的局部递送，所述治疗性基因主要由在植入位点周围的细胞获取；以及从支架的逐渐的载体释放，这允许持续的基因递送，其中释放速率受支架材料的降解速率控制。支架的另一个优势是其在保护载体方面的作用，因为当被掺入到基质中时，所述载体不太可能在体内被清除或降解。支架还可以充当原位细胞募集的生物活性剂和再生平台，提供模板结构，在其上可以开始组织形成。可植入聚合物支架定义了包括支架及紧靠其的周围环境的三维(3d)空间，吸引细胞迁移并附着至支架，并且将载体递送至位于该空间内的细胞。用支架释放的载体转染的细胞在递送位点分泌局部地起作用并且系统地分布的蛋白产物。在这种情况下，靶向的递送至少部分地是可逆的，因为如果期望的话，可以将具有浸渍的载体的支架从该位点取出。还可以以期望的顺序递送多个载体，因为支架可以被构造为多层构建体。另外，支架可以在表面上仅具有特定细胞的配体，使得仅一种类型的细胞例如活化的t细胞或特定的癌细胞可以与支架结合。因此，仅选择的细胞类型可以经历转染。

支架设计中的主要原则是模拟天然环境，支架中使用的天然材料提供在降解期间的较低的体内毒性、植入时较低的免疫应答和适当的(细胞特异性)细胞粘附。胶原，一种ecm的必要组分和身体内主要的结构蛋白，是组织工程中最广泛使用的天然材料，并且被用于伤口敷料、缝线、止血剂、皮肤替代物(replacement)、骨替代物(substitute)和血管再生中。由于端肽是胶原中的主要抗原区域，因此胶原优先以其具有去除了端肽区域的较少免疫原性的形式被使用。该类型的胶原(缺端胶原(atelocollagen))可以用于该申请中。基于胶原的材料展示出以从几个小时至几个月的规模的质粒dna的释放。例如，由掺入到肌内施用的胶原微丸(minipellet)中的dna引起的系统效应比直接dna注射显著更长。已经在骨、软骨和神经再生；伤口愈合和肌肉修复的模型中采用非病毒或病毒dna的基于胶原的递送。所有这些应用同样是本文的目标。

与2-d转染相比，载体遍及3d空间的分布以及三维构建体上的转染可以增加并延长基因表达水平。此外，纳米纤维基底的各向异性改进了通过慢病毒转导的重编程的效率，这与这些基底上的伸长的细胞形态学相关[downing,等,naturematerials2,1154-1162(2013)]。因此，诱导细胞沿着原纤维排列的具有其各向异性3d架构的胶原纳米原纤维支架是用于基因递送的良好候选物。许多出版物证明，纳米原纤维胶原支架在体外支持内皮细胞形态学和增殖并在体内增加细胞存活。纳米原纤维支架可以充当pdna和mrna及其他生物活性分子的“贮库(depot)”，就像天然的ecm储存和释放生长因子一样。另外，支架提供了临时基质，例如用于血管再生。此外，最近的数据证明，纳米原纤维支架降低纤维化相关的基因表达。通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-1-碳二亚胺盐酸盐(edc)的胶原零长度交联的已建立的策略可以用于支架制造。edc方法提供了通过改变edc交联程度来控制支架的酶促降解的手段，而不需要向支架掺入任何添加剂并且不改变支架的机械强度。

定义。在本文，我们将使用可互换的“原纤维(fibril)”和“纤维(fiber)”。我们假定术语“核酸”包括“核酸类似物”。装置的实例包括：软组织修复装置、假体心脏瓣膜、起搏器、脉冲发生器、心脏除颤器、动静脉分流器和支架(stents)。医学装置的其他实例，包括螺钉、锚、板、钉(staple)、钉(tack)、关节和类似装置，例如被用于矫形外科手术。这些可植入医学装置由各种各样的材料制成，包括，例如，金属、塑料和多种聚合物材料。其他矫形装置包括植入物，诸如软组织植入物，用于髋、肩、肘和膝盖替代和手术或颅颌面重建的植入物，以及植入物涂覆物以及用于关节镜和腹腔镜程序中的装置。医学装置的其他实例包括眼部装置，诸如植入物，包括眼内透镜和青光眼分流器。其他装置还包括胃肠植入物。在以下非限制性实施例中提供了本发明的多种实施方案的进一步详细的描述。

实施例1.用于交联的两个edc/snhs浓度(l.0×:1mg/mledc和1.1mg/mlsnhs，以及0.2×:0.2mg/mledc和0.22mg/mlsnhs)可以用于排列的纳米原纤维胶原支架的交联。l.0×和0.2×交联的支架显示相似的抗拉强度，但显著不同的降解速率。已经成功地测试了交联的支架的生物相容性(例如，biobridge胶原基质，510k装置k151083)和在后肢缺血模型中刺激动脉生成(nakayamakh,hongg,leejc,patelj,edwardsb,zaitsevats,paukshtomv,daih,cookejp,wooyj,huangnf.aligned-braidednanofibrillarscaffoldwithendothelialcellsenhancesarteriogenesis.acsnano.9(7):6900-8.2015)。人类ec显示相比非模式化的支架从排列的支架的更大程度的长出(outgrowth)。整联蛋白α1部分地负责在排列的纳米原纤维支架上增强的细胞长出，因为该作用被整联蛋白α1抑制所消除。为了测试ec-接种的排列的纳米原纤维支架在改进体内新生血管形成中的功效，将小鼠的缺血肢体用以下来处理：ec-接种的排列的纳米原纤维支架；ec-接种的非模式化的支架；在盐水中的ec；单独的排列的纳米原纤维支架；或无处理。在14天之后，激光多普勒血液光谱显示，与在盐水中的ec或无处理相比，当用单独的支架及用ec-接种的排列的纳米原纤维支架处理时显著改进的血液灌注恢复。在其中用源自诱导性多能干细胞(ipsc-ec)的人类ec接种的支架处理缺血肢体的实验中，系统地注射的单壁碳纳米管荧光团被用于在28天之后使用近红外ii(nir-ii,1000-1700nm)成像可视化并定量小动脉。nir-ii成像显示，相比盐水或细胞组，ipsc-ec-接种的排列的支架组显示显著更高的微血管密度。这些数据表明，当与单独的细胞或单独的支架相比时，包括在排列的纳米原纤维支架上递送的ec的“双重”处理改进了血液灌注和动脉生成，并且在设计治疗性细胞递送策略中具有重要意义。因此，用纳米原纤维排列的支架处理缺血肢体显示血液灌注中的改进，并且使用mmrna-hgf将进一步增强该作用。

实施例2.提出了一种用于增强hgf质粒dna在治疗和/或预防血管生成依赖性症状中的转染效率的方法。hgf质粒将被包封在排列的胶原原纤维的多个超薄层之间，参见图1。每一层的厚度和降解可以分别通过沉积(层厚度)和交联来控制。通过精确的夹缝式模具涂覆器(slot-diecoater)从50mg/ml浓缩的猪(porcine)缺端胶原i型溶液产生的排列的胶原层的典型厚度可以被控制在100nm至2微米的范围内。通过sono-tek精密喷涂系统将质粒(hgfmrna)的悬浮液或溶液均匀地喷涂在胶原层上。多层的真空附着引起自发的胶原与胶原交联并且因此包封质粒。胶原层的厚度(从纳米至微米范围)及其在层压之前的交联将控制胶原降解的速率，并且因此控制质粒或rna的释放。形成具有位于层之间的核酸的多层构建体的其他方式被呈现于图2和图3中。

原纤维材料，例如，胶原，可以与低浓度的uv敏感的多臂peg混合，然后通过蒸发浓缩以达到液晶状态。我们发现：

1.通常地，peg且特别地多臂peg不影响液晶状态。因此，所有不同的模式，特别地皮肤状、排列的、排列的-编织的(参见美国专利：8,492,332b2、8,227,574b2、8,513,382b2)，可以由液晶材料制成，其包括原纤维胶原；

2.在材料沉积和模式形成之后，膜可以在干燥状态下通过uv(例如，250nm，取决于多臂peg中的反应性基团)交联。

如果胶原/peg被沉积在聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)基底上，则该层将被交联至pet基底。

如果在uv交联期间使用uv掩模(mask)，则未交联的水溶性胶原可以通过水冲洗(其中ph在2-6范围内)去除。

可以重复沉积和交联步骤以形成模式化的多层堆叠。可以将不同的核酸制剂沉积在层之间，然后进行交联。

可以将胶原/peg涂覆在不被uv交联的基底，例如，玻璃基底上。然后每一层可以在交联之后被剥离。可选地，胶原/peg层可以在交联之前被剥离以形成多层堆叠，参见图2和图3。在本文，q-玻璃是对于250nmuv辐射透明的石英玻璃板。“coll+0.4peg”意指与按重量计0.4％peg混合的分子胶原。“在基底上的0.25edc”意指当沉积的膜附着至基底(例如，pet基底)时特定的edc交联。在edc交联之后，胶原可以从基底上剥离(edc不引起胶原与pet之间的交联)。“m-peg”意指可以在干燥状态通过uv交联的多臂peg。

在酸性ph不改变分子缺端胶原的液晶状态的另外的材料是edc/nhs。在胶原/edc/nhs沉积以形成纳米织物(nanoweave)结构之后，膜可以通过改变ph(例如，在氨蒸气中)被交联。

排列的纳米原纤维胶原支架将诱导细胞的伸长和迁移，所述细胞在其植入后将填充支架。以该方式，我们能够模拟天然生理环境。另外，我们将合适的核酸递送至细胞以增强期望的结果，例如，再生。这就是经过由胶原交联确定的延长时间段(从4-6周至几个月)的局部持续细胞表达的方法。

实施例3.装载有hgf载体的支架的设计图4a和应用图4b的示意图。在排列的胶原的存在下，存在于或被吸引至缺血区域的成纤维细胞、局部内皮细胞和内皮前体细胞可以附着至支架，产生hgf，并且刺激毛细血管的形成。

将载体装载到支架中的方法使用图5中示意性示出的对准系统。将线状多孔支架插入到透明管中并且通过夹钳固定在那里。将第二较小的透明管与第一透明管对准，并且将注射器插入到第二管中。以该方式，可以利用支架的多孔性和毛细作用将载体溶液精确地递送到支架中。将染料(例如，亚甲蓝)添加至载体溶液简化了装载方法。冻干进一步稳定了核酸至支架表面的粘附。将单糖或多糖添加到载体溶液中在低温(低于-20℃)和高真空(少于50mpa)的冻干期间保护核酸。所提出的方法适用于在无菌条件和手术室环境两者中使用。

实施例4.我们根据以下美国专利中公开的方法制造了由原纤维胶原制成的biobridge支架：8,492,332b2、8,227,574b2、8,513,382b2。

biobridge的表征。在该实施例中使用的线状胶原支架(biobridge)的基本特征示于图6中。biobridge由折叠的超薄胶原带状物(ribbon)形成，使得形成带状物的所有薄的胶原原纤维沿着支架方向排列。

biobridge支架的孔隙度。通过高分辨率反射显微镜拍摄biobridge支架的横截面图像。典型的图像呈现于图7a中。通过获得黑色像素与总横截面面积之间的比率，通过标准位图筛选器分析图像的孔隙度值。两个水平的支架交联:l.0×和0.2×的结果呈现于图7b中。平均孔隙度为约85％，具有低的标准偏差。

biobridge支架的毛细作用。测量以水平位置附着至双层透明胶带的13-mm长的biobridge部分的支架毛细作用，参见图8a和图8b。注射器和25g针用于将约0.1ml绿色食品着色染料装载到biobridge的每一端。取2分钟和4分钟的时间点，分析每一个部分的染料已经行进了多远。在绿色通道中测量绿色染料的毛细传播，基线为干燥胶原的初始白色。对于每一个实验，染料传播的距离与biobridge部分的总距离的比率呈现于图9中。结果表明biobridge的高毛细作用，具有低的标准偏差。0.2×交联的biobridge比l.0×交联的biobridge具有轻微更高的毛细作用，这与孔隙度测量一致。无压的染料传播耗费约4分钟通过13mm的biobridge部分。

biobridge装置具有高孔隙度(约85％)，适用于药物装载。孔相互连通以允许沿着装置的毛细流动。biobridge的多孔结构(图6)提供了可以用于将hgf质粒(hgf-pdna)装载到支架中的毛细特性。

为了优化pdna装载，我们使用直径为100nm和1μm的荧光球体作为模型。实际的质粒尺寸处于这两个直径之间的某处。以0.1mg/ml的浓度制备荧光纳米球体和微米球体的溶液，并通过毛细流动将球体装载到支架中。两种类型的颗粒的装载时间是相同的。通过荧光显微镜leitzdmirb观察到颗粒的存在(图8c)。

biobridge的机械特性。biobridge支架由1微米(1×10^-6m)厚的膜制成，纵向折叠形成线状结构。所有biobridge支架的横截面积等于2.54×10^-8m²。应力根据以下公式计算：应力(mpa)＝10-6×力(n)/面积(m²)。biobridge的机械测量在湿态通过校准的抗拉测试仪(tensiletester)进行。典型的力-位移曲线呈现于图10中。因此，典型的抗拉强度高于100gf，并且因此最大应力多于30mpa。

biobridge的酶促降解。已经通过使用茚三酮反应性测量可溶性蛋白来测定胶原支架在胶原酶中的降解[starcherb.aninhydrin-basedassaytoquantitatethetotalproteincontentoftissuesamples.analbiochem292:pp.125-129.(2001)]。对于每一个样品，将1-cm支架区段放置于微量离心管中。将样品在200μl包含100u/ml或50u/ml细菌胶原酶(clostridiumhistolyticum,calbiochem)的0.1mtris-碱、0.25mcac12(ph7.4)中在37℃孵育。孵育之后，将样品以15,000rcf离心10min，并且使上清液与2％茚三酮试剂(sigma)在沸水中反应10min。然后在分光光度计(spectramax,moleculardevices,sunnyvale,ca)中在570nm处测量光密度(od)，并且通过从获得的光密度减去背景值(仅胶原酶对照)计算相对od。最终数据被表示为相对od/mg材料。

我们的数据显示，biobridgel.0×与肠线缝线相比被胶原酶降解得更快(图11a)，具体参数指示它在植入后3个月被降解。我们的数据还表明，biobridge降解随用于交联的edc浓度而变化(图11b)，并且biobridge0.2×与1.0×相比被胶原酶降解得更快。

制备pdna补充的支架。为了评价通过毛细力装载到支架中的dna的量，我们首先使用以上描述的0.2×多孔支架以通过将该支架在pcmv6-ac-gfp质粒的溶液中孵育来掺入质粒。将支架样品(5-mm长)在40μl等分试样的质粒溶液(1μg/μl至0.025μg/μl的浓度，反应物中的总dna量为4μg至40μg)中在室温孵育1h，然后将pdna溶液去除并且用500μl交联溶液(pbs中的edc，1mg/ml和snhs，1.1mg/ml，ph6.0)替代，持续30min。将pdna-支架在pbs中冲洗4次，持续30min。

将反应物中的pdna量从4μg增加至40μg未显著增加保留在支架中的dna的量。我们的试验数据(pilotdata)显示，在支架与4μgdna孵育之后，大量dna(多达208ng)被保留在支架中，其构成被引入到反应物中的dna量的5％。尽管保留的dna量确实随着反应混合物中dna含量的增加而增加，保留在支架中的dna的量并未按比例地增加。在添加至反应物的40μgdna中，295ng(0.7％)被保留。我们的支架能够保留多达566ng/mm³支架体积，这高于基于文献中报道的类似方法的数据当被归一化为mm³支架体积时由胶原支架保留的pdna的量(70ng)。因此，我们继续在反应物中使用4μg总pdna量。

支架的pdna保留和释放能力通过如我们使用的以下装载后程序的修改被进一步探索：(1)在反应物中减少浓度的edc/snhs，和(2)冻干pdna装载的支架而不是edc交联。将所有支架样品(5-mm长)在40μl等分试样的质粒溶液(0.025μg/μl的浓度)中在室温孵育1h，然后去除dna溶液。将其用500μl的交联溶液(pbs中的edc，1mg/ml和snhs，1.1mg/ml(l.0×)；或edc，0.2mg/ml和snhs，0.22mg/ml(0.2×)，ph6.0)替代，持续30min。将pdna支架在pbs中冲洗4次，持续30min。可选地，pdna装载之后，将支架样品冷冻并且冻干(lyo)。

pdna掺入到支架中的评价。为了评价附着至支架的dna的量，将如以上描述制备的pdna支架在54℃在50μl等分试样的蛋白酶k溶液(roche)中经历消化，持续18h。消化样品中的dna含量遵循制造商的说明使用picogreen试剂(quant-it^tmdsdna测定试剂盒,lifetechnologies,ny)进行评价。荧光强度通过荧光板读取器analysthd&at(ljlbiosystemsinc.)测量。我们已经发现edc浓度的降低并未实质改变保留在支架中的pdna的量，然而冻干增加了pdna保留(图12a)。

pdna释放分析。为了评价pdna从支架的释放，将pdna支架在40ulte缓冲液等分试样中孵育，并且以特定间隔收集等分试样并且用新鲜的等分试样替代。如以上描述的使用picogreen试剂评价收集的样品中的dna含量。如图12b中示出的，pdna支架稳定地释放少量dna到te缓冲液中直至第11天。直至孵育的第11天释放的dna总量对于“edc1.0”支架为5.9ng或掺入的pdna(61ng)的9.7％，对于“edc0.2”支架为5.8ng或掺入的pdna(70ng)的8.3％，以及对于“lyo”支架为11.5ng或掺入到支架中的pdna(112ng)的10.3％。基于这些数据，我们得出结论，冻干可以用于装载支架，用于转染实验。

质粒转染效率的优化。为了确定pdna装载混合物的最佳组成，我们首先鉴定了针对pcmv6-ac-gfp质粒的最佳转染剂。我们使用(1)turbofectin8.0(origene)，遵循质粒制造商的标准方案；以及(2)由质粒制造商推荐的可选的转染剂(viromer)。在最初测试的两种形式的viromer(red和yellow)中，viromerred导致更高的转染效率，并且被用于使用由制造商(lipocalyx)建议的标准和直接络合转染方案两者进一步优化。使人类包皮成纤维细胞在96孔组织培养板上在补充有10％fbs的dmem中生长以达到60％-80％汇合。将质粒dna稀释到无抗生素的无血清培养基中，轻轻混合，与转染剂合并，在室温孵育15-45分钟，并且添加至细胞培养物中。将细胞维持在37℃在5％co2培养箱中，然后测试从24-48h开始的过表达效应。gfp基因表达通过荧光显微术(leicadmirb)定期监测。使用turbofectin的转染，甚至在几次优化步骤的迭代之后，也仅导致低比例的表达gfp的细胞。用viromerred的标准方案的转染产生更高数目的表达gfp的细胞，并且用直接络合方案的转染导致最高数目的表达gfp的细胞。

gfpmrna.我们认为mrna可能是最终产物中pdna载体的有效替代物，因为它提供了有效的转染，因此在我们的研究中探索了使用gfpmrna(rnacore,houstonmethodistresearchinstitute,tx)用于转染的可行性，并且继续评价它与pdna相比的转染效率。

pdna和mrna转染效率的评价。(1)pdna转染：我们使用在我们的优化实验中显示出最高转染效率的直接络合方案与转染试剂viromerred(以上描述的)继续用pcmv6-ac-gfp进行转染研究。使人类包皮成纤维细胞在96孔组织培养板上在补充有10％fbs的dmem中生长以达到60％-80％汇合。将质粒dna稀释到无抗生素的无血清培养基中，轻轻混合，与转染剂合并，并且在室温孵育15-45分钟。(2)mrna转染：我们使用由制造商推荐的转染试剂lipofectaminernaimax(invitrogen,目录号13778-075)和viromedred(遵循类似于关于pdna转染描述的直接络合方案的直接络合方案)。

lipofectamine转染方案。我们遵循由制造商建议的方案的基本步骤，具有以下调整：从6孔板格式调整到96孔格式。将lipofectamine(1.6μl或2.4μl)稀释在omem(12μl或17.6μl)中，并且添加至mrna(1.3μl或2μl，50ng/μl)(稀释在omem(12μl或18.4μl)中)。将lipofectamine/mrna混合物在室温孵育15min(在此时，用omem替代生长培养基)，然后逐滴添加至每一个孔中，3.4μl或5μl/孔，这导致每孔引入8.3ng或12.5ngmrna。孵育4h之后，去除omem并且用dmem/10％fbs替代。

viromerred直接络合方案。制备15ng/ul的mrna工作溶液(50ul)。将viromer储备溶液(0.3ul)放置于管中，并且将mrna溶液直接添加至具有viromer的管中，轻轻混合，并且在室温孵育15min。在这一时间点，更新生长培养基。将转染混合物应用于细胞，逐滴添加至每孔，6.7ul/孔，这导致每孔引入100ngmrna。进一步的优化包括通过使用5ng/ul工作溶液或添加用15ng/ul工作溶液制备的2ul转染混合物来降低反应物中的mrna量。将细胞维持在37℃在5％co2培养箱中，并且gfp基因表达通过荧光显微术(leicadmirb)定期监测。

转染效率评价。在转染后24h时，gfp表达通过活培养物的荧光显微术评价。在拍摄代表性图像之后，将细胞用2％多聚甲醛固定并且用hoechst(1:10000)染色以用于细胞核定量。对于每一个孔，拍摄3-4张gfp和细胞核匹配的图像。细胞核的数目/图像使用amscope软件来计算，并且gfp阳性细胞的数目使用叠加到图像上的网格手动计数。转染效率被计算为(gfp阳性细胞数目/细胞核的数目)×100。gfp表达的水平通过在荧光板读取器中测量gfp荧光强度来进一步评价。

mrna与pdna之间转染效率的比较显示，对于使用的条件，mrna在转染成纤维细胞方面更有效(图13a)。此外，我们扩展了mrna转染的条件范围(图13b)，并且证明viromerred转染剂与lipofectamine相比对于所有使用的变化条件均提供更高的转染效率。应该注意的是，由于我们基于制造商的推荐进行我们的初始方案，引入到孔中的mrna的量在viromer和lipofectamine方案之间不同。

3d细胞迁移测定。已经开发了细胞迁移测定以测试生长因子释放对细胞迁移的作用。该测定的示意图呈现于图14中。

应用.以上方法可以用于制备用于处理淋巴水肿、青光眼、瘢痕疙瘩和其他疤痕、角膜矫正、牙科紊乱的工具，所述处理通过用于靶向基因递送的纳米模式化的基因活化的支架来调节局部细胞反应包括细胞分化。可以指导淋巴管形成以重新连接被破坏的淋巴系统的biobridge或其他支架的使用呈现于图15中。它可以被防止癌细胞发展的基因材料，例如，sirna补充。该方法可以预防淋巴水肿的形成，并且可以在癌症手术期间或之后立即使用。

实施例5.用hgfmrna转染并用a-hhgf(红色)和hoechst(蓝色)染色的人类成纤维细胞呈现于图16中，其中a-将细胞接种在组织培养塑料上；b-将细胞接种在排列的胶原支架上(在塑料上排列的卷曲涂覆物)。在tertmrna装载的支架上的人类t细胞的体外转染可以显著增加其增殖潜力，并且因此增加t细胞疗法的总体功效。

实施例6.用于细胞/mrna递送的微运载体平台。具有直径从50微米至300微米的可注射纳米织物微颗粒可以通过由单个biobridge支架切割来制成。例如，此类微颗粒可以由实施例4中描述的排列的线状胶原支架制成。在该情况下，微颗粒将具有排列的胶原结构(参见图17)，具有大的表面积、多腔隙的孔隙度和经调整的降解。在biobridge形成之前，使用毛细作用或被引入到初始胶原溶液中，这些微颗粒可以被核酸活化。此类微运载体通过至少容积式注射器是可注射的并且能够维持核酸(例如，mrna或pdna)的递送。特别地，可以将这些微运载体注射到淋巴结中并且通过释放编码在预防癌细胞扩散和增殖方面起重要作用的因子的核酸载体来靶向特定的癌细胞。

已经参考特定配置描述了示例性实施方案。前述特定实施方案和实施例的描述仅出于说明和描述的目的被呈现，并且尽管已经通过前述实施例中的某些实施例阐述了本发明，但其不应被解释为受限于此。